Endothelial forfedre avledet fra indusert Pluripotent stamceller (iPSC-EPs) har potensial til å revolusjonere hjerte-og karsykdommer behandlinger og for å muliggjøre etablering av mer trofaste hjerte-og karsykdommer modeller. Her beskrives innkapsling av iPSC-EPs i tredimensjonale (3D) kollagen-microenvironments og en kvantitativ analyse av disse cellens vasculogenic potensial.
Induserte Pluripotent stamceller (iPSCs) er en pasient spesifikk, proliferativ celle kilde som kan differensiere til en hvilken som helst somatiske celle type. Bipotent endothelial forfedre (EPs), som kan differensiere til celletyper som er nødvendige for å montere modne, funksjonelle blodkar, har blitt avledet fra både embryonale og indusert Pluripotent stamceller. Disse cellene har imidlertid ikke blitt grundig evaluert i tredimensjonale miljøer, og en kvantitativ måling av deres vasculogenic potensial forblir unnvikende. Her er generering og isolering av iPSC-EPs via fluorescerende aktivert celle sortering først skissert, etterfulgt av en beskrivelse av innkapsling og kultur av iPSC-EPs i kollagen hydrogeler. Denne ekstracellulære matrise (ECM)-etterligne mikromiljøet oppmuntrer en robust vasculogenic respons; vaskulære nettverk form etter en uke med kultur. Opprettelsen av en beregningsorientert rørledning som utnytter åpen kildekode-programvare for å kvantifisere dette vasculogenic svaret er avgrenset. Denne rørledningen er spesielt utformet for å bevare 3D-arkitekturen i kapillær plexus å robust identifisere antall grener, forgrening poeng, og den totale nettverks lengden med minimal brukerinndata.
Human navle vene endothelial celler (HUVECs) og andre primære endothelial celletyper har blitt benyttet for to ti år å modellere blod fartøy spirende og utvikling i vitro1. Slike vaskulære plattformer lover å belyse molekylær og vev-nivå mekanismer av hjerte-og karsykdommer og kan presentere fysiologiske innsikt i utviklingen av primitive vaskulære nettverk2,3. Selv om feltet av vaskulær modellering har vært vitne til betydelige fremskritt, en “gull standard” analysen som kan kvantitativt modell og vurdere fysiologiske vaskulær utvikling fortsatt unnvikende. De fleste publiserte protokoller ikke tilstrekkelig recapitulate den vaskulære nisje å oppmuntre til dannelse av modne, funksjonelle blodårer eller ikke har en metode for å kvantitativt sammenligne vasculogenic potensialet i vurdert celletyper i tre dimensjoner ( 3D).
Mange aktuelle vaskulære modeller er begrenset i sin evne til å etterligne den fysiologiske vaskulær nisje. En av de mest brukte in vitro plattformer er geléaktige protein blanding-basert rør formasjon analysen. Kort, HUVECs er sådd som enkeltceller på et tynt lag av gel som består av proteiner høstes fra murine sarkom ekstracellulære matrise (ECM); innen en til to dager, det HUVECs selv-montere i primitive rør4. Imidlertid skjer denne prosessen i to dimensjoner (2D) og endothelial celler (ECs) benyttes i denne analysen ikke danner vedlagt, hule lumen, og dermed begrense fysiologiske betydningen av disse studiene. Flere nylig, ECs og støtte celler (for eksempel Mesenchymal stamceller (MSCs) og pericytes) har vært co-kultivert i 3D-microenvironments som simulerer fiber arkitekturen til de innfødte ECM, slik som kollagen eller fibrin hydrogeler5. Å modellere vaskulær utvikling i denne mikromiljøet, polymer perler belagt med ECs er vanligvis ansatt6. Tillegg av eksogene vekstfaktorer og/eller vekstfaktorer skilles ut av andre celler interstitially innebygd i hydrogel kan indusere ECs, belegg på polymer perler, å spire og danne enkelt lumen; antall og diameter på spirer og fartøy kan deretter beregnes. Men disse spirer er entall og ikke danner et vedlagt, tilkoblet nettverk som er sett i fysiologiske forhold og dermed er mer minner om en svulst blodkar modell. Mikrovæskebasert enheter har også blitt benyttet for å etterligne den vaskulære nisje og å fremme dannelsen av blodkar i EC-Laden hydrogeler7,8. Vanligvis brukes en angiogenic vekstfaktor-gradient på sirkulerende cellekultur medium for å indusere EC migrasjon og spirende. ECs som utgjør lumen av utviklede fartøy er følsomme for skjær stresset indusert ved anvendelse av væske strømme gjennom mikrovæskebasert enheten; dermed fanger disse mikrovæskebasert enhetene opp viktige fysiologiske parametre som ikke er tilgjengelige i de statiske modellene. Men disse enhetene krever kostbare microfabrication evner.
Viktigst, alle tre vaskulære modeller (2D, 3D, mikrovæskebasert) overveldende utnytte primære ECs så vel som primære støtte celletyper. Primær-celler kan ikke utvikles til en effektiv kardiovaskulær behandling fordi cellene ville skape en immunrespons ved implantation; Videre, HUVECs og lignende primære celletyper er ikke pasientspesifikke og ikke fange vaskulær unormalt som oppstår hos pasienter med en genetisk disposisjon eller pre-eksisterende helsemessige forhold, for eksempel diabetes mellitus. Indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) har dukket opp i det siste tiåret som en pasient-spesifikk, proliferativ celle kilde som kan skilles i alle somatiske celler i menneskekroppen9. Spesielt har protokoller blitt publisert som skisserer generering og isolering av iPSC-avledet endothelial forfedre (iPSC-EPs)10,11; iPSC-EPs er bipotent og kan derfor være ytterligere differensiert i endothelial celler og glatte muskelceller/pericytes, byggesteinene av modne, funksjonelle blodkar. Bare én studie har overbevisende detaljert utvikling av en primær kapillær plexus fra iPSC-EPs i en 3D-mikromiljøet12; Selv om denne studien er avgjørende for en forståelse av iPSC-EP montering og differensiering i naturlige og syntetiske hydrogeler, det gjorde ikke kvantitativt sammenligne nettverket topologi av den resulterende blodkar. En annen fersk studie har brukt polymer perle modell for å sammenligne spirende av HUVECs og iPSC-avledet ECs5. Derfor er det et klart behov for å ytterligere belyse den fysiske og kjemiske signalering mekanismer som regulerer iPSC-EP vasculogenesis i 3D microenvironments og å finne ut om disse cellene er egnet for iskemiske terapi og hjerte-og karsykdommer Modellering.
I det siste tiåret, har ulike åpen kildekodedata samlebånd og skeletonization algoritmer er utviklet for å kvantifisere og sammenligne vaskulær nettverks lengde og tilkobling. For eksempel, Charwat et al. utviklet en Photoshop-basert rørledning for å trekke ut en filtrert, binarized bilde av vaskulære nettverk avledet fra en co-kultur av fett-avledet stamceller og utvekst ECs i en fibrin matrise13,14. Kanskje den mest brukte topologi sammenligningsverktøy er AngioTool, et program utgitt online av National Cancer Institute15; til tross for programmets utbredte adopsjon og godt dokumentert troskap, er programmet begrenset til å analysere fartøy-lignende strukturer i to dimensjoner og andre programmer, inkludert AngioSys og Wimasis, deler samme dimensionality begrensning16. Kraftfull programvare suite som Imaris, Lucis, og programmet ha blitt bebygget å analysere nettverket topologi av konstruert microvasculature; Disse suitene er imidlertid kostnads uoverkommelige for de fleste akademiske laboratorier og begrenser tilgangen til kildekoden, noe som kan hindre muligheten for sluttbrukeren å tilpasse algoritmen til deres spesifikke program. 3D slicer, en åpen kildekode magnetisk resonans imaging/beregnet tomografi pakken inneholder en vaskulær modellering Toolkit som effektivt kan analysere topologien av 3D vaskulære nettverk17; Imidlertid er analysen avhengig av brukeren manuelt plassere endepunktene i nettverket, som kan bli kjedelige når analysere et stort datasett og kan bli påvirket av brukerens underbevissthet fordommer. I dette manuskriptet, en beregningsorientert rørledning som kan kvantifisere 3D vaskulære nettverk er beskrevet i detalj. Å overvinne det over-skissert begrensninger, denne åpen kilde beregningsorientert rørledning utnytter ImageJ å pre-forarbeide ervervet konfokalmikroskopi profilen å belaste det 3D kvantum i en skjelett analyserer. Skjelettet analysator bruker en parallell midtre akse tynning algoritme, og ble opprinnelig utviklet av Kerschnitzki et al. å analysere lengden og tilkobling av osteocyte nettverk18; denne algoritmen kan effektivt brukes til å karakterisere lengden og tilkobling av konstruert microvasculature.
Til sammen skisserer denne protokollen opprettelsen av mikrovaskulær nettverk i 3D-microenvironments og gir en åpen kildekode og bruker-bias gratis datasamlebånd rør for å lett sammenligne vasculogenic potensialet i iPSC-EPs.
Denne protokollen innebærer langsiktig kultur av celler i tre typer cellekultur medier: E8, LaSR basal, og EGM-2. Derfor bør det utvises stor forsiktighet for å sterilisere alle materialer på riktig måte. I tillegg bør laboratorie kåper og etanol-rengjort hansker alltid brukes når du arbeider i laboratoriet er laminær Flow Hood. Det anbefales å ofte teste for mycoplasma forurensning; Hvis en stor mengde rusk er observert under iPSC kultur eller et plutselig fall i differensiering effektivitet er notert, mycopla…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association (Grant nummer 15SDG25740035, tildelt J.Z.), National Institute of Biomedical Imaging og bioteknologi (NIBIB) av National Institutes of Health (Grant nummer EB007507, tildelt C.C.), og Alliansen for regenererende rehabilitering forskning & Training (AR3T, gi nummer 1 P2C HD086843-01, tildelt J.Z.). Vi ønsker å erkjenne Prof. Jeanne Stachowiak (The University of Texas i Austin) for hennes tekniske råd om konfokalmikroskopi mikroskopi. Vi er også takknemlige for diskusjoner med Samuel Mihelic (The University of Texas at Austin), Dr. Alicia Allen (The University of Texas i Austin), Dr. Julie Rytlewski (Adaptive Biotech), og Dr. Leon Bellan (Vanderbilt University) for sin innsikt i beregningsorientert analyse av 3D-nettverk. Til slutt takker vi Dr. Xiaoping Bao (University of California, Berkeley) for hans råd om å skille iPSCs inn i iPSC-EPs.
µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | N/A | A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging |
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile | Corning | 7007 | Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish |
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS |
Advanced DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634010 | The base media for iPSC-EP differentiation. |
Barnstead GenPure xCAD Plus | Thermo Fisher Scientific | 50136165 | Water purification system; others can be readily substituted |
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture | Fisher Scientific | A8412 | To preserve cell viability when FACs sorting |
CD34-PE, human (clone: AC136) | Miltenyi Biotec | 130-098-140 | Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs |
CHIR99021 | LC Laboratories | C-6556 | Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells |
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg | VWR | 354249 | Main component of the 3D microenvironment |
Conical centrifuge tubes (15/50 mL) | Fisher Scientific | 14-959-49D/A | Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | To counterstain and visualize cell nuclei |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-250 | To wash monolayer cultures |
EDTA | Sigma-Aldrich | E8008 | For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting |
Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Promotes endothelial cell viability and proliferation |
Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For maintenance of pluripotent stem cells |
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) | Sigma-Aldrich | 50046 | Neutralizes remaining detergent |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% | Sigma-Aldrich | A8960 | Component of iPSC-EP differentiation medium |
MATLAB | MathWorks | 1.8.0_152 | Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions) |
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) | Fisher Scientific | 356231 | Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation |
Medium-199 10X | Thermo Fisher Scientific | 1825015 | Used to balance final hydrogel osmolarity and pH |
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | VWR | 87003-294 | Stores small volumes of reagents |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | The main ingredient of the immunostaining solutions |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument |
Recombinant Human VEGF 165 Protein | R&D Systems | 293-VE | Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis |
Rhodamine phalloidin | Themo Fisher Scientific | R415 | To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks |
Triton X-100 (nonionic surfactant) | Sigma-Aldrich | X-100 | Detergent used to gently permeabilize cells |
Tween-20 (emulsifying reagent) | Fisher Scientific | BP337 | Increases the binding specificity of the added antibodies |
VE-Cadherin (F-8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels |
Vitronectin | ThermoFisher | A14700 | For maintenance of pluripotent stem cells |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded |