Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En in vitro 3D modell og beregningsorientert rørledning å kvantifisere det Vasculogenic potensialet av iPSC-avledet endothelial forfedre

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59342
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin

Summary

Endothelial forfedre avledet fra indusert Pluripotent stamceller (iPSC-EPs) har potensial til å revolusjonere hjerte-og karsykdommer behandlinger og for å muliggjøre etablering av mer trofaste hjerte-og karsykdommer modeller. Her beskrives innkapsling av iPSC-EPs i tredimensjonale (3D) kollagen-microenvironments og en kvantitativ analyse av disse cellens vasculogenic potensial.

Abstract

Induserte Pluripotent stamceller (iPSCs) er en pasient spesifikk, proliferativ celle kilde som kan differensiere til en hvilken som helst somatiske celle type. Bipotent endothelial forfedre (EPs), som kan differensiere til celletyper som er nødvendige for å montere modne, funksjonelle blodkar, har blitt avledet fra både embryonale og indusert Pluripotent stamceller. Disse cellene har imidlertid ikke blitt grundig evaluert i tredimensjonale miljøer, og en kvantitativ måling av deres vasculogenic potensial forblir unnvikende. Her er generering og isolering av iPSC-EPs via fluorescerende aktivert celle sortering først skissert, etterfulgt av en beskrivelse av innkapsling og kultur av iPSC-EPs i kollagen hydrogeler. Denne ekstracellulære matrise (ECM)-etterligne mikromiljøet oppmuntrer en robust vasculogenic respons; vaskulære nettverk form etter en uke med kultur. Opprettelsen av en beregningsorientert rørledning som utnytter åpen kildekode-programvare for å kvantifisere dette vasculogenic svaret er avgrenset. Denne rørledningen er spesielt utformet for å bevare 3D-arkitekturen i kapillær plexus å robust identifisere antall grener, forgrening poeng, og den totale nettverks lengden med minimal brukerinndata.

Introduction

Human navle vene endothelial celler (HUVECs) og andre primære endothelial celletyper har blitt benyttet for to ti år å modellere blod fartøy spirende og utvikling i vitro1. Slike vaskulære plattformer lover å belyse molekylær og vev-nivå mekanismer av hjerte-og karsykdommer og kan presentere fysiologiske innsikt i utviklingen av primitive vaskulære nettverk2,3. Selv om feltet av vaskulær modellering har vært vitne til betydelige fremskritt, en "gull standard" analysen som kan kvantitativt modell og vurdere fysiologiske vaskulær utvikling fortsatt unnvikende. De fleste publiserte protokoller ikke tilstrekkelig recapitulate den vaskulære nisje å oppmuntre til dannelse av modne, funksjonelle blodårer eller ikke har en metode for å kvantitativt sammenligne vasculogenic potensialet i vurdert celletyper i tre dimensjoner ( 3D).

Mange aktuelle vaskulære modeller er begrenset i sin evne til å etterligne den fysiologiske vaskulær nisje. En av de mest brukte in vitro plattformer er geléaktige protein blanding-basert rør formasjon analysen. Kort, HUVECs er sådd som enkeltceller på et tynt lag av gel som består av proteiner høstes fra murine sarkom ekstracellulære matrise (ECM); innen en til to dager, det HUVECs selv-montere i primitive rør4. Imidlertid skjer denne prosessen i to dimensjoner (2D) og endothelial celler (ECs) benyttes i denne analysen ikke danner vedlagt, hule lumen, og dermed begrense fysiologiske betydningen av disse studiene. Flere nylig, ECs og støtte celler (for eksempel Mesenchymal stamceller (MSCs) og pericytes) har vært co-kultivert i 3D-microenvironments som simulerer fiber arkitekturen til de innfødte ECM, slik som kollagen eller fibrin hydrogeler5. Å modellere vaskulær utvikling i denne mikromiljøet, polymer perler belagt med ECs er vanligvis ansatt6. Tillegg av eksogene vekstfaktorer og/eller vekstfaktorer skilles ut av andre celler interstitially innebygd i hydrogel kan indusere ECs, belegg på polymer perler, å spire og danne enkelt lumen; antall og diameter på spirer og fartøy kan deretter beregnes. Men disse spirer er entall og ikke danner et vedlagt, tilkoblet nettverk som er sett i fysiologiske forhold og dermed er mer minner om en svulst blodkar modell. Mikrovæskebasert enheter har også blitt benyttet for å etterligne den vaskulære nisje og å fremme dannelsen av blodkar i EC-Laden hydrogeler7,8. Vanligvis brukes en angiogenic vekstfaktor-gradient på sirkulerende cellekultur medium for å indusere EC migrasjon og spirende. ECs som utgjør lumen av utviklede fartøy er følsomme for skjær stresset indusert ved anvendelse av væske strømme gjennom mikrovæskebasert enheten; dermed fanger disse mikrovæskebasert enhetene opp viktige fysiologiske parametre som ikke er tilgjengelige i de statiske modellene. Men disse enhetene krever kostbare microfabrication evner.

Viktigst, alle tre vaskulære modeller (2D, 3D, mikrovæskebasert) overveldende utnytte primære ECs så vel som primære støtte celletyper. Primær-celler kan ikke utvikles til en effektiv kardiovaskulær behandling fordi cellene ville skape en immunrespons ved implantation; Videre, HUVECs og lignende primære celletyper er ikke pasientspesifikke og ikke fange vaskulær unormalt som oppstår hos pasienter med en genetisk disposisjon eller pre-eksisterende helsemessige forhold, for eksempel diabetes mellitus. Indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) har dukket opp i det siste tiåret som en pasient-spesifikk, proliferativ celle kilde som kan skilles i alle somatiske celler i menneskekroppen9. Spesielt har protokoller blitt publisert som skisserer generering og isolering av iPSC-avledet endothelial forfedre (iPSC-EPs)10,11; iPSC-EPs er bipotent og kan derfor være ytterligere differensiert i endothelial celler og glatte muskelceller/pericytes, byggesteinene av modne, funksjonelle blodkar. Bare én studie har overbevisende detaljert utvikling av en primær kapillær plexus fra iPSC-EPs i en 3D-mikromiljøet12; Selv om denne studien er avgjørende for en forståelse av iPSC-EP montering og differensiering i naturlige og syntetiske hydrogeler, det gjorde ikke kvantitativt sammenligne nettverket topologi av den resulterende blodkar. En annen fersk studie har brukt polymer perle modell for å sammenligne spirende av HUVECs og iPSC-avledet ECs5. Derfor er det et klart behov for å ytterligere belyse den fysiske og kjemiske signalering mekanismer som regulerer iPSC-EP vasculogenesis i 3D microenvironments og å finne ut om disse cellene er egnet for iskemiske terapi og hjerte-og karsykdommer Modellering.

I det siste tiåret, har ulike åpen kildekodedata samlebånd og skeletonization algoritmer er utviklet for å kvantifisere og sammenligne vaskulær nettverks lengde og tilkobling. For eksempel, Charwat et al. utviklet en Photoshop-basert rørledning for å trekke ut en filtrert, binarized bilde av vaskulære nettverk avledet fra en co-kultur av fett-avledet stamceller og utvekst ECs i en fibrin matrise13,14. Kanskje den mest brukte topologi sammenligningsverktøy er AngioTool, et program utgitt online av National Cancer Institute15; til tross for programmets utbredte adopsjon og godt dokumentert troskap, er programmet begrenset til å analysere fartøy-lignende strukturer i to dimensjoner og andre programmer, inkludert AngioSys og Wimasis, deler samme dimensionality begrensning16. Kraftfull programvare suite som Imaris, Lucis, og programmet ha blitt bebygget å analysere nettverket topologi av konstruert microvasculature; Disse suitene er imidlertid kostnads uoverkommelige for de fleste akademiske laboratorier og begrenser tilgangen til kildekoden, noe som kan hindre muligheten for sluttbrukeren å tilpasse algoritmen til deres spesifikke program. 3D slicer, en åpen kildekode magnetisk resonans imaging/beregnet tomografi pakken inneholder en vaskulær modellering Toolkit som effektivt kan analysere topologien av 3D vaskulære nettverk17; Imidlertid er analysen avhengig av brukeren manuelt plassere endepunktene i nettverket, som kan bli kjedelige når analysere et stort datasett og kan bli påvirket av brukerens underbevissthet fordommer. I dette manuskriptet, en beregningsorientert rørledning som kan kvantifisere 3D vaskulære nettverk er beskrevet i detalj. Å overvinne det over-skissert begrensninger, denne åpen kilde beregningsorientert rørledning utnytter ImageJ å pre-forarbeide ervervet konfokalmikroskopi profilen å belaste det 3D kvantum i en skjelett analyserer. Skjelettet analysator bruker en parallell midtre akse tynning algoritme, og ble opprinnelig utviklet av Kerschnitzki et al. å analysere lengden og tilkobling av osteocyte nettverk18; denne algoritmen kan effektivt brukes til å karakterisere lengden og tilkobling av konstruert microvasculature.

Til sammen skisserer denne protokollen opprettelsen av mikrovaskulær nettverk i 3D-microenvironments og gir en åpen kildekode og bruker-bias gratis datasamlebånd rør for å lett sammenligne vasculogenic potensialet i iPSC-EPs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utarbeidelse av kultur Media og belegg løsninger

  1. For å forberede vitronectin belegg løsning, fortynne vitronectin 1:100 i Dulbecco ' s fosfat-bufret saltvann (DPBS).
    FORSIKTIG: Når fortynnet, er det ikke anbefalt å lagre denne løsningen for fremtidig bruk.
  2. Ved mottak av fenol rød-fri, vekstfaktor-redusert geléaktige protein blanding (se tabell over materialer) fra produsenten, tine på isen ved 4 ° c til blandingen er gjennomsiktig og væske. Å holde blandingen på is i en laminær strømnings hette, Pipetter 75 μL av blandingen i et 1,8 mL mikrosentrifugen rør og fryse ved-20 ° c umiddelbart. Disse alikvoter kan oppbevares i opptil ett år.
    FORSIKTIG: denne geléaktige protein blandingen blir svært tyktflytende når den oppbevares ved romtemperatur og vil stivne ved høyere temperaturer. Hold denne løsningen iskald.
  3. For å forberede denne blandingen til belegg, tine en 75 μL alikvot på is og fortynne med 6 mL iskald Dulbecco ' s modifisert Eagle medium: næringsstoff blanding F-12 (DMEM/F12). Dette forberedt volumet er nok til pels en 12 brønn plate.
  4. Forbered en 100 mg/mL lagerløsning av askorbinsyre magnesium-2-fosfat (et hvitt lyofilisert pulver) i ultrarent vann ved å tilsette 500 mg pulver til 5 mL vann i et scintillation hetteglass på 10 mL. Agitere med en røre bar til løsningen er helt gjennomsiktig (dette kan ta opptil en time). Denne løsningen kan oppbevares ved-20 ° c i opptil ett år.
  5. Opprett en 10 mM lager av CHIR99021 (CHIR) ved å oppløse 10 mg lyofilisert pulver i 1,9928 mL dimethyl sulfoxide (DMSO) i et 15 mL konisk sentrifugerør og varm i en 37 ° c perle (eller vann) bad til løsningen er gjennomsiktig. Alikvot i 1,8 mL mikrosentrifugen rør og oppbevares ved-20 ° c i opptil ett år.
  6. Lag en 10 mM lager av Y-27632, en ROCK-hemmer (ROCKi), ved oppløsning 10 mg lyofilisert pulver i 3,1225 mL dimethyl sulfoxide (DMSO) i et 15 mL konisk sentrifugerør og varm i en 37 ° c perle (eller vann) bad til løsningen er gjennomsiktig. Alikvot i 1,8 mL mikrosentrifugen rør og oppbevares ved-20 ° c i opptil ett år.
  7. For å forberede Essential 8 (E8) medium, tine frosne kosttilskudd, legge til 500 mL flaske basal medium, og filter sterilisere. Denne løsningen kan oppbevares ved 4 ° c i opptil to uker.
    FORSIKTIG: det er svært viktig å ikke varme dette mediet ved 37 ° c, da proteinene i medium formuleringen kan svekkes ved langvarig bruk. Oppbevar i stedet dette mediet ved romtemperatur i 15 til 30 minutter før bruk.
  8. For å klargjøre sorterings bufferen legger du til 1,33 mL 7,5% storfe serum albumin (BSA) i DPBS og 200 μL av 0,5 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) til 48,5 mL av DPBS for å skape en endelig løsning av 0,5% BSA og 2 mM EDTA.
  9. For å klargjøre LaSR basal, tilsett 300 μL av 100 mg/mL askorbinsyre magnesium-2-fosfat og 5 mL GlutaMAX til 500 mL avansert DMEM/F12. Denne løsningen kan oppbevares ved 4 ° c i opp til en måned.
  10. For å forberede endothelial Cell vekst medium-2 (EGM-2), tine kosttilskudd og legge til 500 mL flaske basal medium. Denne løsningen kan oppbevares ved 4 ° c i opp til en måned.
  11. For å klargjøre blokkerings bufferen, tilsett 500 mg lyofilisert i storfe (BSA) og 50 μL av en emulgering reagens (se tabell over materialer) til 48 ml DPBS. Ruge ved 37 ° c i minst 15 min. for å sikre at BSA ikke klumper seg og deretter separeres fra oppløsningen.

2. tine, vedlikehold og passaging av iPSCs

  1. Før tine en embryo iPSC hetteglass, frakk en enkelt brønn av en 6-brønn plate med 1 mL vitronectin løsning (utarbeidet som beskrevet i trinn 1,1). Ruge for en h ved romtemperatur. Ikke la dette belegget lufttørke før du legger E8 medium til platen.
  2. For å tine iPSCs, Hent en embryo hetteglass med iPSCs fra den flytende nitrogen beholderen og Tin ved 37 ° c til en liten krystall av is gjenstår. Forsiktig (dråpevis) overføre innholdet i tint hetteglasset til et 15 mL konisk sentrifugerør som inneholder 8 mL iskald DMEM/F12. Vask tint hetteglasset med et tillegg 1 mL iskald DMEM/F12 for å minimere celle tap. Sentrifuger for 5 min ved 300 x g.
  3. Mens du venter på sentrifuger, aspirer den vitronectin løsningen og tilsett 1 mL E8 medium (fremstilt som beskrevet i trinn 1,6) til brønnen. Deretter fjerner du DMEM/F12-supernatanten fra sentrifugert koniske rør og re-suspendere pellet i 1 mL E8 medium. Overfør cellene til den nylig belagt plate, å være sikker på å agitere suspensjonen for å hindre at koloniene fra klumper upon seeding.
  4. Det er vanligvis betydelige celle død etter tine. Neste morgen, fjerne mediet og erstatte med friske E8 medium.
    Merk: selv under optimale forhold, iPSCs tendens til å komme seg dårlig fra kryonisk bevaring. Det anbefales å lagre nedfryste en nesten-confluent 6-brønn for fremtidige seeding i en enkelt 6-brønn. Tilstedeværelsen av celle rusk er normalt for de første 2-3 dager under celle utvinning.
  5. Erstatt E8 medium daglig til cellene er klare for passaging (70% – 80% confluency).
  6. Til passasje klargjør du først vitronectin-belagte brønner (som beskrevet i trinn 2,1).
    1. Når vitronectin-belagte brønner er klare (ca. 1 h), aspirer E8-medium fra brønnen for å bli passert og vaskes to ganger med 1 mL DPBS. Ruge med 1 mL 0,5 mM EDTA for 5 – 7 min ved 37 ° c. Mens incubating, Fjern den vitronectin løsningen fra den nylig belagte brønnen og Bytt ut med 1 – 2 mL E8 medium.
    2. Fjern EDTA-løsningen fra brønnene som skal passert og løsne koloniene ved å vaske forsiktig én eller to ganger med 1 mL E8. Overfør 75-200 μL av celle oppheng til de fersk belagte E8-inneholdende brønner, agitere platen for å sikre jevn dekning, og plasser i inkubator umiddelbart.
      FORSIKTIG: den inkubasjonstiden for iPSC avløsning er celle-linje avhengig; Det anbefales at brukeren av denne protokollen tester en rekke ganger på tilstrekkelig utvide en mottatt/generert iPSC linje. 75 μL av celle suspensjon resulterer vanligvis i 4 dager mellom passasjer; 150 μL eller mer fører til 2 – 3 dager mellom passasjer.

3. generering av iPSC-avledet endothelial forfedre (figur 1).

  1. Når du opprettholder iPSCs, sørg for at koloniene er godt komprimeres og at det er et lavt antall differensiert celler i kultur. Hvis koloniene begynner å ta kontakt med hverandre, cellene er mest sannsynlig for confluent og må passert umiddelbart.
  2. Når iPSCs er 70%-80% confluent, pels en 24-brønn plate med geléaktige protein blandingen (utarbeidet som beskrevet i 1.2/1.3). Pipetter 250 μL av denne blandingen i hver brønn og oppbevares i 1 time ved romtemperatur.
  3. Under inkubasjons over 1-h fjerner du E8-mediet og Y-27632 fra henholdsvis kjøleskapet og fryseren. Når E8 medium og Y-27632 når romtemperatur, klargjør du E8 + ROCKi ved å legge til 13 μL av 10 μM Y-27632 til 13 mL E8 i et 15 mL konisk sentrifugerør.
  4. Fjern E8-mediet fra iPSC-brønnene, vask to ganger med 1 mL DPBS, og deretter ruge med 0,5 mM EDTA for 5-7 min ved 37 ° c. Etter inkubasjonsperioden, fjerne EDTA og raskt skjær cellene i en enkelt celle suspensjon med en P1000 pipette spissen med 1 mL av E8 + ROCKi medium.
  5. Tell cellene med en hemocytometer. For en suspensjon som kan inneholde millioner av iPSCs, tilsett 20 μL av celle fjæring til 180 μL av trypan blå. Bestem antall total celler i enkelt celle suspensjonen.
  6. Transfer 0,432 x 106 til 1,296 x 106 celler (104 til 3 x 104 celler/cm2) til gjenværende E8 + ROCKi medium. Fjern geléaktige blanding belegget fra den nylig belagte 12-brønn plate og tilsett 500 μL av celle fjæring til hver brønn, slik at cellene er godt distribuert og ikke danner små klumper.
    Merk: Dette spekteret av tetthet er optimalt for differensiering av CD34 positive celler; disse seeding tettheten er imidlertid cellelinje avhengig og må kanskje optimaliseres av brukeren av denne protokollen.
  7. Etter 24 h av kultur, erstatte medium med 500 μL av frisk E8 medium. Ruge for en ekstra 24 h under samme vilkår.
  8. Fjern E8-mediet og erstatt det med LaSR basal supplert med 6-12 μM CHIR99021. Denne timepoint er definert som D0 av differensiering. Etter 24 h av kultur, erstatte med samme cellekultur medium.
    Merk: som beskrevet tidligere, mengden CHIR99021 lagt til dette mediet vil avhenge av iPSC linjen utnyttet. Vennligst test en rekke CHIR99021 konsentrasjoner for å sikre optimale resultater.
  9. Etter 48 h av inkubasjons med CHIR99021, erstattes med 1 mL LaSR basal.
  10. Erstatt mediet daglig med 2 mL LaSR basal for 2-3 ekstra dager. På dette tidspunktet punkt (D5 av differensiering), en betydelig andel av disse cellene vil uttrykke CD34 og kan karakteriseres som endothelial forfedre. En skjematisk av denne protokollen er skissert med representative resultater i figur 1 og beskrevet i sin helhet av etterforskerne som først publisert denne metoden 11,19.
    Merk: disse endothelial forfedre kan bli ytterligere differensiert langs en endothelial avstamning (35% – 99%) eller en glatt muskel avstamning (1% – 65%). Differensiering effektivitet varierer avhengig av hvilken type ECM belegg og cellen kulturen mediet brukes under differensiering 20.

4. FACS av endothelial forfedre

  1. Før du dissociating D5/D6 atskilte celler, klargjør du sorterings bufferen som beskrevet i trinn 1,8, og hold på isen.
  2. Ruge de differensiert cellene med 250 μL av celle avløsning løsning per brønn (se tabell over materialer) i 10 min ved 37 ° c.
  3. Distansere cellene med en P1000 pipette spissen i en enkelt celle suspensjon i celle avløsning løsning. Konsolidere celle celle avløsning løsning blandingen i en 15 mL konisk sentrifugerør og sentrifuger for 5 min på 300 x g.
  4. Fjern supernatanten og resuspend i 200 μL av iskald sorterings buffer (fremstilt som beskrevet i trinn 1,7. Tilsett 5 μL av konsentrert CD34-PE-antistoff til celle sorterings buffer suspensjonen og ruge i 10 min ved 4 ° c.
  5. Re-suspendere i 5 mL iskald sortering buffer. Filtrer denne suspensjonen gjennom en celle sil med en 40 μm cap før du plasserer på sorteringen.
  6. På riktig fluorescerende kanal sorterer du 10 000 celler som ikke er merket med et fluorescerende antistoff. Gate en region på et høyt fluorescerende intensitet som ikke inneholder noen av disse 10 000 celler (figur 1d). Dette vil fungere som en negativ kontroll.
  7. Kjør prøven som inneholder iPSC-EPs, merket med en fluorescerende løsning, og begynn sorteringen. CD34 er svært uttrykt i disse endothelial forfedre og er lett skilles fra den største befolkningen. Etter sortering, overføre løsningen til en 15 mL konisk sentrifugerør og sentrifuger i 5 min ved 300 x g. Fjern supernatanten.
    Merk: Hvis løsningen er i et rør større enn et mikrosentrifugen rør (f. eks, en 5 mL polystyren tube vanligvis ansatt i mange FACs protokoller), re-suspendere den sorterte celle pellet i 1 mL sortering buffer og overføre denne løsningen til en mikrosentrifugen tube. Sentrifuger på 300 x g i 5 min og fjern supernatanten.
    1. Valgfritt: Hvis ytterligere iPSC-EP karakterisering er ønskelig, legge til andre primære antistoffer (f. eks, CD31-APC) samtidig med CD34-PE. Sørg for at crosstalk mellom ulike fluorescerende kanaler er minimert.

5. innkapsling og lang tids kultur for iPSC-EP-Laden kollagen hydrogeler

  1. Forbered såing medium ved å tilsette 40 μL av 10x medium 199 til 400 μL av endothelial vekstmedium (EGM-2) supplert med 10 μM Y-27632 i en 1,8 mL mikrosentrifugen og Legg rør på is.
    Merk: mens bruken av antibiotika frarådes for stilk cellen kultur og vedlikehold av differensiert celler, dosering med pen/strep anbefales etter sortering fordi det er vanskelig å garantere sterilitet i sorterings miljøet (dette er mer imperativ hvis sorteringen er delt blant mange laboratorier).
  2. Fjern alle supernatanten fra celle fjæringen og tilsett 200 μL av EGM-2, supplert med 10 μM Y-27632. Overfør celle fjæringen til seeding medium og bland kraftig.
  3. Tilsett 350 μL av kollagen i løsningen som ble tilberedt i trinn 5,2 og bland godt. Løsningen vil bli blek gul.
    Merk: den endelige konsentrasjonen av kollagen kan ha en betydelig innvirkning på dannelsen av kapillær plexus. Denne protokollen forutsetter at kollagen er levert ved 10 mg/mL, og at hydrogeler har en endelig konsentrasjon på 3,5 mg/mL. Juster disse volumene for å oppnå den endelige konsentrasjonen av kollagen; Det anbefales å begrense den endelige kollagen konsentrasjonen fra 2 mg/mL til 4 mg/mL.
  4. Tilsett 5 μL av 1M NaOH til løsningen forberedt i 5,3 og bland godt, unngå innføring av luftbobler. Løsningen vil bli lyse rosa.
  5. Pipetter 56 μL av nøytralisert kollagen-celle løsning fremstilt i 5,4 i individuelle brønner av en 96-brønn ultra-lav vedlegg U-bunn cellekultur plate. Ruge ved 37 ° c i 30 min. Før du legger til medier, må du kontrollere at cellene har blitt jevnt fordelt ved å undersøke prøvene med et brightfield mikroskop.
  6. Forbered 1 mL kultur medium bestående av EGM-2 supplert med 10 μM Y-27632 og 50 ng/mL vaskulær endothelial vekstfaktor (VEGF) ved å tilsette 1 μL av hver lagerløsning til et mikrosentrifugen rør. Etter å blande godt, Pipetter 100 μL av denne celle kulturen medium på celle-Laden hydrogeler. Overfør platen til 37 ° c for lang tids kultur.
  7. Erstatt kultur medium daglig, legge til flere angiogenic vekstfaktorer eller små molekyl hemmere som diktert av formålet med studien. For å fjerne mediene optimalt, vipp platen og bruk en P100-tupp for å forsiktig aspirer medium uten å forstyrre hydrogel.

6. festing, immunostaining og visualisering av EP-baserte vaskulære nettverk

  1. Etter en uke med kultur, tilsett 250 μL av 4% paraformaldehyde (PFA) løsning på en 48-brønn plate. Fyll så mange brønner som det er hydrogeler. Fjern mediet fra hydrogeler (PFA) og bruk tynn pinsett til å overføre hydrogeler til PFA som inneholder brønner. Ruge for 10 min ved romtemperatur og fjern PFA ved å vaske raskt med PBS.
  2. Permeabilize ved å tilsette 250 μL av 0,5% av et ioniske overflateaktivt middel (se tabell over materialer) i 5 minutter ved romtemperatur. Vask to ganger med 250 μL av PBS supplert med 300 mM Glycine. Ruge ved romtemperatur i 5 minutter for hvert vasketrinn for å sikre fjerning av overflødig vaskemiddel. Blokker ved å senke hydrogeler i 250 til μL av blokkerings buffer i 30 min.
  3. Ruge med ønsket primær antistoffer fortynnet i blokkerings buffer over natten ved 4 ° c. For eksempel, hvis immunostaining med phalloidin og VE-cadherin, fortynne 1:40 og 1:200, henholdsvis i blokkerende buffer.
  4. Neste dag, fjerne den primære antistoff løsning og vask to ganger med 0,5% emulgering reagens i DPBS. Dekk med aluminiumsfolie og ruge med en art-spesifikk sekundært antistoff (f. eks, 1:200 Alexa fluor 488 i PBS) for 2 t ved romtemperatur.
  5. Fjern den sekundære antistoff oppløsningen og vask to ganger med 0,5% emulgering reagens i DPBS. Ruge ved romtemperatur i 5 minutter for hvert vasketrinn for å sikre fjerning av gratis fluorophores.
  6. For å visualisere cellekjerner, fortynne 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:10000 i PBS og legge til prøven (e).
    1. Ruge for 2 min ved romtemperatur og vask to ganger med PBS. Ruge ved romtemperatur i 5 minutter for hvert vasketrinn for å sikre fjerning av gratis fluorophores.
  7. Overfør prøvene til en angiogenese μ-Slide eller en tallerken med glassbunn med en fin pinsett. Sørg for at ingen luftbobler er fanget under hydrogel.
  8. Bilde på et konfokalmikroskopi mikroskop ved å anskaffe z-stabler som strekker seg fra bunnen til toppen av prøven. Kontroller at detektoren ikke er mettet, og at den laveste forstørrelsen som er tilgjengelig er i bruk (et stort synsfelt er ønskelig).
    Merk: for fremtidig behandling må z-bunkene lagres med minimal kompresjon (f.eks. czi).

7. bruke beregnings prosess rørledningen til å analysere og sammenligne vaskulær nettverk topologi

  1. Inspiser hver z-stabel for å sikre at sektorene bare inneholder fartøy. Åpne z-stakken i ImageJ og forbedre kontrasten ved å klikke på bilde > justere ≫ lysstyrke/kontrast. Fartøyets grenser er nå klart avgrenset, og bakgrunns nivået er minimert. Z-dimensjonene samsvarer ofte ikke med x/y-dimensjonene. Hvis du vil rette opp dette, klikker du bilde > justere > størrelse og endre antall z-sektorer slik at avstanden mellom hver sektor tilsvarer én piksel i x/y. ImageJ vil interpolere automatisk. Hvis dette trinnet ikke utføres riktig, vil de endelige 3D-volumene vises komprimert.
    FORSIKTIG: ECs vil migrere mot kantene av gel og vil danne små Bros teins kolonier. Selv om disse er nyttige for å anslå grensene for hydrogel, vil de forstyrre den endelige bildeanalysen og bør slettes.
    Merk: ImageJ er en Java-basert åpen kildekode bildeanalyse programvare utviklet i konsert av National Institutes of Health og laboratoriet for optisk og beregningsorientert instrumentering. Det anbefales å laste ned Fiji, som er rett og slett ImageJ sammen med nyttige plugins (https://fiji.sc/).
  2. I ImageJ, uskarphet bildet i 3-dimensjoner klikke prosess > filtre > Gaussian Blur 3D og deretter angi Sigma verdiene i alle 3 dimensjoner til 2,0 (denne verdien må kanskje justeres av sluttbrukeren).
  3. I ImageJ, klikker du behandle > binære > gjør Binary og velg deretter en passende terskelverdi algoritme. Den Cross-entropi terskelverdi algoritme utviklet av Li et al. er effektiv i å skille fartøy fra bakgrunnen21. Beregn terskelen for hvert bilde og sette bakgrunnen til "default".
  4. I ImageJ, Fjern falsk støy og fyll inn "hull" i lumen ved å klikke på prosess > støy > fjerne outliers.
    Merk: fjerning av "lyse" outliers vil fylle små hull i tilkoblede fartøy; fjerne "mørk" outliers vil fjerne døde celler. Størrelsen på fjerningen radius vil variere basert på forstørrelsen og størrelsen på fartøyene. For bilder som er hentet med en bred felt målsetting som er 512 x 512 piksler, vil radier vanligvis variere fra 4-6 piksler.
  5. Forarbeide alle ømt punkt (e.g., czi forlengelsen) fil-størrelse og konvertere i. tif fil-størrelse tidligere fremgangsmåte å steg 7,6. For å hjelpe i denne behandlingen, en ImageJ script, "Binarize og filter. ijm" har vært knyttet til dette manuskriptet.
  6. Lagre de behandlede TIF-filene i samme mappe som filen "BatchProcessSkeleton. m", som er tilgjengelig for nedlasting i manuskriptet. Dette skriptet, utviklet av forfatterne, kaller funksjonene utgitt av Phillip Kollmannsberger22 og gjennomfører noen ekstra fil manipulasjon.
  7. Last ned og pakk ut alle filer knyttet til de to hovedfunksjonene "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) og "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d). Lagre alle funksjonene i samme mappe som den åpnede behandlede z-stakken.
  8. Åpne et multi-paradigme numerisk datamiljø (se tabell over materialer) og naviger til mappen der alle filene som er beskrevet ovenfor, er lagret.
  9. Kjør "BatchProcessSkeleton. m" enten ved å skrive BatchProcessSkeleton i kommandovinduet eller ved å åpne skriptet og trykke på Kjør-knappen (høyre vendt grønn pil) i editoren.
    Merk: Hvis du vil analysere et stort datasett med en enkelt kommando, må du kontrollere at strengen inne i dir -funksjonen i linje 6 inneholder en stjerne (for eksempel *. tif). Ellers erstatter du stjernen med filnavnet hvis analysen av en enkelt fil er ønsket.
  10. Hvor lang tid dette skriptet vil ta å utføre vil variere betydelig basert på databehandling strøm tilgjengelig. Det anbefales å utføre denne analysen på en datamaskin med minst 8 GB RAM, slik at brukeren kan få tilgang til andre programmer mens skriptet kjører.
    FORSIKTIG: selv om det ikke strengt nødvendig, grafiske den opprinnelige konfokalmikroskopi oppkjøpet (i grått) og overliggende med dette bildet matrise med skjelettet matrise (i rødt) kan hjelpe i å evaluere ytelsen til skeletonization algoritmen. I tillegg kan leseren lage en Nodal graf, som implementert av Kollmannsberger et al., for å evaluere nøyaktigheten av nettverket analyse. Opprette både grafer, mens nyttig, vil dramatisk øke kjøretiden av skriptet og krever ekstra minne; Hvis brukeren bare krever en endelig topologi analyse og ønsker ikke å visualisere datasettet, bare kommentere ut linjer 44 til 61 (Skeleton graf) og linjer 104 til 143 (topologi graf).
  11. Etter fullføring av data Matrix, som vises i arbeidsområdet, inneholder nå de behandlede dataene. Dobbeltklikk data og åpne denne cellen i variabelen editor.
    1. Merk at denne matrisen vil inneholde, fra venstre til høyre: 1) filnavnet, 2) antall noder (gren poeng + endepunkter), 3) gren poeng, 4) koblinger (dvs. fartøy), 5) nettverks lengde (inkludert isolere fartøy), og 6) antall skiver som finnes i z-stakken. Lagre disse dataene som en CSV-fil og Eksporter for videre analyse til enhver programvare av valget.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter differensiering (figur 1), FACS og innkapsling av IPSC-EPs i kollagen hydrogeler, vil cellene vanligvis forblir avrundet i 24 timer før du begynner å migrere og danne innledende lumen. Etter ca 6 dager med kultur, en primitiv kapillær plexus vil være synlig i hydrogel sett med brightfield mikroskopi (figur 2). Etter Imaging den faste, farget celle-Laden hydrogeler på en konfokalmikroskopi mikroskop (film 1, supplerende film 1), de pre-bearbeidet bildene er konvertert til et skjelett som muliggjør en analyse av den totale lengden og tilkobling av nettverket. Disse kvantitative tiltakene kan deretter brukes til å bestemme hvilke sett med betingelser som er optimale for å produsere robuste vaskulære nettverk.

Denne protokollen gir mulighet for utvikling av en robust, tredimensjonal kapillær plexus som er lydhør overfor lokale fysiske og kjemiske signaler. I tidligere arbeid, har dette nettverket formasjonen vist å være følsomme for matrise tetthet, Matrix stivhet, Matrix metalloprotease hemming, og type og konsentrasjon av ulike angiogenic mitogens20,23.

Figure 1
Figur 1: generering av IPSC-EPs fra Pluripotent stamceller. (A) eksperiment reverserer aldring 19-9-11 iPSCs, som farget positivt for Oct4, ble kultivert i E8 medium supplert med 10 μM Y-27632 rock inhibitor for 48 h. (B) iPSCs ble deretter indusert med 6 ΜM av CHIR99021 i LaSR basal medium for 48 h, noe som peker cellene var positive for Brachyury, en mesoderm markør. (C) cellene ble ytterligere kultivert i LaSR basal Media før de uttrykte CD34, en markør for endothelial forfedre. (D) om lag 15%-25% av de differensiert CELLENE uttrykt CD34. Alle vektstenger representerer lengder på 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: generering og analyse av IPSC-EP vaskulære nettverk i kollagen hydrogeler. (A) et tverrsnitt av 3D-mikromiljøet som brukes i denne analysen for å fremme vaskulær nettverks dannelse fra IPSC-EPs. En flytende kollagen hydrogel er sådd med iPSC-EPs og utsatt for EGM-2 supplert med 50 ng/mL VEGF og en temporal dose av Y-27632. (B) den resulterende kapillær plexus er svært utvidet og sammenkoblet, som visualisere via farging med F-utgangen (cyan). Det binarized bildet, som vises til venstre, genereres ved hjelp av forhåndsbehandling med ImageJ. Denne z-stakken blir deretter analysert via en tidligere utviklet algoritme, som skeletonizes nettverket (vist i en samling av tynne røde linjer) og deretter analyserer nettverkstopologi for grener (gul), endepunkter (blå), isolerte fartøy (svart), og koblet fartøy (rød). Skalaen bar representerer en lengde på 100 m. (C) morfologiske endringer av IPSC-EPS-Laden kollagen hydrogeler: 24 h etter seeding, den IPSC-EPS forblir sfærisk og innen 96 h gradvis ta på seg en mer langstrakt fenotype. Videre kultur resulterer i monteringen av lumen som inneholder VE-Cadherin nettverk, som vist i innfelt på 144-h tid punkt. Skala stolpene representerer lengder på 400 μm; grønn = VE-Cadherin, rød = F-utgangen og blå = DAPI. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Movie 1
Film 1: Z-stakken for BLODKAR generert fra IPSC-EPs. Vaskulær nettverk ble fikset, farget med F-utgangen, og visualisere ved å anskaffe z-stabler på et konfokalmikroskopi mikroskop. Sektorene ble anskaffet med intervaller på 17 μm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Tilleggs film 1:3D-gjengivelse av fartøy. Vaskulær nettverk ble fikset, farget med F-utgangen (rød) og VE-cadherin (grønn), og visualisere ved å anskaffe z-stabler på en konfokalmikroskopi mikroskop. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen innebærer langsiktig kultur av celler i tre typer cellekultur medier: E8, LaSR basal, og EGM-2. Derfor bør det utvises stor forsiktighet for å sterilisere alle materialer på riktig måte. I tillegg bør laboratorie kåper og etanol-rengjort hansker alltid brukes når du arbeider i laboratoriet er laminær Flow Hood. Det anbefales å ofte teste for mycoplasma forurensning; Hvis en stor mengde rusk er observert under iPSC kultur eller et plutselig fall i differensiering effektivitet er notert, mycoplasma forurensning er en sannsynlig årsak. iPSC-EPs generert med denne protokollen har en tendens til å sette inn en betydelig mengde ECM, som forlenger dissosiasjon tid og fører til at én celle suspensjonen å skille i små klumper. Ikke bruk Trypsin-EDTA (0,25%), da løsningen kan forstyrre CD34 epitopes på iPSC-EPs. Imidlertid kan behandling med kollagenase/dispase løsning fjerne avsatt ECM og lette dissosiasjon med en standard celle avløsning løsning. Etter omfattende dissosiasjon, kan noen små klumper av celler og ECM forbli; fjerne disse klumper med en P100 pipette spissen, som de sannsynligvis vil tette cellen siler eller forstyrre FACS.

Pluripotent stamceller er følsomme for dissosiasjon og vil gjennomgå apoptose i en enkelt celle suspensjon med mindre en ROCK inhibitor (vanligvis Y-27632) er lagt til mediet24. iPSC-EPs er også følsomme for dissosiasjon; inkludert Y-27632 ved 10 μM for den første 24 h av kultur er viktig å øke celle overlevelse og spredning. Derfor er det viktig at en ROCK-hemmer er inkludert i både hydrogel og det omliggende mediet umiddelbart etter FACS. Seeding tettheten av iPSC-EPs også betydelig virkninger fartøy utvikling og total nettverks størrelse. Vanligvis er en konsentrasjon av 500 000 celler/mL til 3 000 000 celler/mL et passende område for seeding tetthet. En ytterligere økning i seeding tetthet fører ofte til hydrogel komprimering og celle død.

Tettheten av ECM strukturelle proteiner har blitt funnet å ha en betydelig innvirkning på utviklingen av konstruert microvasculature25,26. Vanligvis, øke tettheten av en ECM-basert hydrogel (ofte kollagen eller fibrin) begrenser vaskulær nettverks lengde og tilkobling. Derfor er det viktig at nøye oppmerksomhet er betalt til kollagen matrise tetthet; konsentrasjoner under 2 mg/mL fremmer prematur proteolytiske degradering av kollagen hydrogeler, noe som resulterer i en uopprettelig tap av hydrogel strukturelle integritet. I kontrast, konsentrasjoner over 4 mg/mL induserer dannelse av korte, brede lumen som viser dårlig tilkobling; hydrogel fleksibilitet og en endring i pore størrelse er primært ansvarlig for denne opphevelsen20.

Acellular og celle-Laden kollagen hydrogeler ikke binder til ultra-lav feste platene; hydrogeler tendens til å forbli suspendert i Media og vil tidvis flyte til toppen av brønnen. Hvis vev kultur-behandlet platene er ansatt i denne protokollen, den innebygde forfedre vil migrere til bunnen av brønnen og vil danne en nær confluent monolag på bunnen av platen. Den resulterende reduksjonen i celle seeding tetthet hemmer monteringen av disse forfedre i 3D-nettverk. I tillegg, hvis hydrogeler er støpt inn i brønnene av en vev kultur behandlet plate, vil de svakt binde den indre overflaten av brønnen; Denne bindingen gjelder belastningen på hydrogel. Siden denne plattformen ble utviklet for å isolere betydningen av fysiske og kjemiske signaler, er det avgjørende at ingen uvedkommende krefter er formidles til cellene27. Det flytende hydrogeler kanskje være vanskelig å mate fordi det meste av cellen kulturen Media Lies neden hydrogel; å overvinne dette, vippe platen og bruke en P100 pipette å fjerne medier fra siden av veggen.

Når Imaging de vaskulære nettverkene på et konfokalmikroskopi mikroskop, er det viktig å følge alle vasketrinn for å sikre at overflødig fluoroforen ikke resulterer i et lavt signal til støyforhold. Overflødig fluorescens kan forvirre standard terskelverdi algoritmer og gjøre z-stakken vanskelig å binarize. For å løse dette problemet, bruk phalloidin, et fungal giftstoff som selektivt etiketter F-utgangen og viser begrenset off-målet bindende. Generelt, bruk primære antistoffer som har vært pre-bøyd til et sekundært antistoff å begrense konsentrasjonen av frie fluoroforen som diffunderer gjennom gel. Ved generering av z-stabler en skive dybde på 10-20 mikron anbefales å balansere tiden som trengs for å anskaffe en z-stack mot behovet for et høyoppløselig bilde.

Her beskrives en kvantitativ analyse for å vurdere det vasculogenic potensialet til iPSC-EPs i 3D-microenvironments. Denne analysen benytter åpen kildekode-programvare og er upåvirket av brukerens fordommer. Likevel representerer det en unyansert modell av fysiologiske vaskulær nisje. Mens iPSC-EPs kan differensiere til cellene som trengs for modne, funksjonelle blodkar, denne analysen forsømmer bidrag fra andre celletyper (f. eks fibroblaster og makrofager) som deltar i vasculogenic prosesser. Videre er dette systemet statisk og ikke utsette utvikle fartøy å flyte. Til slutt, mens kollagen jeg er en av de dominerende proteinene i ECM28 og opprettholder sin fibrillær arkitektur in vitro, er det mye avhengig og er begrenset til svake fysiske Cross Linking når nøytralisert ved høye temperaturer. Til tross for disse begrensningene, representerer denne analysen et betydelig skritt fremover i søken til ingeniør funksjonelle blodkar for hjerte-og karsykdommer terapi og modellering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association (Grant nummer 15SDG25740035, tildelt J.Z.), National Institute of Biomedical Imaging og bioteknologi (NIBIB) av National Institutes of Health (Grant nummer EB007507, tildelt C.C.), og Alliansen for regenererende rehabilitering forskning & Training (AR3T, gi nummer 1 P2C HD086843-01, tildelt J.Z.). Vi ønsker å erkjenne Prof. Jeanne Stachowiak (The University of Texas i Austin) for hennes tekniske råd om konfokalmikroskopi mikroskopi. Vi er også takknemlige for diskusjoner med Samuel Mihelic (The University of Texas at Austin), Dr. Alicia Allen (The University of Texas i Austin), Dr. Julie Rytlewski (Adaptive Biotech), og Dr. Leon Bellan (Vanderbilt University) for sin innsikt i beregningsorientert analyse av 3D-nettverk. Til slutt takker vi Dr. Xiaoping Bao (University of California, Berkeley) for hans råd om å skille iPSCs inn i iPSC-EPs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Slide Angiogenesis Ibidi N/A A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile Corning 7007 Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish
Accutase STEMCELL Technologies 7920 Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS
Advanced DMEM/F12 Thermo Scientific 12634010 The base media for iPSC-EP differentiation. 
Barnstead GenPure xCAD Plus  Thermo Fisher Scientific 50136165 Water purification system; others can be readily substituted
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture Fisher Scientific A8412 To preserve cell viability when FACs sorting
CD34-PE, human (clone: AC136) Miltenyi Biotec 130-098-140 Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs
CHIR99021 LC Laboratories C-6556 Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg VWR 354249 Main component of the 3D microenvironment
Conical centrifuge tubes (15/50 mL) Fisher Scientific 14-959-49D/A Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306 To counterstain and visualize cell nuclei
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11320-082 For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) ThermoFisher 14190-250 To wash monolayer cultures
EDTA Sigma-Aldrich E8008 For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCell C-22011 Promotes endothelial cell viability and proliferation
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001   For maintenance of pluripotent stem cells
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) Sigma-Aldrich 50046 Neutralizes remaining detergent
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% Sigma-Aldrich A8960 Component of iPSC-EP differentiation medium
MATLAB MathWorks 1.8.0_152 Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) Fisher Scientific 356231 Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation
Medium-199 10X Thermo Fisher Scientific 1825015 Used to balance final hydrogel osmolarity and pH
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) VWR 87003-294 Stores small volumes of reagents
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P3813 The main ingredient of the immunostaining solutions
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument
Recombinant Human VEGF 165 Protein R&D Systems 293-VE Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis
Rhodamine phalloidin Themo Fisher Scientific R415 To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks
Triton X-100 (nonionic surfactant) Sigma-Aldrich X-100 Detergent used to gently permeabilize cells
Tween-20 (emulsifying reagent) Fisher Scientific BP337 Increases the binding specificity of the added antibodies
VE-Cadherin (F-8) Santa Cruz Biotechnology sc-9989  To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels
Vitronectin ThermoFisher A14700 For maintenance of pluripotent stem cells
Y-27632 Selleck Chemicals S1049 Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, K., Lin, R. -Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
  2. Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues. Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).
  3. Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. A. Design principles for therapeutic angiogenic materials. Nature Reviews Materials. 1 (1), 1-15 (2016).
  4. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: State of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
  5. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
  6. Nakatsu, M. N., et al. VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model. Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).
  7. Shamloo, A., Heilshorn, S. C. Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients. Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).
  8. Jeon, J. S., et al. Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems. Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).
  9. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  10. Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).
  11. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
  12. Kusuma, S., Shen, Y. -I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).
  13. Charwat, V., et al. Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures. Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).
  14. Holnthoner, W., et al. Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).
  15. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).
  16. Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).
  17. Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. J. Three-dimensional image quantification as a new morphometry method for tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (7), 507-516 (2012).
  18. Kerschnitzki, M., et al. Architecture of the osteocyte network correlates with bone material quality. Journal of Bone and Mineral Research. 28 (8), 1837-1845 (2013).
  19. Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via Wnt activation under defined conditions. Wnt Signaling: Methods and Protocols. 1481 (1), 183-196 (2016).
  20. Crosby, C. O., et al. Quantifying the vasculogenic potential of iPSC-derived endothelial progenitors in collagen hydrogels. Tissue Engineering Part A. , In press (2019).
  21. Li, C. H., Tam, P. K. S. An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding. Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).
  22. Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone. New Journal of Physics. 19 (7), (2017).
  23. Crosby, C. O., Zoldan, J. Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials. Regenerative Biomaterials. , In press (2019).
  24. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  25. Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).
  26. Ghajar, C. M., et al. The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis. Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).
  27. Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction. Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).
  28. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).

Tags

Utviklingsbiologi stilk cellen endothelial stamfar vasculogenesis ekstracellulære matrise kollagen beregningsorientert analyse fartøy nettverk
En in vitro 3D modell og beregningsorientert rørledning å kvantifisere det Vasculogenic potensialet av iPSC-avledet endothelial forfedre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crosby, C. O., Zoldan, J. An In… More

Crosby, C. O., Zoldan, J. An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors. J. Vis. Exp. (147), e59342, doi:10.3791/59342 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter