Endotheliale progenitorer afledt af inducerede pluripotente stamceller (iPSC-EPs) har potentialet til at revolutionere kardiovaskulære sygdoms behandlinger og gøre det muligt at skabe mere trofaste kardiovaskulære sygdomsmodeller. Heri beskrives indkapsling af iPSC-EPs i tredimensionale (3D) kollagenmikromiljøer og en kvantitativ analyse af disse cellers vasculogeniske potentiale.
Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) er en patientspecifik, proliferativ celle kilde, der kan differentiere sig til enhver somatisk celletype. Bipotente endotheliale progenitorer (EPs), som kan differentiere sig i de celletyper, der er nødvendige for at samle moden, funktionel vaskulatur, er afledt af både embryonale og inducerede pluripotente stamceller. Men, disse celler er ikke blevet nøje evalueret i tredimensionale miljøer, og en kvantitativ måling af deres vasculogenic potentiale forbliver undvigende. Her er generering og isolering af iPSC-EPs via fluorescerende aktiveret celle sortering først skitseret, efterfulgt af en beskrivelse af indkapsling og kultur af iPSC-EPs i kollagen hydrogels. Dette ekstracellulære matrix (ECM)-mimicking mikromiljø tilskynder en robust vasculogenic respons; vaskulære netværk danner efter en uges kultur. Oprettelsen af en beregningsmæssige pipeline, der udnytter open source-software til at kvantificere denne vasculogenic respons er afgrænset. Denne rørledning er specielt designet til at bevare den 3D-arkitektur af kapillar plexus til robust at identificere antallet af grene, forgrenings punkter, og den samlede netværks længde med minimal brugerinput.
Humane navle formede vene endotelceller (HUVECs) og andre primære endotelcelle typer er blevet udnyttet i to årtier til model blodkar spiring og udvikling in vitro1. Sådanne vaskulære platforme lover at belyse molekylære og vævs-niveau mekanismer af hjerte-kar-sygdom og kan præsentere fysiologisk indsigt i udviklingen af primitive vaskulære netværk2,3. Selvom feltet af vaskulær modellering har været vidne til betydelige fremskridt, en “guld standard” assay, der kan kvantitativt model og vurdere fysiologiske vaskulære udvikling forbliver undvigende. De fleste offentliggjorte protokoller ikke i tilstrækkelig grad rekapitulere den vaskulære niche til at fremme dannelsen af modne, funktionelle blodkar eller ikke har en metode til kvantitativt at sammenligne vasculogenic potentiale af de vurderede celletyper i tre dimensioner ( 3D).
Mange nuværende vaskulære modeller er begrænset i deres evne til at efterligne den fysiologiske vaskulære niche. En af de mest almindeligt anvendte in vitro-platforme er den gelatinøse protein blandings baserede rørdannelses analyse. Kort, HUVECs er seedet som enkeltceller på et tyndt lag af gel, der består af proteiner høstet fra murine sarkom ekstracellulær matrix (ECM); inden for en til to dage, HUVECs selv samles i primitive rør4. Denne proces forekommer dog i to dimensioner (2D), og endotelcellerne (ECs), der anvendes i denne analyse, danner ikke indesluttet, hule lumen og begrænser derved den fysiologiske betydning af disse undersøgelser. For nylig er ECs og understøttende celler (f. eks. mesenchymal stamceller (MSCS) og pericytes) blevet Co-dyrket i 3D-mikromiljøer, der simulerer den lokale ECM-fiber arkitektur, såsom kollagen eller fibrin silicagelrogeler5. At modellere vaskulære udvikling i dette mikromiljø, polymere perler belagt med ECs er typisk ansat6. Tilføjelsen af eksogene vækstfaktorer og/eller vækstfaktorer udskillet af andre celler interstitielt indlejret i hydrogel kan inducere ECs, belægning af polymere perler, at spire og danne enkelt lumen; antallet og diameteren af spirer og fartøjer kan derefter beregnes. Men disse spirer er ental og ikke danner en lukket, forbundet netværk som ses i fysiologiske forhold og dermed er mere minder om en tumor Vaskulaturen model. Microfluidic enheder er også blevet udnyttet til at efterligne den vaskulære niche og til at fremme dannelsen af Vaskulaturen i EC-laden silicagelrogeler7,8. Typisk påføres en angiogen vækstfaktor-gradient på det cirkulerende cellekulturmedium for at inducere EF-migration og spiring. ECs, der udgør lumen af udviklede fartøjer er følsomme over for forskydnings stress induceret af anvendelsen af fluid flow gennem mikrofluidisk enhed; således, disse mikrofluidisk enheder fange vigtige fysiologiske parametre, der ikke er tilgængelige i de statiske modeller. Men, disse enheder kræver dyre mikrofabrikation evner.
Vigtigst af alt, alle tre vaskulære modeller (2D, 3D, microfluidic) overvældende udnytte primære ECs samt primære understøttende celletyper. Primære celler kan ikke udvikles til en effektiv kardiovaskulær behandling, fordi cellerne vil skabe en immunrespons ved implantation; Desuden er Huvec’er og lignende primære celletyper ikke patientspecifikke og indfanger ikke vaskulære abnormaliteter, der forekommer hos patienter med genetisk disposition eller allerede eksisterende helbredstilstande, f. eks. Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) er dukket op i det seneste årti som en patientspecifik, proliferativ celle kilde, der kan differentieres i alle somatiske celler i den menneskelige krop9. Navnlig er der offentliggjort protokoller, som skitserer dannelse og isolering af iPSC-afledte endotelorer (iPSC-EPs)10,11; iPSC-EPs er bipotent og kan derfor være yderligere differentieret i endotelceller og glatte muskelceller/pericytes, byggestenene i moden, funktionel vaskulatur. Kun én undersøgelse har overbevisende beskrevet udviklingen af en primær kapillar plexus fra iPSC-EPs i et 3D-mikromiljø12; selv om denne undersøgelse er afgørende for en forståelse af iPSC-EP forsamling og differentiering i naturlige og syntetiske hydrogels, det ikke kvantitativt sammenligne nettopologier af den resulterende Vaskulaturen. En anden nylig undersøgelse har brugt den polymere perle model til at sammenligne spiring af HUVECs og iPSC-afledte ECs5. Derfor er der et klart behov for yderligere at belyse de fysiske og kemiske signalerings mekanismer, der regulerer iPSC-EP vasculogenesis i 3D-mikromiljøer, og for at afgøre, om disse celler egner sig til iskæmisk behandling og Kardiovaskulær sygdom Modellering.
I det seneste årti, forskellige open-source beregningsmæssige pipelines og skeletonization algoritmer er blevet udviklet til at kvantificere og sammenligne vaskulære netværk længde og tilslutningsmuligheder. For eksempel, charwat et al. udviklet en Photoshop-baserede pipeline til at udtrække en filtreret, binarized billede af vaskulære netværk afledt af en co-kultur af Adipose-afledte stamceller og udvækst ECs i en fibrin matrix13,14. Måske den mest udbredte topologi sammenligning værktøj er AngioTool, et program offentliggjort online af National Cancer Institute15; på trods af programmets udbredte vedtagelse og veldokumenteret troskab, programmet er begrænset til at analysere fartøj-lignende strukturer i to dimensioner og andre programmer, herunder AngioSys og Wimasis, deler den samme dimensionalitet begrænsning16. Kraftfulde software suiter som Imaris, Lucis og Metamorph er blevet udviklet til at analysere netværkstopologien af manipuleret mikrovaskulatur; men disse suiter er cost-prohibitive for de fleste akademiske laboratorier og begrænse adgangen til kildekoden, som kan hæmme muligheden for slutbrugeren til at tilpasse algoritmen til deres specifikke anvendelse. 3D slicer, en open source magnetisk resonans imaging/computertomografi pakke, indeholder en vaskulær modellering Toolkit, der effektivt kan analysere topologi af 3D vaskulære netværk17; Men, analysen er afhængig af brugeren manuelt placere slutpunkter af netværket, som kan blive kedelig, når du analyserer et stort datasæt og kan påvirkes af brugerens underbevidste bias. I dette manuskript er en beregnings pipeline, der kan kvantificere 3D-vaskulære netværk, beskrevet i detaljer. For at overvinde de ovenfor skitserede begrænsninger, bruger denne open source Computational pipeline ImageJ til at forbehandle erhvervede confokale billeder for at indlæse 3D-volumen i en skelet analysator. Skelet analysatoren bruger en parallel mediale-akse udtynding algoritme, og blev oprindeligt udviklet af Kerschnitzki et al. at analysere længden og forbindelsen af osteocyte Networks18; denne algoritme kan effektivt anvendes til at karakterisere længden og konnektivitet af manipuleret microvasculature.
I alt, denne protokol skitserer oprettelsen af microvaskulære netværk i 3D mikromiljøer og giver en open-source og User-bias gratis Computational pipeline til let sammenligne vasculogenic potentiale af iPSC-EPs.
Denne protokol omfatter den langsigtede kultur af celler i tre typer af cellekultur medier: E8, LaSR basal, og EGM-2. Derfor bør man være meget forsigtig med at sterilisere alle materialer korrekt. Derudover bør laboratorie frakker og ethanol-rengjorte handsker altid bæres, når de arbejder i laboratoriets laminar flow hætte. Det anbefales ofte at teste for Mycoplasma kontaminering; Hvis der observeres en stor mængde snavs under iPSC-kulturen eller et pludseligt fald i differentierings effektiviteten, er Mycoplasma…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af American Heart Association (tilskudsnummer 15SDG25740035, tildelt J.Z.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) af National Institutes of Health (tilskudsnummer EB007507, tildelt C.C.), og Alliancen for regenerativ rehabiliterings forskning & uddannelse (AR3T, Grant nummer 1 P2C HD086843-01, tildelt J.Z.). Vi vil gerne anerkende Prof. Jeanne Stachowiak (University of Texas i Austin) for hendes tekniske rådgivning om confokal mikroskopi. Vi er også taknemmelige for diskussioner med Samuel Mihelic (University of Texas i Austin), Dr. Alicia Allen (University of Texas at Austin), Dr. Julie Rytlewski (adaptive Biotech), og Dr. Leon Bellan (Vanderbilt University) for deres indsigt i beregningsmæssige analyse af 3D-netværk. Endelig takker vi Dr. Xiaoping Bao (University of California, Berkeley) for hans råd om differentiering iPSCs i iPSC-EPs.
µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | N/A | A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging |
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile | Corning | 7007 | Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish |
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS |
Advanced DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634010 | The base media for iPSC-EP differentiation. |
Barnstead GenPure xCAD Plus | Thermo Fisher Scientific | 50136165 | Water purification system; others can be readily substituted |
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture | Fisher Scientific | A8412 | To preserve cell viability when FACs sorting |
CD34-PE, human (clone: AC136) | Miltenyi Biotec | 130-098-140 | Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs |
CHIR99021 | LC Laboratories | C-6556 | Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells |
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg | VWR | 354249 | Main component of the 3D microenvironment |
Conical centrifuge tubes (15/50 mL) | Fisher Scientific | 14-959-49D/A | Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | To counterstain and visualize cell nuclei |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-250 | To wash monolayer cultures |
EDTA | Sigma-Aldrich | E8008 | For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting |
Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Promotes endothelial cell viability and proliferation |
Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For maintenance of pluripotent stem cells |
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) | Sigma-Aldrich | 50046 | Neutralizes remaining detergent |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% | Sigma-Aldrich | A8960 | Component of iPSC-EP differentiation medium |
MATLAB | MathWorks | 1.8.0_152 | Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions) |
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) | Fisher Scientific | 356231 | Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation |
Medium-199 10X | Thermo Fisher Scientific | 1825015 | Used to balance final hydrogel osmolarity and pH |
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | VWR | 87003-294 | Stores small volumes of reagents |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | The main ingredient of the immunostaining solutions |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument |
Recombinant Human VEGF 165 Protein | R&D Systems | 293-VE | Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis |
Rhodamine phalloidin | Themo Fisher Scientific | R415 | To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks |
Triton X-100 (nonionic surfactant) | Sigma-Aldrich | X-100 | Detergent used to gently permeabilize cells |
Tween-20 (emulsifying reagent) | Fisher Scientific | BP337 | Increases the binding specificity of the added antibodies |
VE-Cadherin (F-8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels |
Vitronectin | ThermoFisher | A14700 | For maintenance of pluripotent stem cells |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded |