Summary

En in vitro 3D-model og beregnings ledning til kvantificering af det Vasculogeniske potentiale af iPSC-afledte Endotelafprogenitorer

Published: May 13, 2019
doi:

Summary

Endotheliale progenitorer afledt af inducerede pluripotente stamceller (iPSC-EPs) har potentialet til at revolutionere kardiovaskulære sygdoms behandlinger og gøre det muligt at skabe mere trofaste kardiovaskulære sygdomsmodeller. Heri beskrives indkapsling af iPSC-EPs i tredimensionale (3D) kollagenmikromiljøer og en kvantitativ analyse af disse cellers vasculogeniske potentiale.

Abstract

Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) er en patientspecifik, proliferativ celle kilde, der kan differentiere sig til enhver somatisk celletype. Bipotente endotheliale progenitorer (EPs), som kan differentiere sig i de celletyper, der er nødvendige for at samle moden, funktionel vaskulatur, er afledt af både embryonale og inducerede pluripotente stamceller. Men, disse celler er ikke blevet nøje evalueret i tredimensionale miljøer, og en kvantitativ måling af deres vasculogenic potentiale forbliver undvigende. Her er generering og isolering af iPSC-EPs via fluorescerende aktiveret celle sortering først skitseret, efterfulgt af en beskrivelse af indkapsling og kultur af iPSC-EPs i kollagen hydrogels. Dette ekstracellulære matrix (ECM)-mimicking mikromiljø tilskynder en robust vasculogenic respons; vaskulære netværk danner efter en uges kultur. Oprettelsen af en beregningsmæssige pipeline, der udnytter open source-software til at kvantificere denne vasculogenic respons er afgrænset. Denne rørledning er specielt designet til at bevare den 3D-arkitektur af kapillar plexus til robust at identificere antallet af grene, forgrenings punkter, og den samlede netværks længde med minimal brugerinput.

Introduction

Humane navle formede vene endotelceller (HUVECs) og andre primære endotelcelle typer er blevet udnyttet i to årtier til model blodkar spiring og udvikling in vitro1. Sådanne vaskulære platforme lover at belyse molekylære og vævs-niveau mekanismer af hjerte-kar-sygdom og kan præsentere fysiologisk indsigt i udviklingen af primitive vaskulære netværk2,3. Selvom feltet af vaskulær modellering har været vidne til betydelige fremskridt, en “guld standard” assay, der kan kvantitativt model og vurdere fysiologiske vaskulære udvikling forbliver undvigende. De fleste offentliggjorte protokoller ikke i tilstrækkelig grad rekapitulere den vaskulære niche til at fremme dannelsen af modne, funktionelle blodkar eller ikke har en metode til kvantitativt at sammenligne vasculogenic potentiale af de vurderede celletyper i tre dimensioner ( 3D).

Mange nuværende vaskulære modeller er begrænset i deres evne til at efterligne den fysiologiske vaskulære niche. En af de mest almindeligt anvendte in vitro-platforme er den gelatinøse protein blandings baserede rørdannelses analyse. Kort, HUVECs er seedet som enkeltceller på et tyndt lag af gel, der består af proteiner høstet fra murine sarkom ekstracellulær matrix (ECM); inden for en til to dage, HUVECs selv samles i primitive rør4. Denne proces forekommer dog i to dimensioner (2D), og endotelcellerne (ECs), der anvendes i denne analyse, danner ikke indesluttet, hule lumen og begrænser derved den fysiologiske betydning af disse undersøgelser. For nylig er ECs og understøttende celler (f. eks. mesenchymal stamceller (MSCS) og pericytes) blevet Co-dyrket i 3D-mikromiljøer, der simulerer den lokale ECM-fiber arkitektur, såsom kollagen eller fibrin silicagelrogeler5. At modellere vaskulære udvikling i dette mikromiljø, polymere perler belagt med ECs er typisk ansat6. Tilføjelsen af eksogene vækstfaktorer og/eller vækstfaktorer udskillet af andre celler interstitielt indlejret i hydrogel kan inducere ECs, belægning af polymere perler, at spire og danne enkelt lumen; antallet og diameteren af spirer og fartøjer kan derefter beregnes. Men disse spirer er ental og ikke danner en lukket, forbundet netværk som ses i fysiologiske forhold og dermed er mere minder om en tumor Vaskulaturen model. Microfluidic enheder er også blevet udnyttet til at efterligne den vaskulære niche og til at fremme dannelsen af Vaskulaturen i EC-laden silicagelrogeler7,8. Typisk påføres en angiogen vækstfaktor-gradient på det cirkulerende cellekulturmedium for at inducere EF-migration og spiring. ECs, der udgør lumen af udviklede fartøjer er følsomme over for forskydnings stress induceret af anvendelsen af fluid flow gennem mikrofluidisk enhed; således, disse mikrofluidisk enheder fange vigtige fysiologiske parametre, der ikke er tilgængelige i de statiske modeller. Men, disse enheder kræver dyre mikrofabrikation evner.

Vigtigst af alt, alle tre vaskulære modeller (2D, 3D, microfluidic) overvældende udnytte primære ECs samt primære understøttende celletyper. Primære celler kan ikke udvikles til en effektiv kardiovaskulær behandling, fordi cellerne vil skabe en immunrespons ved implantation; Desuden er Huvec’er og lignende primære celletyper ikke patientspecifikke og indfanger ikke vaskulære abnormaliteter, der forekommer hos patienter med genetisk disposition eller allerede eksisterende helbredstilstande, f. eks. Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) er dukket op i det seneste årti som en patientspecifik, proliferativ celle kilde, der kan differentieres i alle somatiske celler i den menneskelige krop9. Navnlig er der offentliggjort protokoller, som skitserer dannelse og isolering af iPSC-afledte endotelorer (iPSC-EPs)10,11; iPSC-EPs er bipotent og kan derfor være yderligere differentieret i endotelceller og glatte muskelceller/pericytes, byggestenene i moden, funktionel vaskulatur. Kun én undersøgelse har overbevisende beskrevet udviklingen af en primær kapillar plexus fra iPSC-EPs i et 3D-mikromiljø12; selv om denne undersøgelse er afgørende for en forståelse af iPSC-EP forsamling og differentiering i naturlige og syntetiske hydrogels, det ikke kvantitativt sammenligne nettopologier af den resulterende Vaskulaturen. En anden nylig undersøgelse har brugt den polymere perle model til at sammenligne spiring af HUVECs og iPSC-afledte ECs5. Derfor er der et klart behov for yderligere at belyse de fysiske og kemiske signalerings mekanismer, der regulerer iPSC-EP vasculogenesis i 3D-mikromiljøer, og for at afgøre, om disse celler egner sig til iskæmisk behandling og Kardiovaskulær sygdom Modellering.

I det seneste årti, forskellige open-source beregningsmæssige pipelines og skeletonization algoritmer er blevet udviklet til at kvantificere og sammenligne vaskulære netværk længde og tilslutningsmuligheder. For eksempel, charwat et al. udviklet en Photoshop-baserede pipeline til at udtrække en filtreret, binarized billede af vaskulære netværk afledt af en co-kultur af Adipose-afledte stamceller og udvækst ECs i en fibrin matrix13,14. Måske den mest udbredte topologi sammenligning værktøj er AngioTool, et program offentliggjort online af National Cancer Institute15; på trods af programmets udbredte vedtagelse og veldokumenteret troskab, programmet er begrænset til at analysere fartøj-lignende strukturer i to dimensioner og andre programmer, herunder AngioSys og Wimasis, deler den samme dimensionalitet begrænsning16. Kraftfulde software suiter som Imaris, Lucis og Metamorph er blevet udviklet til at analysere netværkstopologien af manipuleret mikrovaskulatur; men disse suiter er cost-prohibitive for de fleste akademiske laboratorier og begrænse adgangen til kildekoden, som kan hæmme muligheden for slutbrugeren til at tilpasse algoritmen til deres specifikke anvendelse. 3D slicer, en open source magnetisk resonans imaging/computertomografi pakke, indeholder en vaskulær modellering Toolkit, der effektivt kan analysere topologi af 3D vaskulære netværk17; Men, analysen er afhængig af brugeren manuelt placere slutpunkter af netværket, som kan blive kedelig, når du analyserer et stort datasæt og kan påvirkes af brugerens underbevidste bias. I dette manuskript er en beregnings pipeline, der kan kvantificere 3D-vaskulære netværk, beskrevet i detaljer. For at overvinde de ovenfor skitserede begrænsninger, bruger denne open source Computational pipeline ImageJ til at forbehandle erhvervede confokale billeder for at indlæse 3D-volumen i en skelet analysator. Skelet analysatoren bruger en parallel mediale-akse udtynding algoritme, og blev oprindeligt udviklet af Kerschnitzki et al. at analysere længden og forbindelsen af osteocyte Networks18; denne algoritme kan effektivt anvendes til at karakterisere længden og konnektivitet af manipuleret microvasculature.

I alt, denne protokol skitserer oprettelsen af microvaskulære netværk i 3D mikromiljøer og giver en open-source og User-bias gratis Computational pipeline til let sammenligne vasculogenic potentiale af iPSC-EPs.

Protocol

1. forberedelse af kultur medier og belægnings opløsninger For at tilberede vitronectin-belægnings opløsningen fortyndes vitronectin 1:100 i Dulbecco’s fosfat-bufferet saltvand (DPBS).Forsigtig: når det er fortyndet, anbefales det ikke at opbevare denne løsning til fremtidig brug. Ved modtagelse af phenolfri vækstfaktor-reduceret gelatinøs protein blanding (Se tabel over materialer) fra producenten, tø på is ved 4 °c, indtil blandingen er gennemsigtig og flydende. Hvis …

Representative Results

Efter differentiering (figur 1), facer og indkapsling af IPSC-EPS i kollagen hydrogels, cellerne vil typisk forblive afrundet til 24 h før du begynder at migrere og danne indledende lumen. Efter ca. 6 dages kultur vil en primitiv kapillær plexus være synlig i hydrogel, når den ses med lysfelt mikroskopi (figur 2). Efter at have afbildet de faste, farvede, celle belastede silicagelrogeler på et confokalt mikroskop (fi…

Discussion

Denne protokol omfatter den langsigtede kultur af celler i tre typer af cellekultur medier: E8, LaSR basal, og EGM-2. Derfor bør man være meget forsigtig med at sterilisere alle materialer korrekt. Derudover bør laboratorie frakker og ethanol-rengjorte handsker altid bæres, når de arbejder i laboratoriets laminar flow hætte. Det anbefales ofte at teste for Mycoplasma kontaminering; Hvis der observeres en stor mængde snavs under iPSC-kulturen eller et pludseligt fald i differentierings effektiviteten, er Mycoplasma…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af American Heart Association (tilskudsnummer 15SDG25740035, tildelt J.Z.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) af National Institutes of Health (tilskudsnummer EB007507, tildelt C.C.), og Alliancen for regenerativ rehabiliterings forskning & uddannelse (AR3T, Grant nummer 1 P2C HD086843-01, tildelt J.Z.). Vi vil gerne anerkende Prof. Jeanne Stachowiak (University of Texas i Austin) for hendes tekniske rådgivning om confokal mikroskopi. Vi er også taknemmelige for diskussioner med Samuel Mihelic (University of Texas i Austin), Dr. Alicia Allen (University of Texas at Austin), Dr. Julie Rytlewski (adaptive Biotech), og Dr. Leon Bellan (Vanderbilt University) for deres indsigt i beregningsmæssige analyse af 3D-netværk. Endelig takker vi Dr. Xiaoping Bao (University of California, Berkeley) for hans råd om differentiering iPSCs i iPSC-EPs.

Materials

µ-Slide Angiogenesis Ibidi N/A A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile Corning 7007 Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish
Accutase STEMCELL Technologies 7920 Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS
Advanced DMEM/F12 Thermo Scientific 12634010 The base media for iPSC-EP differentiation. 
Barnstead GenPure xCAD Plus  Thermo Fisher Scientific 50136165 Water purification system; others can be readily substituted
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture Fisher Scientific A8412 To preserve cell viability when FACs sorting
CD34-PE, human (clone: AC136) Miltenyi Biotec 130-098-140 Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs
CHIR99021 LC Laboratories C-6556 Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg VWR 354249 Main component of the 3D microenvironment
Conical centrifuge tubes (15/50 mL) Fisher Scientific 14-959-49D/A Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306 To counterstain and visualize cell nuclei
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11320-082 For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) ThermoFisher 14190-250 To wash monolayer cultures
EDTA Sigma-Aldrich E8008 For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCell C-22011 Promotes endothelial cell viability and proliferation
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001   For maintenance of pluripotent stem cells
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) Sigma-Aldrich 50046 Neutralizes remaining detergent
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% Sigma-Aldrich A8960 Component of iPSC-EP differentiation medium
MATLAB MathWorks 1.8.0_152 Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) Fisher Scientific 356231 Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation
Medium-199 10X Thermo Fisher Scientific 1825015 Used to balance final hydrogel osmolarity and pH
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) VWR 87003-294 Stores small volumes of reagents
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P3813 The main ingredient of the immunostaining solutions
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument
Recombinant Human VEGF 165 Protein R&D Systems 293-VE Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis
Rhodamine phalloidin Themo Fisher Scientific R415 To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks
Triton X-100 (nonionic surfactant) Sigma-Aldrich X-100 Detergent used to gently permeabilize cells
Tween-20 (emulsifying reagent) Fisher Scientific BP337 Increases the binding specificity of the added antibodies
VE-Cadherin (F-8) Santa Cruz Biotechnology sc-9989  To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels
Vitronectin ThermoFisher A14700 For maintenance of pluripotent stem cells
Y-27632 Selleck Chemicals S1049 Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded

References

  1. Wang, K., Lin, R. -. Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
  2. Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues. Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).
  3. Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. A. Design principles for therapeutic angiogenic materials. Nature Reviews Materials. 1 (1), 1-15 (2016).
  4. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: State of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
  5. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
  6. Nakatsu, M. N., et al. VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model. Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).
  7. Shamloo, A., Heilshorn, S. C. Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients. Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).
  8. Jeon, J. S., et al. Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems. Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).
  9. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  10. Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).
  11. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
  12. Kusuma, S., Shen, Y. -. I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).
  13. Charwat, V., et al. Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures. Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).
  14. Holnthoner, W., et al. Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).
  15. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).
  16. Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).
  17. Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. J. Three-dimensional image quantification as a new morphometry method for tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (7), 507-516 (2012).
  18. Kerschnitzki, M., et al. Architecture of the osteocyte network correlates with bone material quality. Journal of Bone and Mineral Research. 28 (8), 1837-1845 (2013).
  19. Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via Wnt activation under defined conditions. Wnt Signaling: Methods and Protocols. 1481 (1), 183-196 (2016).
  20. Crosby, C. O., et al. Quantifying the vasculogenic potential of iPSC-derived endothelial progenitors in collagen hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2019).
  21. Li, C. H., Tam, P. K. S. An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding. Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).
  22. Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone. New Journal of Physics. 19 (7), (2017).
  23. Crosby, C. O., Zoldan, J. Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials. Regenerative Biomaterials. , (2019).
  24. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  25. Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).
  26. Ghajar, C. M., et al. The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis. Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).
  27. Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction. Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).
  28. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).

Play Video

Cite This Article
Crosby, C. O., Zoldan, J. An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors. J. Vis. Exp. (147), e59342, doi:10.3791/59342 (2019).

View Video