Summary
来自诱导多能干细胞(iPSC-EP)的内皮祖子有可能彻底改变心血管疾病的治疗,并能够创建更忠实的心血管疾病模型。本文介绍了iPSC-EP在三维(3D)胶原蛋白微环境中的封装,并对这些细胞的血管生成电位进行了定量分析。
Abstract
诱导多能干细胞(iPSCs)是一种患者特异性增殖细胞源,可分化成任何体细胞类型。双能内皮祖细胞(EP),可以分化成组装成熟、功能性血管所必需的细胞类型,从胚胎和诱导多能干细胞中提取。然而,这些细胞在三维环境中尚未得到严格评估,其血管生成潜力的定量测量仍然难以实现。在这里,首先概述了通过荧光激活细胞分类生成和分离 iPSC-EP,然后介绍了 iPSC-EP 在胶原蛋白水凝胶中的封装和培养。这种细胞外基质(ECM)模拟微环境鼓励强健的血管反应;血管网络形成后一个星期的文化。使用开源软件量化此血管反应的计算管道的创建进行了划定。此管道专为保留毛细管丛的 3D 体系结构而设计,以以最少的用户输入可靠地识别分支数、分支点和总网络长度。
Introduction
人类脐带静脉内皮细胞(HUVECs)和其他原发内皮细胞类型已经使用了20年,以模型血管发芽和在体外发育1。这种血管平台有望阐明心血管疾病的分子和组织级机制,并可能为原始血管网络2、3的发展提供生理见解。尽管血管建模领域取得了显著进展,但能够定量建模和评估生理血管发育的"金本位"测定仍然遥遥无期。大多数已公布的协议没有充分重述血管利基,以鼓励成熟、功能性血管的形成,或者没有方法在三维上定量比较评估细胞类型的血管生成电位(3D)。
许多目前的血管模型是有限的,他们的能力,模仿生理血管利基。最常用的体外平台之一是胶状蛋白混合物的管形成测定。简单地说,HUVECs被播种为单细胞,在薄薄的凝胶层上,由从肉瘤细胞外基质(ECM)中采集的蛋白质组成;在一至两天内,HUVECs自组装成原始管4。然而,这个过程发生在双维(2D)和内皮细胞(ECs)用于这个测定不形成封闭的,空心流明,从而限制了这些研究的生理意义。最近,EC和支持细胞(例如,中生干细胞(MSCs)和围细胞)在模拟原生ECM纤维结构的3D微环境中共同培养,如胶原蛋白或纤维蛋白水凝胶5。为了模拟这种微环境下的血管发育,通常采用涂有EC的聚合物珠子。加入其他细胞分泌的外源生长因子和/或生长因子,这些细胞间质嵌入在水凝胶中,可以诱导ECs,涂覆聚合物珠子,发芽并形成单流明;然后可以计算芽和容器的数量和直径。然而,这些芽是奇异的,不形成一个封闭的,连接的网络,如在生理条件下看到,因此更让人想起肿瘤血管模型。微流体装置也被用来模拟血管利基,并促进在EC载水凝胶7,8的血管的形成。通常,血管生成生长因子梯度应用于循环细胞培养基,以诱导EC迁移和发芽。构成发达容器流明的ECs对通过微流体装置的流体流动引起的剪切应力敏感;因此,这些微流体装置捕获静态模型中不可访问的关键生理参数。但是,这些设备需要昂贵的微制造能力。
最重要的是,所有三种血管模型(2D、3D、微流体)绝大多数使用初级EC以及主要支持细胞类型。原发性细胞不能发展成有效的心血管治疗,因为细胞在植入后会产生免疫反应;此外,HUVEC 和类似的原发性细胞类型不是患者特异性的,并且不会捕获遗传倾向或预先存在的健康状况(如糖尿病)患者发生的血管异常。诱导多能干细胞(iPSCs)在过去十年中已经作为一种患者特异性增殖细胞源出现,可以分化成人体中的所有体细胞9。特别是,已经发布了协议,概述了iPSC衍生的内皮祖子(iPSC-EP)10、11的生成和隔离。iPSC-EP 是双能的,因此可以进一步分化为内皮细胞和平滑肌细胞/细胞,成熟、功能性血管的构建基块。只有一项研究令人信服地详细说明了iPSC-EP在3D微环境中的初级毛细管丛的发育12;尽管本研究对于了解iPSC-EP总成和天然和合成水凝胶的分化至关重要,但它没有定量地比较所产生血管的网络拓扑。另一项最近的研究使用聚合物珠模型比较了HUVECs和iPSC衍生的EC5的发芽。因此,显然需要进一步阐明调节iPSC-EP血管生成的物理和化学信号机制,并确定这些细胞是否适合缺血治疗和心血管疾病建 模。
在过去十年中,开发了不同的开源计算管道和骨架化算法,以量化和比较血管网络长度和连接性。例如,Charwat等人开发了一种基于Photoshop的管道,从纤维蛋白基质13、14中脂肪衍生干细胞和生长EC的共同培养中提取出一个过滤的、双光化的血管网络图像。也许最广泛使用的拓扑比较工具是AngioTool,一个由国家癌症研究所15在线发布的程序;尽管该计划被广泛采用和充分记录保真度,该计划仅限于分析两维的容器状结构和其他程序,包括AngioSys和Wimasis,共享相同的维数限制16。开发了强大的软件套件,如 Imaris、Lucis 和变形,以分析工程微血管的网络拓扑;但是,对于大多数学术实验室来说,这些套件成本高昂,并且限制了对源代码的访问,这可能会妨碍最终用户根据特定应用程序自定义算法的能力。3D切片机,一个开源磁共振成像/计算机断层扫描包,包含一个血管建模工具包,可以有效地分析3D血管网络的拓扑17;但是,分析依赖于用户手动放置网络的端点,这在分析大型数据集时可能会变得单调乏味,并且可能受用户潜意识偏见的影响。在本手稿中,详细介绍了一个可量化 3D 血管网络的计算管道。为了克服上述限制,此开源计算管道利用 ImageJ 预处理获取的共聚焦图像,将 3D 卷加载到骨架分析器中。骨架分析仪采用平行中轴变薄算法,最初由Kerschnitzki等人开发,用于分析骨细胞网络18的长度和连通性;该算法可有效地描述工程微血管的长度和连通性。
总之,该协议概述了在3D微环境中微血管网络的创建,并提供了一个开源和用户偏差自由计算管道,以随时比较iPSC-EP的血管电位。
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Protocol
1. 培养介质和涂层解决方案的准备
- 要制备体外内丁涂层溶液,在Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中稀释体外奈丁1:100。
注意:一旦稀释,不建议存储此解决方案供将来使用。 - 从制造商处收到无苯酚红、生长因子减少的胶状蛋白混合物(见材料表)后,在4°C的冰上解冻,直到混合物透明且流畅。将混合物放在冰上,放在层流罩中,将混合物75 μL移液器放入1.8 mL微离心管中,并立即在-20°C冷冻。这些等分可以存储长达一年。
注意:这种胶状蛋白质混合物在室温下保持时变得非常粘稠,并在较高温度下凝固。保持此解决方案冷。 - 要准备这种混合物进行涂层,在冰上解冻 75 μL 等分,用 6 mL 的冰冷 Dulbeco 的改性鹰介质:营养混合物 F-12 (DMEM/F12) 稀释。这个准备好的体积足以涂覆12孔板。
- 在超纯水中制备抗坏血酸镁-2-磷酸盐(一种白色冻干粉)的100mg/mL库存溶液,在10 mL玻璃闪烁小瓶中加入500毫克粉末至5mL水中。用搅拌棒搅拌,直到溶液完全透明(这可能需要一个小时)。此溶液可在-20°C下储存长达一年。
- 在15mL锥形离心管中溶解1.9928 ml二甲基亚硫酸盐(DMSO)中的10mg冷冻粉,在37°C珠(或水)浴中加热,直到溶液透明。创建CHIR99021(CHIR)10 mM库存。与1.8 mL微离心管中的无二分,在-20°C下储存长达一年。
- 在15mL锥形离心管中溶解3.1225mL二甲基亚硫酸盐(DMSO)中的10mg-27632(ROCK抑制剂(ROCKi),在37°C珠(或水)浴中加热,直到溶液透明。与1.8 mL微离心管中的无二分,在-20°C下储存长达一年。
- 要准备基本 8 (E8) 介质,解冻冷冻补充剂,加入 500 mL 瓶的基础培养基,并过滤灭菌。此溶液可在 4°C 下存储长达两周。
注意:在37°C时不要加热这种介质是非常重要的,因为介质配方中的蛋白质可能会因长时间使用而降解。相反,在使用前,将这种介质保持在室温下15至30分钟。 - 要制备分拣缓冲液,在DPBS中加入1.33 mL的7.5%牛血清白蛋白(BSA),在DPBS的48.5 mL中加入200μL的0.5 m二胺四乙酸(EDTA),以创建0.5%BSA和2mM EDTA的最终溶液。
- 要制备 LaSR Basal,请添加 300 μL 的 100 mg/mL 抗坏血酸镁-2 磷酸盐和 5 mL 的谷氨酸MAX 到 500 mL 的高级 DMEM/F12。此溶液可在 4°C 下存储长达一个月。
- 准备内皮细胞生长介质-2(EGM-2),解冻补充剂,并加入500 mL瓶基底培养基。此溶液可在 4°C 下存储长达一个月。
- 要制备阻断缓冲液,将500毫克冻干牛血清白蛋白(BSA)和50μL乳化试剂(见材料表)加入48 mL的DPBS。在37°C下孵育至少15分钟,以确保BSA不会结块,随后与溶液分离。
2. iPSC 的解冻、维护和传递
- 在解冻冷冻的iPSC小瓶之前,用1mL的体外内蛋白溶液涂覆6孔板的单孔(如步骤1.1所述)。在室温下孵育1小时。在将 E8 介质添加到板中之前,不要让此涂层风干。
- 要解冻 iPSC,从液氮储存容器中取出一个冷冻的 iPSC 小瓶,并在 37°C 下解冻,直到残留一小小团冰。小心(滴滴)将解冻小瓶的含量转移到含有8 mL的冷冷DMEM/F12的15 mL锥形离心管中。用1 mL的冰冷的DMEM/F12清洗解冻小瓶,以尽量减少细胞损失。在300 x g下离心5分钟。
- 在等待离心机时,将体外内分他进液吸出,并将1mL的E8介质(如步骤1.6中所述)加入井中。然后,从离心锥管中取出DMEM/F12上清液,并在1mL的E8介质中重新悬浮颗粒。将细胞转移到新涂层的板中,确保搅拌悬浮液,以防止菌落在播种时结块。
- 解冻后通常有大量的细胞死亡。第二天早上,取出介质,用新鲜的 E8 介质更换。
注:即使在最佳条件下,iPSC 也往往从低温保存中恢复不良。建议冷冻一个接近汇成的6孔,以便将来播种到单6孔。细胞碎片在细胞恢复期间的前2-3天正常。 - 每天更换 E8 培养基,直到细胞准备好通过(70%-80% 汇合)。
- 要通过,首先准备体外镀膜涂层井(如步骤 2.1 中所述)。
- 一旦体外内膜涂层井准备就绪(约1小时),从井中吸出E8介质,通过并洗涤两次,用1mL的DPBS。在37°C下孵育1 mL 0.5 mM EDTA5~7分钟。孵育时,从新涂布的井中取出体外内丁溶液,用1~2 mL的E8介质代替。
- 从要通过的井中取出 EDTA 溶液,用 1 mL 的 E8 轻轻清洗一次或两次,分离菌落。将 75-200 μL 的细胞悬浮液转移到新涂层的含 E8 的孔中,搅拌板以确保均匀覆盖,并立即放入培养箱中。
注意:iPSC分离的孵育时间是细胞系依赖;建议该协议的用户在充分扩展接收/生成的 iPSC 线路时测试一系列时间。75 μL细胞悬浮液一般在通道之间4天内产生;150 μL 或更多会导致通道之间的 2~3 天。
3. 生成 iPSC 衍生的内皮祖子 (图 1)。
- 在维护 iPSC 时,请确保菌落被很好地压缩,并且培养中的分化细胞数量很少。如果菌落开始相互接触,细胞很可能过于汇入,需要立即通过。
- 当 iPSC 为 70%-80% 的混通时,用胶状蛋白混合物涂覆 24 孔板(如 1.2/1.3 中所述)。将这种混合物移液250 μL放入每个井中,并在室温下保持1小时。
- 在上述1小时孵育期间,分别从冰箱和冰柜中取出E8介质和Y-27632。一旦E8介质和Y-27632达到室温,在15mL圆锥形离心管中加入13μL的10μM Y-27632至13 mLE8,制备E8+ROCKi。
- 从 iPSC 井中取出 E8 介质,用 1 mL DPBS 洗涤两次,然后在 37°C 下用 0.5 mM EDTA 孵育 5-7 分钟。孵育期后,取出EDTA并迅速将细胞剪切成单细胞悬浮液,带有1mL的E8+ROCKi培养基。
- 用血细胞计计算细胞。对于可能包含数百万个iPSC的悬浮液,将20μL的细胞悬浮液添加到180μL的试盘蓝色中。确定单细胞悬浮液中的总细胞数。
- 将 0.432 x 106到 1.296 x 106细胞 (104到 3 x 104细胞/cm2)转移到剩余的 E8 + ROCKi 培养基。从新涂覆的 12 孔板中取出胶状混合物涂层,并在每个孔中加入 500 μL 的细胞悬浮液,确保细胞分布良好,不会形成小团块。
注:此密度范围最适合CD34阳性细胞的分化;但是,这些种子密度与细胞系相关,可能需要由该协议的用户进行优化。 - 培养24小时后,用500μL的新鲜E8介质更换介质。在相同的条件下,再孵育24小时。
- 拆下 E8 介质,并更换带有 6-12 μM 的 CHIR99021 的 LaSR Basal。此时间点定义为 D0 的微分。培养24小时后,用相同的细胞培养基替换。
注: 如前所述,添加到此介质的 CHIR99021 数量取决于所使用的 iPSC 线路。请测试一系列CHIR99021浓度,以确保最佳结果。 - 使用CHIR99021孵育48小时后,用1mL的LaSR Basal替换。
- 每天用 2 mL 的 LaSR Basal 更换介质,再延长 2-3 天。此时(D5的分化),这些细胞中有很大一部分会表达CD34,并可定性为内皮祖子。此协议的示意图在图 1中具有代表性的结果进行了概述,并由首次发布此方法 11、19 的调查人员进行了完整描述。
注:这些内皮祖子可以沿着内皮沿系进一步区分(35%~99%)或平滑的肌肉血统(1%~65%)。差别化效率因ECM涂层的类型和微分20期间使用的细胞培养培养基而异。
4. 内皮祖子FACS
- 在分离 D5/D6 分化细胞之前,请按照步骤 1.8 中所述准备分选缓冲液并保持在冰上。
- 在37°C下用每孔250μL的细胞分离溶液孵育分化细胞(见材料表)10分钟。
- 使用P1000移液器尖端将细胞分离到细胞分离溶液中的单个细胞悬浮液中。将细胞分离溶液混合物在15 mL锥形离心管中,在300 x g下将离心机5分钟。
- 取出上清液,在 200 μL 的冷分拣缓冲液中重新悬浮(如步骤 1.7 所述)。将5μL的浓缩CD34-PE抗体加入细胞分拣缓冲液悬浮液中,并在4°C下孵育10分钟。
- 在 5 mL 的冷冷分拣缓冲器中重新悬浮。在放置分拣机之前,通过带有 40 μm 盖的电池过滤器过滤此悬浮液。
- 在适当的荧光通道上,对10,000个未标有荧光抗体的细胞进行分类。以高荧光强度,不包含这10,000个细胞中的任何一个区域(图1D)。这将作为负控制。
- 运行含有带有荧光溶液标记的 iPS-EP 的样本,然后开始排序。CD34在这些内皮祖体中高度表达,很容易与主要人群分离。分拣后,将溶液转移到15mL锥形离心管和离心机5分钟,300 x g。拆下上清液。
注:如果溶液位于大于微离心管的管中(例如,许多 FACs 协议中常用的 5 mL 聚苯乙烯管),则将分拣缓冲液中的分拣细胞颗粒重新悬浮,并将此溶液转移到微离心管中。在 300 x g下离心 5 分钟,并去除上清液。- 可选:如果需要进一步的 iPSC-EP 表征,可同时添加其他初级抗体(例如 CD31-APC)与 CD34-PE。确保将不同荧光通道之间的串扰最小化。
5. iPSC-EP含胶原蛋白水凝胶的封装和长期培养
- 通过在 1.8 mL 微离心机中加入 40 μL 的 10x 培养基 199 至 400 μL 的内皮生长培养基 (EGM-2),辅以 10 μM Y-27632,制备播种介质,并将管放在冰上。
注意:虽然不鼓励使用抗生素用于干细胞培养和分化细胞的维护,但建议在分拣后使用 Pen/Strep 进行给灭,因为很难保证分拣环境中的不育性(这更多如果分拣机在许多实验室之间共享)势在必行)。 - 从细胞悬浮液中取出所有上清液,加入200μL的EGM-2,并辅以10μM Y-27632。将细胞悬浮液转移到播种介质,并大力混合。
- 将 350 μL 胶原蛋白添加到步骤 5.2 中制备的溶液中,并混合均匀。溶液将变成淡黄色。
注:胶原蛋白的最终浓度对毛细管丛的形成有显著影响。该协议假定胶原蛋白以10mg/mL提供,水凝胶的最终浓度为3.5mg/mL。调整这些体积,以达到其最终的胶原蛋白浓度;建议将最终胶原蛋白浓度从2毫克/mL限制在4毫克/mL。 - 在 5.3 中制备的溶液中加入 5 μL 的 1M NaOH,并混合良好,避免引入气泡。解决方案将变成明亮的粉红色。
- 将中和胶原细胞溶液制备5.4至96孔超低附件U-底部细胞培养板的单独孔中。在37°C孵育30分钟。在添加介质之前,使用明场显微镜检查样品,检查细胞是否均匀分布。
- 通过在微离心管中加入1μL的每种库存溶液,制备1 mL的培养基,包括EGM-2,辅以10μM Y-27632和50纳克/mL血管内皮生长因子(VEGF)。混合良好后,将这种细胞培养基的移液器100μL移液器输送到含细胞水凝胶中。将板转移到 37°C 进行长期培养。
- 每天更换培养培养基,根据研究目标增加额外的血管生成生长因子或小分子抑制剂。为了最佳地去除介质,倾斜板并使用 P100 尖端轻轻吸气介质,而不会干扰水凝胶。
6. 基于EP的血管网络的修复、免疫染色和可视化
- 经过一周的培养后,在48孔板中加入250μL的4%甲醛(PFA)溶液。填补尽可能多的水井,因为有水凝胶。从水凝胶 (PFA) 中取出介质,并使用细尖钳子将水凝胶转移到含有水凝胶的井中。在室温下孵育10分钟,用PBS快速清洗,取出PFA。
- 在室温下加入非离子表面活性剂的250 μL(见材料表)5分钟,进行渗透。用250 μL的PBS洗涤两次,辅以300 mM甘氨酸。在每个洗涤步骤的室温下孵育5分钟,以确保去除多余的洗涤剂。将水凝胶浸入250μL的阻隔缓冲液中30分钟。
- 在4°C的阻断缓冲液中一夜,用所需的原抗体孵育。例如,如果免疫染色与phalloidin和VE-卡他林,分别稀释1:40和1:200,在阻塞缓冲液。
- 第二天,取出原抗体溶液,用DPBS中的0.5%乳化试剂洗涤两次。用铝箔盖住,在室温下用物种特异性二级抗体(例如,PBS 中的 1:200 Alexa Fluor 488)孵育 2 小时。
- 取出二级抗体溶液,用DPBS中的0.5%乳化试剂洗涤两次。在每个洗涤步骤的室温下孵育5分钟,以确保去除游离的荧光。
- 要可视化细胞核,在PBS中稀释4'、6-二酰胺-2-苯林多尔(DAPI)1:10000,并添加到样品中。
- 在室温下孵育2分钟,用PBS洗涤两次。在每个洗涤步骤的室温下孵育5分钟,以确保去除游离的荧光。
- 将样品转移到血管生成型+-Slide或玻璃底部培养皿,使用细尖钳子。确保水凝胶下方没有气泡。
- 通过获取从样品底部延伸到顶部的 z 堆栈,在共聚焦显微镜上进行图像。确保探测器未饱和,且可用最小放大倍率正在使用中(需要使用大型视场)。
注:对于将来的处理,请确保以最小的压缩(例如 .czi)保存 z 堆栈。
7. 利用计算管道分析和比较血管网络拓扑
- 检查每个 z 堆栈,以确保切片仅包含容器。在 ImageJ 中打开 z 堆栈,通过单击"图像 >调整>亮度/对比度"来增强对比度。船只边界现已明确划定,背景水平最小化。通常,z 尺寸与 x/y 尺寸不匹配。要纠正这种情况,请单击"图像> 调整>大小"并更改 z 切片数,以便每个切片之间的距离等效于 x/y 中的一个像素。 如果此步骤未正确执行,则最终 3D 卷将显示为压缩。
注意:EC会向凝胶的边缘迁移,形成小的鹅卵石菌落。虽然这些对于估计水凝胶的边界很有用,但它们会干扰最终图像分析,应删除。
注:ImageJ是由美国国家卫生研究院和光学和计算仪器实验室共同开发的基于Java的开源图像分析软件。建议下载斐济,这是简单的ImageJ捆绑有用的插件(https://fiji.sc/)。 - 在 ImageJ 中,在 3 维单击"过程>滤镜>高斯模糊 3D"中模糊图像,然后将所有 3 个维度中的西格玛值设置为 2.0(此值可能需要由最终用户调整)。
- 在 ImageJ 中,单击"处理>二进制>制作二进制",然后选择适当的阈值算法。李等人开发的交叉熵阈值算法能有效地将血管与背景21分离出来。计算每个图像的阈值,并将背景设置为"默认"。
- 在 ImageJ 中,通过单击"处理>噪声>消除异常值"来消除杂散噪声并填充流明中的"孔"。
注:删除"明亮"异常值将填充连接容器中的小孔;去除"暗"异常值将删除死细胞。拆卸半径的大小会因容器的放大倍数和尺寸而异。对于以 512 x 512 像素的宽场目标获取的图像,半径通常范围为 4-6 像素。 - 在继续执行步骤 7.6 之前,处理所有原始文件(例如 czi 扩展名)并转换为 .tif 文件。为了协助此处理,本手稿上附加了 ImageJ 脚本"Binarize 和 Filter.ijm"。
- 将处理过的 .tif 文件与"BatchProcessSkeleton.m"文件保存在同一文件夹中,可在手稿中下载。这个脚本,由作者开发,调用由菲利普·科尔曼斯伯格22发布的函数,并执行一些额外的文件操作。
- 下载并解压缩与两个主要功能"Skel2Graph3D"(https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d)和"Skeleton3D"(https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d)相关的所有文件。将所有函数保存到与打开的处理 z 堆栈相同的文件夹中。
- 打开一个多范式数值计算环境(参见材料表),并导航到保存上述所有文件的文件夹。
- 通过在命令窗口中键入BatchProcessSkeleton或打开脚本并点击编辑器中的"运行"按钮(面向右的绿色箭头)来运行"BatchProcessSkeleton.m"。
注: 要使用单个命令分析大型数据集,请确保第 6 行dir函数内的字符串包含星号(例如,"*.tif")。否则,如果需要分析单个文件,请将星号替换为文件名。 - 此脚本执行的时间长度将因可用的计算能力而有很大差异。建议在具有至少 8 GB RAM 的计算机上执行此分析,以便用户可以在脚本运行时访问其他程序。
注意:虽然不是绝对必要的,但绘制原始共聚焦采集(灰色)并与骨架矩阵(红色)叠加,有助于评估骨架化算法的性能。此外,读者还可以创建由科尔曼斯伯格等人实现的节点图,以评估网络分析的准确性。创建这两个图形虽然有用,但会大大增加脚本的运行时,并需要额外的内存;如果用户只需要最终拓扑分析,并且不想可视化数据集,只需注释掉 44 到 61 行(骨架图)和行 104 到 143(拓扑图)。 - 完成后,在工作区中可见的数据矩阵现在包含已处理的数据。双击"数据"并在变量编辑器中打开此单元格。
- 请注意,此矩阵将包含从左到右:1) 文件名,2) 节点数(分支点 + 端点),3) 分支点,4) 链路(即容器),5) 网络长度(包括隔离容器),以及 6) z 堆栈中包含的切片数。将这些数据另存为 .csv 文件并导出以进行进一步分析,以用于任何选择的软件。
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Representative Results
分化(图1),FACS和iPSC-EP封装在胶原蛋白水凝胶中,细胞通常会保持四舍五入24小时,然后开始迁移并形成初始流明。经过大约6天的培养后,当用明场显微镜观察时,水凝胶中可以看到一个原始的毛细管丛(图2)。在共聚焦显微镜(电影1,补充电影1)上成像固定、染色的含细胞水凝胶后,预先处理的图像将转换为骨架,从而能够分析网络的整体长度和连通性。然后,这些定量测量可用于确定哪些条件最适合产生强大的血管网络。
该协议允许开发一个强大的三维毛细管丛,对局部物理和化学线索作出反应。在以往的工作中,这种网络形成已被证明对基质密度、基质刚度、基质金属洛氏素抑制以及各种血管原性线粒体的类型和浓度20、23敏感。
图1:从多能干细胞生成iPSC-EP。(A) WiCell 19-9-11 iPSC 在 E8 介质中培养,辅以 10 μM Y-27632 ROCK 抑制剂,用于 48 h. (B) 然后用 6 μM 的 CHIR99021 在 LaSR Basal 培养基中诱导 iPSC 48 h,此时细胞对布拉丘里,一个中代标记是积极的。(C) 细胞在LaSR巴塞尔介质中进一步培养,直到它们表达CD34,内皮祖子的标记。(D) 大约 15%-25% 的分化细胞表达 CD34。所有刻度条表示长度为 200 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:胶原蛋白水凝胶iPSC-EP血管网络的生成与分析。(A) 此测定中使用的三维微环境的横截面,用于促进 iPSC-EP 形成的血管网络。浮动胶原蛋白水凝胶用iPSC-EP播种,并暴露于EGM-2中,辅以50纳克/mL VEGF和Y-27632的时态剂量。(B) 产生的毛细管丛是高度分支和互连的,通过F-actin(青色)染色进行可视化。左侧显示的二进制图像是通过使用 ImageJ 进行预处理生成的。然后,通过先前开发的算法分析此 z 堆栈,该算法将网络骨架化(显示在细红线集合中),然后分析分支(黄色)、端点(蓝色)、隔离容器(黑色)和连接的网络拓扑船舶(红色)。刻度条代表iPSC-EP含胶原蛋白水凝胶的形态变化100米(C)形态变化:播种后24小时,iPSC-EP保持球形,在96小时内逐渐采用更拉长的表型。进一步培养会导致装配含流明的 VE-Cadherin 网络,如 144-h 时间点的内示所示。刻度条表示长度为 400 μm;绿色 = VE-卡丁,红色 = F-actin,蓝色 = DAPI。请点击此处查看此图的较大版本。
电影 1: VasCULTURE 的 Z 堆栈血管网络是固定的,沾染了F-actin,并通过在共聚焦显微镜上获取z堆栈来可视化。切片以17μm的间隔采集。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
补充影片1:容器的3D渲染。血管网络是固定的,沾染了F-actin(红色)和VE-卡塞林(绿色),并通过在共聚焦显微镜上获取z堆栈来可视化。请点击此处下载此文件。
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Discussion
该协议涉及三种细胞培养基基中细胞的长期培养:E8、LaSR巴塞尔和EGM-2。因此,应非常小心,适当地消毒所有材料。此外,在实验室的层流罩中工作时,应始终佩戴实验室外套和乙醇清洁手套。建议经常检测支原体污染;如果在 iPSC 培养期间观察到大量碎屑或观察到分化效率突然下降,则支原体污染是可能的原因。使用该协议生成的 iPSC-EP 往往会沉积大量的 ECM,从而延长分离时间,并导致单个细胞悬浮液分离成小团块。不要使用胰蛋白酶-EDTA (0.25%),因为溶液可能会破坏 iPSC-EP 上的 CD34 表位。然而,使用胶原酶/消血液进行治疗可以去除沉积的ECM,并借助标准细胞分离溶液缓解分离。在广泛分离后,一些小团细胞和ECM可能仍然存在;用 P100 移液器尖端清除这些块块,因为它们可能会堵塞细胞滤网或干扰 FACS。
多能干细胞对分离敏感,在单细胞悬浮液中会经历凋亡,除非在培养基24中加入ROCK抑制剂(通常为Y-27632)。iPSC-EP 对分离也敏感;包括Y-27632在10μM前24小时的培养是增加细胞生存和增殖的必要条件。因此,在FACS之后,在水凝胶和周围介质中都含有ROCK抑制剂,这一点至关重要。iPSC-EP 的种子密度也显著影响船舶开发和总网络大小。一般来说,500,000个细胞/mL浓度至300万个细胞/mL是适当的播种密度范围。播种密度的进一步增加通常会导致水凝胶压实和细胞死亡。
ECM结构蛋白的密度已发现对工程微血管25、26的发展有重大影响。通常,增加基于ECM的水凝胶(通常是胶原蛋白或纤维蛋白)的密度会限制血管网络长度和连接性。因此,必须仔细注意胶原蛋白基质密度;浓度低于2mg/mL可促进胶原蛋白水凝胶过早的蛋白水解降解,导致水凝胶结构完整性的不可弥补的损失。相反,浓度超过4mg/mL会导致短而宽的流明的形成,表现出不良的连通性;水凝胶的可变形性和孔径的变化是造成这种消减的主要原因。
A细胞和细胞含量胶原蛋白水凝胶不与超低附着板结合;水凝胶往往悬浮在介质中,偶尔会浮到井顶。如果本协议采用组织培养处理板,嵌入的祖子将迁移到井底,并在板底部形成近汇单层。由此产生的细胞播种密度下降抑制了这些祖细胞组装到3D网络。此外,如果将水凝胶放入组织培养处理板的孔中,它们将弱结于井的内表面;这种结合对水凝胶施加应变。由于这个平台是为了分离物理和化学线索的重要性而开发的,因此不能向细胞27传递任何外部力,这一点至关重要。浮动水凝胶可能难以喂养,因为大多数细胞培养基处于水凝胶下方;要克服这种情况,倾斜板并使用 P100 移液器从墙侧拆下介质。
在共聚焦显微镜上成像血管网络时,遵循所有洗涤步骤以确保过量的荧光不会导致低信噪比,这一点至关重要。过量的荧光可能会混淆默认阈值算法,并使 z 堆栈难以进行二元化。为了解决这个问题,使用phalloidin,一种真菌毒素,选择性地标记F-actin并显示有限的脱靶结合。一般来说,使用预先与二级抗体结合的初级抗体来限制通过凝胶扩散的游自由荧光团的浓度。生成 z 堆栈时,建议使用 10-20 微米的切片深度,以平衡获取 z 堆栈所需的时间与高分辨率图像的需求。
这里描述了一种定量测定,用于评估iPSC-EP在3D微环境中的血管生成电位。此测试使用开源软件,不受用户偏见的影响。尽管如此,它代表了生理血管利基的一个过于简化的模式。虽然iPSC-EP可以分化成成熟、功能性血管所需的细胞,但这种测定忽略了参与血管生成过程的其他细胞类型(如成纤维细胞和巨噬细胞)的贡献。此外,该系统是静态的,不会使正在发展的船舶流动。最后,虽然胶原蛋白I是ECM28中的主要蛋白质之一,在体外保持其纤维状结构,但它是依赖性强的,在高温中和时仅限于弱物理交联。尽管存在这些限制,这一测定代表了在探索心血管疾病治疗和建模功能性血管方面向前迈出的重要一步。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国心脏协会(授予J.Z.的15SDG25740035号)、美国国家卫生研究院国家生物医学成像和生物工程研究所(NIBIB)的支持(授予C.C.的赠款号EB007507),以及再生康复研究与培训联盟(AR3T,授予编号1 P2C HD086843-01,授予J.Z.)。我们要感谢Jeanne Stachowiak教授(德克萨斯大学奥斯汀分校)就共聚焦显微镜提供的技术建议。我们还感谢与塞缪尔·米赫利奇(德克萨斯大学奥斯汀分校)、艾丽西亚·艾伦博士(德克萨斯大学奥斯汀分校)、朱莉·雷特莱夫斯基博士(适应性生物技术)和莱昂·贝兰博士(范德比尔特大学)的讨论,以表达他们对三维网络的计算分析。最后,我们感谢鲍小平博士(加州大学伯克利分校)关于将iPSC区分为iPSC-EP的建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | N/A | A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging |
| 96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile | Corning | 7007 | Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634010 | The base media for iPSC-EP differentiation. |
| Barnstead GenPure xCAD Plus | Thermo Fisher Scientific | 50136165 | Water purification system; others can be readily substituted |
| Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture | Fisher Scientific | A8412 | To preserve cell viability when FACs sorting |
| CD34-PE, human (clone: AC136) | Miltenyi Biotec | 130-098-140 | Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs |
| CHIR99021 | LC Laboratories | C-6556 | Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells |
| Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg | VWR | 354249 | Main component of the 3D microenvironment |
| Conical centrifuge tubes (15/50 mL) | Fisher Scientific | 14-959-49D/A | Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | To counterstain and visualize cell nuclei |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-250 | To wash monolayer cultures |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E8008 | For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Promotes endothelial cell viability and proliferation |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For maintenance of pluripotent stem cells |
| Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) | Sigma-Aldrich | 50046 | Neutralizes remaining detergent |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% | Sigma-Aldrich | A8960 | Component of iPSC-EP differentiation medium |
| MATLAB | MathWorks | 1.8.0_152 | Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions) |
| Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) | Fisher Scientific | 356231 | Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation |
| Medium-199 10X | Thermo Fisher Scientific | 1825015 | Used to balance final hydrogel osmolarity and pH |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | VWR | 87003-294 | Stores small volumes of reagents |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | The main ingredient of the immunostaining solutions |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument |
| Recombinant Human VEGF 165 Protein | R&D Systems | 293-VE | Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis |
| Rhodamine phalloidin | Themo Fisher Scientific | R415 | To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks |
| Triton X-100 (nonionic surfactant) | Sigma-Aldrich | X-100 | Detergent used to gently permeabilize cells |
| Tween-20 (emulsifying reagent) | Fisher Scientific | BP337 | Increases the binding specificity of the added antibodies |
| VE-Cadherin (F-8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels |
| Vitronectin | ThermoFisher | A14700 | For maintenance of pluripotent stem cells |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded |
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