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Developmental Biology

Modelo in vitro 3D e pipeline computacional para quantificar o potencial Vasculogênico de progenitores endoteliais derivados de iPSC

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59342
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin

Summary

Os progenitores endoteliais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC-EPs) têm potencial para revolucionar os tratamentos de doenças cardiovasculares e possibilitar a criação de modelos de doenças cardiovasculares mais fiéis. Nisto, o encapsulamento de iPSC-EPs em microambientes tridimensionais do colagénio (3D) e uma análise quantitativa do potencial vasculogenic destas pilhas são descritos.

Abstract

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são uma fonte de células proliferativa, específica do paciente, que pode se diferenciar em qualquer tipo de célula somática. Os progenitores endothelial bipotentes (EPs), que podem diferenciar-se nos tipos da pilha necessários para montar o vasculature maduro, funcional, foram derivados das pilhas de haste pluripotentes embrionárias e induzidas. Entretanto, estas pilhas não foram avaliadas rigorosa em ambientes tridimensionais, e uma medida quantitativa de seu potencial vasculogenic permanece indescritível. Aqui, a geração e a isolação de iPSC-EPs através da classificação fluorescente-ativada da pilha são esboçadas primeiramente, seguidas por uma descrição do encapsulamento e da cultura de iPSC-EPs em hydrogels do colagénio. Esta matriz extracelular (ECM)-mimicking microambiente incentiva uma resposta vasculogênica robusta; redes vasculares formam-se após uma semana de cultura. A criação de um pipeline computacional que utiliza software de código aberto para quantificar essa resposta vasculogênica é delineada. Este pipeline é projetado especificamente para preservar a arquitetura 3D do plexo capilar para identificar de forma robusta o número de ramificações, pontos de ramificação e o comprimento total da rede com a entrada mínima do usuário.

Introduction

Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e outros tipos de células endoteliais primárias têm sido utilizadas há duas décadas para modelar a germinação e o desenvolvimento de vasos sanguíneos in vitro1. Tais plataformas vasculares prometem iluminar mecanismos de nível molecular e tecidual de doenças cardiovasculares e podem apresentar uma visão fisiológica do desenvolvimento de redes vasculares primitivas2,3. Embora o campo da modelagem vascular tenha testemunhado avanços significativos, um ensaio "padrão-ouro" que pode modelar quantitativamente e avaliar o desenvolvimento vascular fisiológico permanece elusivo. A maioria dos protocolos publicados não recapitulam adequadamente o nicho vascular para incentivar a formação de vasos sanguíneos maduros e funcionais ou não têm um método para comparar quantitativamente o potencial vasculogênico dos tipos de células avaliados em três dimensões ( 3D).

Muitos modelos vasculares atuais são limitados em sua capacidade de imitar o nicho vascular fisiológico. Uma das plataformas mais comumente empregadas in vitro é o ensaio de formação de tubos com base em misturas de proteínas gelatinosas. Resumidamente, os HUVECs são semeados como células únicas em uma fina camada de gel que consiste de proteínas colhidas da matriz extracelular de sarcoma murino (ECM); dentro de um a dois dias, o HUVECs Self-montam em tubos primitivos4. Entretanto, esse processo ocorre em duas dimensões (2D) e as células endoteliais (ECs) utilizadas neste ensaio não formam lúmens fechados e ocos, limitando assim o significado fisiológico desses estudos. Mais recentemente, as ECs e as células de suporte (por exemplo, células-tronco mesenquimais (MSCs) e pericytes) foram cocultivadas em microambientes 3D que simulam a arquitetura fibrosa do ECM nativo, como colágeno ou hidrogéis de fibrina5. Para modelar o desenvolvimento vascular neste microambiente, os grânulos poliméricos revestidos com ECs são tipicamente empregados6. A adição de fatores de crescimento exógenos e/ou fatores de crescimento secretados por outras células interstitialmente encaixadas no hidrogel pode induzir o ECs, revestindo as esferas poliméricos, para brotar e formar lúmen único; o número e o diâmetro dos rebentos e das embarcações podem então ser computados. No entanto, estes rebentos são singulares e não formam uma rede fechada, conectada como é visto em condições fisiológicas e, portanto, é mais uma reminiscência de um modelo de vasculatura tumoral. Dispositivos microfluílicos também têm sido utilizados para imitar o nicho vascular e promover a formação de vasculatura em hidrogéis EC-Laden7,8. Tipicamente, um gradiente de fator de crescimento angiogênico é aplicado ao meio de cultura celular circulante para induzir a migração e brotação da CE. Os ECs que constituem o lúmen dos vasos desenvolvidos são sensíveis à tensão de cisalhamento induzida pela aplicação do fluxo de fluido através do dispositivo microfluídico; assim, estes dispositivos microfluídicos capturam os parâmetros fisiológicos chaves que não são acessíveis nos modelos estáticos. No entanto, esses dispositivos exigem habilidades de microfabricação dispendiosas.

Mais importante ainda, todos os três modelos vasculares (2D, 3D, microfluídico) utilizam predominantemente ECs primários, bem como tipos de células de suporte primários. As células primárias não podem ser desenvolvidas em uma terapia cardiovascular efetiva, pois as células engendram uma resposta imune na implantação; Além disso, HUVECs e tipos preliminares similares da pilha não são paciente-específicos e não capturam as anomalias vasculares que ocorrem nos pacientes com uma disposição genética ou em condições de saúde pre-existing, por exemplo, mellitus de diabetes. As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) surgiram na última década como uma fonte de células proliferativa, específica do paciente, que pode ser diferenciada em todas as células somáticas do corpo humano9. Em particular, foram publicados protocolos que descrevem a geração e o isolamento de progenitores endoteliais derivados do iPSC (iPSC-EPs)10,11; iPSC-EPs são bipotentes e podem, portanto, ser mais diferenciados em células endoteliais e células musculares lisas/pericytes, os blocos de construção de vasculatura madura, funcional. Somente um estudo detalhou forma convincente o desenvolvimento de um plexo capilar preliminar de IPSC-EPS em um microambiente 3D12; Embora este estudo seja crítico a uma compreensão da montagem do iPSC-EP e da diferenciação em hydrogels naturais e sintéticos, não compara quantitativamente as topologias da rede da vasculatura resultante. Outro estudo recente utilizou o modelo de cordão polimérico para comparar a brotação de HUVECs e ECs5derivado do IPSC. Portanto, há uma clara necessidade de elucidar ainda mais os mecanismos de sinalização física e química que regulam a vasculogênese de iPSC-EP em microambientes 3D e determinar se essas células são adequadas para terapia isquêmica e doença cardiovascular Modelagem.

Na última década, foram desenvolvidos diferentes pipelines computacionais de código aberto e algoritmos de esqueletização para quantificar e comparar o comprimento e a conectividade da rede vascular. Por exemplo, charwat et al. desenvolveram um pipeline baseado em Photoshop para extrair uma imagem filtrada e binarizada de redes vasculares derivadas de uma cocultura de células-tronco derivadas de Adipose e conseqüência ECS em uma matriz de fibrina13,14. Talvez a ferramenta de comparação de topologia mais amplamente utilizada seja a AngioTool, um programa publicado on-line pelo National Cancer Institute15; Apesar da adoção generalizada do programa e da fidelidade bem documentada, o programa se limita a analisar estruturas semelhantes a vasos em duas dimensões e outros programas, incluindo AngioSys e Wimasis, compartilham a mesma limitação de dimensionalidade16. Poderosas suítes de software como Imaris, Lucis e Metamorph foram desenvolvidas para analisar a topologia de rede de microvasculatura projetada; no entanto, essas suítes são proibitivas de custo para a maioria dos laboratórios acadêmicos e limitam o acesso ao código-fonte, o que pode dificultar a capacidade do usuário final de personalizar o algoritmo para sua aplicação específica. o slicer 3D, um pacote da imagem latente de ressonância magnética da abrir-fonte/tomography computado, contem um toolkit de modelagem vascular que possa eficazmente analisar a topologia de redes vasculares 3D17; no entanto, a análise é dependente do usuário colocando manualmente os pontos finais da rede, o que pode se tornar tedioso ao analisar um grande conjunto de dados e pode ser influenciado pelos preconceitos subconscientes do usuário. Neste manuscrito, um pipeline computacional que pode quantificar redes vasculares 3D é descrito detalhadamente. Para superar as limitações acima descritas, este pipeline computacional de código aberto utiliza o ImageJ para pré-processar imagens confocais adquiridas para carregar o volume 3D em um analisador de esqueleto. O analisador de esqueleto usa um algoritmo de desbaste de eixo medial paralelo, e foi originalmente desenvolvido por Kerschnitzki et al. para analisar o comprimento e a conectividade das redes de osteócitos18; Este algoritmo pode ser aplicado eficazmente para caracterizar o comprimento e a conectividade da microvasculatura projetada.

Completamente, este protocolo esboça a criação de redes microvascular em microambientes 3D e fornece um encanamento computacional livre do aberto-fonte e do usuário-polarização para comparar prontamente o potencial vasculogenic de iPSC-EPs.

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Protocol

1. preparação de meios de cultura e soluções de revestimento

  1. Para preparar a solução de revestimento de vitronectina, diluir a vitronectina 1:100 em soro fisiológico tamponado com tampão fosfato de Dulbecco (DPBS).
    Cuidado: uma vez diluído, não é recomendável armazenar esta solução para uso futuro.
  2. Ao receber fenol vermelho-livre, fator de crescimento-mistura de proteína gelatinosa reduzida (ver tabela de materiais) do fabricante, descongelar no gelo a 4 ° c até que a mistura é transparente e fluido. Mantendo a mistura no gelo em uma capa do fluxo laminar, pipeta 75 μL da mistura em um tubo do microcentrifugador de 1,8 mL e congele-se em-20 ° c imediatamente. Essas alíquotas podem ser armazenadas por até um ano.
    PRECAUÇÃO: esta mistura de proteínas gelatinosas torna-se muito viscosa quando mantida à temperatura ambiente e solidifica a temperaturas mais elevadas. Mantenha esta solução gelada.
  3. Para preparar esta mistura para o revestimento, descongelar uma alíquota de 75 μL no gelo e diluir com 6 mL de meio de águia modificada de Dulbecco gelado: mistura nutritiva F-12 (DMEM/F12). Este volume preparado é suficiente para revestir uma placa de 12 poços.
  4. Prepare uma solução de 100 mg/mL de ácido ascórbico magnésio-2-fosfato (um pó liofilizado branco) em água ultrapura adicionando 500 mg de pó a 5 mL de água em um frasco de cintilação de vidro de 10 mL. Agitar com uma barra de agitação até que a solução é completamente transparente (isso pode demorar até uma hora). Esta solução pode ser armazenada em-20 ° c por até um ano.
  5. Crie um estoque de 10 mM de CHIR99021 (CHIR) dissolvendo 10 mg de pó liofilizado em 1,9928 mL de dimetil sulfóxido (DMSO) em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL e aqueça em um banho de cordão de 37 ° c (ou água) até que a solução seja transparente. Alíquota em tubos de microcentrífuga de 1,8 mL e armazene a-20 ° c por até um ano.
  6. Crie um estoque de 10 mM de Y-27632, um inibidor de ROCK (ROCKi), dissolvendo 10 mg de pó liofilizado em 3,1225 mL de dimetil sulfóxido (DMSO) em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL e aqueça em um banho de grânulo (ou água) de 37 ° c até que a solução seja transparente. Alíquota em tubos de microcentrífuga de 1,8 mL e armazene a-20 ° c por até um ano.
  7. Para preparar o meio essencial 8 (E8), descongelar suplementos congelados, adicionar à garrafa de 500 mL de meio basal e esterilizar o filtro. Esta solução pode ser armazenada a 4 ° c por até duas semanas.
    Cuidado: é muito importante não aquecer este meio a 37 ° c, pois as proteínas na formulação média podem degradar-se com o uso prolongado. Em vez disso, mantenha este meio à temperatura ambiente por 15 a 30 minutos antes de usar.
  8. Para preparar o tampão de triagem, adicione 1,33 mL de 7,5% de albumina sérica bovina (BSA) em DPBS e 200 μL de ácido etilenodiaminotraacético de 0,5 mM (EDTA) a 48,5 mL de DPBS para criar uma solução final de 0,5% de BSA e 2 mM de EDTA.
  9. Para preparar o LaSR basal, adicione 300 μL de 100 mg/mL de ácido ascórbico magnésio-2-fosfato e 5 mL de GlutaMAX a 500 mL de DMEM/F12 avançado. Esta solução pode ser armazenada a 4 ° c por até um mês.
  10. Para preparar o crescimento de células endoteliais médio-2 (EGM-2), descongelar suplementos e adicionar a 500 mL de frasco de meio basal. Esta solução pode ser armazenada a 4 ° c por até um mês.
  11. Para preparar o tampão de bloqueio, adicione 500 mg de albumina sérica bovina liofilizada (BSA) e 50 μL de um reagente emulsionante (ver tabela de materiais) a 48 ml de dpbs. Incubar em 37 ° c por pelo menos 15 minutos para assegurar-se de que o BSA não se Amontoe e subseqüentemente separado da solução.

2. descongelar, manutenção e de de iPSCs

  1. Antes de descongelar um frasco para injetáveis de iPSC criopreservado, cubra um único poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de solução de vitronectina (preparada conforme descrito na etapa 1,1). Incubar para um h na temperatura ambiente. Não deixe secar o ar do revestimento antes de adicionar o meio E8 à placa.
  2. Para descongelar iPSCs, recupere um frasco criopreservado de iPSCs de seu recipiente de armazenamento do nitrogênio líquido e descongele em 37 ° c até que um cristal pequeno do gelo permaneça. Com cuidado (Dropwise) transfira o conteúdo do frasco para injetáveis descongelado para um tubo de centrifugação cônico de 15 mL contendo 8 mL de DMEM/F12 gelada. Lave o frasco para injetáveis descongelado com uma adição de 1 mL de DMEM/F12 gelada para minimizar a perda de células. Centrifugador por 5 min a 300 x g.
  3. Enquanto aguarda a centrífuga, aspirar a solução de vitronectina e adicionar 1 mL de meio E8 (preparado conforme descrito na etapa 1,6) para o poço. Em seguida, retire o sobrenadante DMEM/F12 do tubo cônico centrifugado e resuspenda o pellet em 1 mL de meio E8. Transfira as células para a placa recém-revestida, sendo certo agitar a suspensão para evitar que as colônias se aglomerem na semeadura.
  4. Há geralmente uma morte substancial da pilha após thawing. Na manhã seguinte, retire o meio e substitua com o meio fresco E8.
    Nota: mesmo em condições ideais, os iPSCs tendem a se recuperar mal da criopreservação. Recomenda-se a criostpreservar um próximo-confluente 6-bem para o futuro de semeadura em um único 6-bem. A presença de detritos celulares é normal durante os primeiros 2-3 dias durante a recuperação celular.
  5. Substitua E8 meio diariamente até que as células estejam prontas para de (70% – 80% de confluência).
  6. Para a passagem, primeiro Prepare Poços revestidos de vitronectina (conforme descrito na etapa 2,1).
    1. Uma vez que os Poços revestidos por vitronectina estão prontos (cerca de 1 h), aspirar E8 médio de bem a ser é e lavar duas vezes com 1 ml de dpbs. Incubar com 1 mL de 0,5 mM de EDTA por 5 – 7 min a 37 ° c. Ao incuar, retire a solução de vitronectina do poço recém-revestido e substitua por 1 – 2 mL de meio E8.
    2. Retire a solução de EDTA dos poços a ser é e separe as colônias delicadamente lavando uma ou duas vezes com 1 ml de E8. Transferir 75-200 μL de suspensão celular para os poços recém-revestidos de E8, agitar a placa para garantir a cobertura, e colocar na incubadora imediatamente.
      Cuidado: o tempo de incubação para o descolamento do iPSC é dependente da linha celular; recomenda-se que o usuário deste protocolo testa uma escala das épocas em cima de expandir suficientemente uma linha recebida/gerada iPSC. 75 μL de suspensão celular geralmente resulta em 4 dias entre passagens; 150 μL ou mais conduz a 2 – 3 dias entre passagens.

3. geração de progenitores endoteliais derivados do iPSC (Figura 1).

  1. Ao manter iPSCs, certifique-se que as colônias estão bem compactadas e que há um baixo número de células diferenciadas na cultura. Se as colônias começarem a entrar em contato um com o outro, as células são muito provavelmente muito confluentes e precisam ser é imediatamente.
  2. Quando os iPSCs são 70% – 80% confluentes, revestir uma placa de 24 poços com a mistura de proteína gelatinosa (preparada conforme descrito em 1.2/1.3). Pipetar 250 μL desta mistura para cada poço e manter por 1 h à temperatura ambiente.
  3. Durante a incubação acima de 1 h, retire o meio E8 e o Y-27632 do frigorífico e do congelador, respetivamente. Uma vez que E8 médio e Y-27632 atingem a temperatura ambiente, prepare E8 + ROCKi adicionando 13 μL de 10 μM Y-27632 a 13 mL de E8 em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL.
  4. Retire o meio E8 dos poços iPSC, lave duas vezes com 1 mL de DPBS e, em seguida, incubar com 0,5 mM de EDTA por 5-7 min a 37 ° c. Após o período de incubação, retire o EDTA e rapidamente corte as células em uma única célula de suspensão com uma ponta de pipeta P1000 com 1 mL de E8 + ROCKi médio.
  5. Conte as células com um hemociômetro. Para uma suspensão que pode conter milhões de iPSCs, adicione 20 μL de suspensão celular a 180 μL de azul de Tripan. Determine o número de células totais na suspensão de célula única.
  6. Transferência 0,432 x 106 para 1,296 x 106 células (104 a 3 x 104 células/cm2) para o restante E8 + Rocki médio. Retire o revestimento de mistura gelatinosa da placa de 12 poços recém-revestida e adicione 500 μL de suspensão celular a cada poço, assegurando que as células estejam bem distribuídas e não formem pequenos aglomerantes.
    Nota: esta gama de densidades é ideal para a diferenciação de células CD34 positivas; no entanto, essas densidades de semeadura são dependentes da linha celular e podem precisar ser otimizadas pelo usuário deste protocolo.
  7. Após 24 h de cultura, substitua o meio por 500 μL de meio fresco E8. Incubar por um adicional de 24 h nas mesmas condições.
  8. Retire o meio E8 e substitua com LaSR basal suplementado com 6-12 μM de CHIR99021. Este temporal é definido como D0 de diferenciação. Após 24 h de cultura, substitua com o mesmo meio de cultura celular.
    Nota: conforme descrito anteriormente, a quantidade de CHIR99021 adicionada a este meio dependerá da linha iPSC utilizada. Teste por favor uma escala de concentrações CHIR99021 para assegurar resultados óptimos.
  9. Após 48 h de incubação com CHIR99021, substitua por 1 mL de LaSR basal.
  10. Substitua o meio diariamente por 2 mL de LaSR basal por 2-3 dias adicionais. Neste ponto do tempo (D5 da diferenciação), uma proporção significativa destas pilhas expressará CD34 e pode ser caracterizada como progenitors endothelial. Um esquema deste protocolo é delineado com resultados representativos na Figura 1 e descrito na íntegra pelos investigadores que primeiro publicaram este método 11,19.
    Nota: esses progenitores endoteliais podem ser mais diferenciados ao longo de uma linhagem endotelial (35% – 99%) ou uma linhagem muscular lisa (1% – 65%). As eficiências de diferenciação variam dependendo do tipo de revestimento ECM e do meio de cultura celular utilizado durante a diferenciação 20.

4. FACS de progenitores endoteliais

  1. Antes de dissociar as células D5/D6 diferenciadas, prepare o buffer de ordenação conforme descrito na etapa 1,8 e mantenha o gelo.
  2. Incubar as células diferenciadas com 250 μL de solução de descolamento celular por poço (ver tabela de materiais) por 10 min a 37 ° c.
  3. Dissociar as células com uma ponta de pipeta P1000 em uma única suspensão de células na solução de descolamento celular. Consolidar a mistura de solução de descolamento de células celulares em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL e centrifugar por 5 min a 300 x g.
  4. Retire o sobrenadante e reressuscita em 200 μL de tampão de classificação gelo-frio (preparado conforme descrito no passo 1,7. Adicionar 5 μL do anticorpo CD34-PE concentrado à suspensão tampão de triagem celular e incubar por 10 min a 4 ° c.
  5. Re-suspender em 5 mL de gelo-frio classificação buffer. Filtre esta suspensão através de um filtro de células com uma tampa de 40 μm antes de colocar o classificador.
  6. No canal fluorescente apropriado, classifique 10.000 células que não foram rotuladas com um anticorpo fluorescente. Porta uma região com uma alta intensidade fluorescente que não contenha nenhuma destas 10.000 células (Figura 1D). Isso servirá como um controle negativo.
  7. Execute a amostra contendo iPSC-EPs rotulada com uma solução fluorescente e comece a classificação. CD34 é expressado altamente nestes progenitores endothelial e é separado fàcilmente da população principal. Após a triagem, transfira a solução para um tubo de centrífuga cônico de 15 mL e centrifugue por 5 min a 300 x g. Retire o sobrenadante.
    Nota: se a solução estiver em um tubo maior do que um tubo de microcentrífuga (por exemplo, um tubo de poliestireno de 5 mL comumente empregado em muitos protocolos de FACs), resuspenda o pellet de células classificadas em 1 mL de buffer de triagem e transfira esta solução para um tubo de microcentrífuga. Centrifugue a 300 x g durante 5 min e retire o sobrenadante.
    1. Opcional: se for desejada uma caracterização iPSC-EP adicional, adicione outros anticorpos primários (por exemplo, CD31-APC) simultaneamente com CD34-PE. Assegure-se de que a conversa cruzada entre diferentes canais fluorescentes seja minimizada.

5. encapsulamento e cultura de longo prazo de hidrogéis de colágeno iPSC-EP-Laden

  1. Prepare o meio de semeadura adicionando 40 μL de meio de 10x 199 a 400 μL de meio de crescimento endotelial (EGM-2) suplementado com 10 μM Y-27632 em uma microcentrífuga de 1,8 mL e coloque o tubo no gelo.
    Nota: embora o uso de antibióticos seja desencorajado para a cultura da célula-tronco e a manutenção de células diferenciadas, a dosagem com Pen/Strep é recomendada após a triagem, pois é difícil garantir a esterilidade no ambiente de triagem (isto é mais o classificador é compartilhado entre muitos laboratórios).
  2. Retire todo o sobrenadante da suspensão celular e acrescente 200 μL de EGM-2 suplementados com 10 μM Y-27632. Transfira a suspensão celular para o meio de semeadura e misture vigorosamente.
  3. Adicione 350 μL de colágeno à solução preparada na etapa 5,2 e misture bem. A solução tornar-se-á amarela pálida.
    Nota: a concentração final de colágeno pode ter um impacto significativo na formação do plexo capilar. Este protocolo assume que o colágeno foi fornecido em 10 mg/mL e que os hidrogéis têm uma concentração final de 3,5 mg/mL. Ajuste esses volumes para atingir sua concentração final de colágeno; recomenda-se restringir a concentração final de colagénio de 2 mg/mL a 4 mg/mL.
  4. Adicione 5 μL de NaOH de 1M à solução preparada em 5,3 e misture bem, evitando a introdução de bolhas de ar. A solução se tornará rosa brilhante.
  5. Pipete 56 μL de solução de células colágenas neutralizadas, preparada em 5,4 em poços individuais de uma placa de cultura de células de baixo nível de fixação de 96-poço. Incubar a 37 ° c durante 30 min. Antes de adicionar mídia, verifique se as células foram distribuídas uniformemente examinando as amostras com um microscópio brightfield.
  6. Prepare 1 mL de meio de cultura composto de EGM-2 suplementado com 10 μM Y-27632 e 50 ng/mL fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) adicionando 1 μL de cada solução de estoque a um tubo de microcentrífuga. Depois de misturar bem, pipeta 100 μL deste meio de cultura celular para os hidrogéis carregados de células. Transfira a placa a 37 ° c para a cultura a longo prazo.
  7. Substitua o meio de cultura diariamente, acrescentando fatores de crescimento angiogênicos adicionais ou inibidores de pequenas moléculas como ditados pelo objetivo do estudo. Para remover a mídia de forma otimizada, incline a placa e use uma ponta P100 para aspirar suavemente o meio sem perturbar o hidrogel.

6. fixação, imunocoloração e visualização de redes vasculares baseadas em EP

  1. Após uma semana de cultura, adicione 250 μL de solução de paraformaldeído a 4% (PFA) a uma placa de 48 poços. Encha o maior número de poços que existem hidrogéis. Retire o meio dos hidrogéis (PFA) e use pinças finas para transferir os hidrogéis para os poços contendo PFA. Incubar durante 10 min à temperatura ambiente e retire o PFA lavando-se rapidamente com PBS.
  2. Permeabilize adicionando 250 μL de 0,5% de um surfactante nonionic (veja a tabela dos materiais) por 5 minutos na temperatura ambiente. Lave duas vezes com 250 μL de PBS suplementado com 300 mM de glicina. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min para cada passo de lavagem para garantir a remoção do detergente em excesso. Bloquear, imersando os hidrogéis em 250 μL de tampão de bloqueio durante 30 min.
  3. Incubar com os anticorpos primários desejados diluídos no tampão de bloqueio durante a noite a 4 ° c. Por exemplo, se a imunocoloração com faloidina e ve-cadherin, diluir 1:40 e 1:200, respectivamente, no tampão de bloqueio.
  4. No dia seguinte, retire a solução de anticorpos primários e lave duas vezes com 0,5% de reagente emulsionante no DPBS. Cubra com a folha de alumínio e incubar com um anticorpo secundário espécie-específico (por exemplo, 1:200 Alexa fluor 488 em PBS) para 2 h na temperatura ambiente.
  5. Retire a solução de anticorpos secundários e lave duas vezes com 0,5% de reagente emulsionante no DPBS. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min para cada passo de lavagem para garantir a remoção de fluoróforos livres.
  6. Para visualizar núcleos celulares, diluir 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:10000 em PBS e adicionar à (s) amostra (ões).
    1. Incubar durante 2 min à temperatura ambiente e lave duas vezes com PBS. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min para cada passo de lavagem para garantir a remoção de fluoróforos livres.
  7. Transfira as amostras para uma angiogênese μ-slide ou uma placa de Petri de fundo de vidro usando pinças de ponta fina. Certifique-se de que não há bolhas de ar presas debaixo do hidrogel.
  8. Imagem em um microscópio confocal adquirindo pilhas-z que se estendem de baixo para o topo da amostra. Assegure-se de que o detector não esteja saturado e que a menor ampliação disponível esteja em uso (um grande campo de visão é desejável).
    Observação: para processamento futuro, certifique-se de que as pilhas z são salvas com compactação mínima (por exemplo,. CZI).

7. usando o pipeline computacional para analisar e comparar as topologias de rede vascular

  1. Inspecione cada z-Stack para garantir que as fatias contenham apenas vasos. Abra a pilha z no ImageJ e realce o contraste clicando em imagem > ajustar > brilho/contraste. As beiras do navio são demarcadas agora claramente, e o nível do fundo é minimizado. Muitas vezes, as dimensões z não correspondem às dimensões x/y. Para retificar isso, clique em imagem > ajustar > tamanho e altere o número de fatias z para que a distância entre cada fatia seja equivalente a um pixel em x/y. ImageJ irá interpolar automaticamente. Se esta etapa não for executada corretamente, os volumes 3D finais serão exibidos compactados.
    Cuidado: ECs irá migrar para as bordas do gel e irá formar pequenas colônias de paralelepípedos. Enquanto estes são úteis para estimar os limites do hidrogel, eles vão interferir com a análise de imagem final e deve ser excluído.
    Nota: ImageJ é um software de análise de imagem de código aberto baseado em Java desenvolvido em concerto pelos institutos nacionais de saúde e o laboratório de instrumentação óptica e computacional. É recomendável fazer o download de Fiji, que é simplesmente ImageJ empacotado com plugins úteis (https://fiji.sc/).
  2. No ImageJ, Desfoque a imagem em 3 dimensões clicando processo > filtros ≫ Gaussian Blur 3D e, em seguida, definindo os valores Sigma em todas as 3 dimensões para 2,0 (esse valor pode precisar ser ajustado pelo usuário final).
  3. No ImageJ, clique em processar > binário > tornar binário e, em seguida, selecione um algoritmo de limiarização apropriado. O algoritmo de limiarização Cross-entropy desenvolvido por Li et al. é eficaz na separação de vasos a partir do fundo21. Calcule o limiar para cada imagem e defina o plano de fundo como "default".
  4. No ImageJ, remova o ruído espúrio e preencha "buracos" em lúmens clicando em processo > ruído > remover outliers.
    Nota: a remoção de outliers "brilhantes" preencherá pequenos furos em embarcações conectadas; remover Outliers "escuros" removerá as células mortas. O tamanho do raio de remoção variará com base na ampliação e tamanho dos vasos. Para imagens adquiridas com um objetivo de campo largo que são 512 x 512 pixels, os raios normalmente variam de 4-6 pixels.
  5. Processe todos os arquivos brutos (por exemplo, extensão CZI) e converta em arquivos. tif antes de prosseguir para a etapa 7,6. Para ajudar neste processamento, um script ImageJ, "Binarize e Filter. IJM" foi anexado a este manuscrito.
  6. Salve os arquivos. tif processados na mesma pasta que o arquivo "BatchProcessSkeleton. m", disponível para download no manuscrito. Este roteiro, desenvolvido pelos autores, chama as funções publicadas por Phillip Kollmannsberger22 e conduz alguma manipulação adicional de arquivos.
  7. Baixe e descompacte todos os arquivos associados com as duas principais funções "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) e "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d). Salve todas as funções na mesma pasta que a z-Stack processada aberta.
  8. Abra um ambiente de computação numérica de vários paradigmas (consulte a tabela de materiais) e navegue até a pasta onde todos os arquivos descritos acima foram salvos.
  9. Execute "BatchProcessSkeleton. m" digitando Batchprocessskeleton na janela de comando ou abrindo o script e pressionando o botão Executar (seta verde voltada para a direita) no editor.
    Observação: para analisar um grande conjunto de dados com um único comando, verifique se a cadeia de caracteres dentro da função dir na linha 6 contém um asterisco (por exemplo, ' *. tif '). Caso contrário, substitua o asterisco pelo nome do arquivo se a análise de um único arquivo for desejada.
  10. O período de tempo que este script levará para executar variará substancialmente com base no poder de computação disponível. É recomendável realizar essa análise em um computador com pelo menos 8 GB de RAM para que o usuário possa acessar outros programas enquanto o script é executado.
    Cuidado: embora não seja estritamente necessário, representar graficamente a aquisição confocal original (em cinza) e sobrepondo com esta matriz de imagem com a matriz de esqueleto (em vermelho) pode auxiliar na avaliação do desempenho do algoritmo de esqueletização. Além disso, o leitor pode criar um gráfico nodal, conforme implementado por Kollmannsberger et al., para avaliar a acurácia da análise de rede. A criação de ambos os gráficos, enquanto útil, aumentará drasticamente o tempo de execução do script e exigirá memória adicional; Se o usuário simplesmente requer uma análise de topologia final e não deseja visualizar o conjunto de dados, simplesmente comente linhas 44 a 61 (esqueleto gráfico) e linhas 104 a 143 (gráfico de topologia).
  11. Após a conclusão, a matriz de dados , visível no espaço de trabalho, agora contém os dados processados. Clique duas vezes em dados e abra esta célula no editor de variáveis.
    1. Observe que essa matriz conterá, da esquerda para a direita: 1) o nome do arquivo, 2) o número de nós (pontos de ramificação + pontos finais), 3) pontos de ramificação, 4) links (ou seja, vasos), 5) comprimento da rede (incluindo vasos isolados) e 6) o número de fatias contidas na pilha z. Salve esses dados como um arquivo. csv e exporte para análise adicional a qualquer software de escolha.

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Representative Results

Após a diferenciação (Figura 1), FACS e encapsulamento de IPSC-EPS em hidrogéis de colágeno, as células geralmente permanecem arredondadas por 24 h antes de começar a migrar e formar Lúmens iniciais. Após cerca de 6 dias de cultura, um plexo capilar primitivo será visível no hidrogel quando visualizado com microscopia brightfield (Figura 2). Após a imagem os hidrogéis fixados, manchados pilha-carregados em um microscópio confocal (filme 1, filme suplementar 1), as imagens pre-processed são convertidas a um esqueleto que permita uma análise do comprimento e da conectividade totais da rede. Essas medidas quantitativas podem então ser usadas para determinar qual conjunto de condições são ideais para a produção de redes vasculares robustas.

Este protocolo permite o desenvolvimento de um plexo capilar robusto e tridimensional que responde às pistas físicas e químicas locais. No trabalho anterior, esta formação de rede tem se mostrado sensível à densidade matricial, rigidez matricial, inibição da matriz metaloprotease, e o tipo e concentração de vários mitogénios angiogênicos20,23.

Figure 1
Figura 1: geração de iPSC-EPS a partir de células-tronco pluripotentes. (A) wicell 19-9-11 iPSCs, que coraram positivo para Oct4, foram cultivados em meio E8 suplementado com 10 μm Y-27632 rock inibidor para 48 h. (B) os iPSCs foram então induzidos com 6 μm de CHIR99021 em meio lasr basal para 48 h, momento em que as células foram positivas para brachyury, um marcador mesoderma. (C) as pilhas foram cultivadas mais mais em meios de Lasr basais até que EXPRESSARAM CD34, um marcador para progenitors endothelial. (D) aproximadamente 15% – 25% das células diferenciadas EXPRESSARAM CD34. Todas as barras de escala representam comprimentos de 200 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: geração e análise de redes vasculares iPSC-EP em hidrogéis de colágeno. (A) uma secção transversal do microambiente 3D utilizado neste ensaio para promover a formação de rede vascular a partir de IPSC-EPS. Um hidrogel de colágeno flutuante é semeado com iPSC-EPs e exposto a EGM-2 suplementado com 50 ng/mL de VEGF e uma dose temporal de Y-27632. (B) o plexo capilar resultante é altamente ramificado e interligado, como visualizado via coloração com F-Actina (ciano). A imagem binarizadas, mostrada à esquerda, é gerada pelo pré-processamento com ImageJ. Esta pilha z é então analisada através de um algoritmo desenvolvido anteriormente, que esqueletiza a rede (mostrada em uma coleção de linhas vermelhas finas) e, em seguida, analisa a topologia de rede para ramificações (amarelo), pontos finais (azul), vasos isolados (preto) e conectados embarcações (vermelho). A barra de escala representa um comprimento de 100 m. (C) alterações morfológicas dos hidrogéis de colágeno IPSC-EPS-Laden: 24 h após a semeadura, os IPSC-EPS permanecem esféricos e dentro de 96 h gradualmente tomam um fenótipo mais alongado. Uma cultura mais adicional conduz à montagem do lúmen-que contem a rede do VE-cadherin, como mostrado no Inset no ponto de tempo de 144-h. As barras de escala representam comprimentos de 400 μm; verde = VE-cadherin, vermelho = F-Actin, e azul = DAPI. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Movie 1
Filme 1: Z-pilha de VASCULATURA gerada a partir de iPSC-EPS. As redes vasculares foram fixadas, manchadas com F-Actin, e visualizadas adquirindo pilhas-z em um microscópio confocal. As fatias foram adquiridas em intervalos de 17 μm. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)

Suplementar filme 1: renderização 3D de embarcações. As redes vasculares foram fixadas, coradas com F-Actina (vermelha) e VE-caderina (verde), e visualizadas através da aquisição de pilhas z em um microscópio confocal. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Este protocolo envolve a cultura a longo prazo das pilhas em três tipos de meios da cultura de pilha: E8, LaSR basal, e EGM-2. Portanto, grande cuidado deve ser tomado para esterilizar adequadamente todos os materiais. Adicionalmente, os revestimentos do laboratório e as luvas etanol-limpas devem sempre ser desgastados ao trabalhar na capa do fluxo laminar do laboratório. Recomenda-se freqüentemente testar para a contaminação do Mycoplasma; se uma grande quantidade de detritos é observada durante a cultura iPSC ou uma queda súbita na eficiência de diferenciação é observado, a contaminação por micoplasma é uma causa provável. iPSC-EPs gerados com este protocolo tendem a depositar uma quantidade significativa de ECM, que alonga o tempo da dissociação e faz com que a única suspensão da pilha separe em grupos pequenos. Não use Trypsin-EDTA (0,25%), pois a solução pode interromper os resumos de CD34 em IPSC-EPS. Entretanto, o tratamento com solução do Collagenase/Dispase pode remover o ECM depositado e a dissociação da facilidade com uma solução padrão do destacamento da pilha. Após a dissociação extensiva, alguns grupos pequenos das pilhas e do ECM podem remanescer; Remova estes grupos com uma ponta da pipeta P100, porque são prováveis obstruir os filtros da pilha ou interferir com o FACS.

As células-tronco pluripotentes são sensíveis à dissociação e serão submetidas à apoptose em uma suspensão de uma única célula, a menos que um inibidor da rocha (comumente Y-27632) seja adicionado ao meio24. iPSC-EPs também são sensíveis à dissociação; incluindo Y-27632 em 10 μM para os primeiros 24 h de cultura é imperativo para aumentar a sobrevivência celular e proliferação. Portanto, é crítico que um inibidor de ROCK está incluído no hidrogel e meio circundante imediatamente após FACS. A densidade de semeadura do iPSC-EPs também impacta significativamente o desenvolvimento do vaso e o tamanho total da rede. Geralmente, uma concentração de 500.000 células/mL a 3 milhões células/mL é uma faixa apropriada de densidades de semeadura. Um aumento mais adicional na densidade de semeadura conduz frequentemente à compactação do hidrogel e à morte da pilha.

A densidade de proteínas estruturais do ECM foi encontrada para ter um impacto significativo no desenvolvimento da microvasculatura projetada25,26. Geralmente, aumentar a densidade de um hidrogel ECM-baseado (frequentemente colagénio ou fibrin) limita o comprimento e a conectividade vasculares da rede. Conseqüentemente, é crítico que a atenção cuidadosa está paga à densidade da matriz do colagénio; concentrações inferiores a 2 mg/mL promove a degradação proteolítica prematura dos hidrogéis de colágeno, o que resulta numa perda irreparável da integridade estrutural do hidrogel. Em contraste, as concentrações acima de 4 mg/mL induzem a formação de lúmen curto e largo que exibem conectividade deficiente; o deformabilidade do hidrogel e uma mudança no tamanho do pore são responsáveis primeiramente para este revogação20.

Os hidrogéis de colágeno acelulares e carregados de células não se ligam às placas de fixação ultrabaixas; os hidrogéis tendem a permanecer suspensos na mídia e ocasionalmente flutuam até o topo do poço. Se as placas tratadas com cultura de tecido forem empregadas neste protocolo, os progenitores incorporados migrarão para a parte inferior do poço e formarão uma monocamada confluente próxima na parte inferior da placa. A diminuição resultante na densidade de semeadura celular inibe a montagem desses progenitores em redes 3D. Adicionalmente, se os hidrogéis são fundidos nos poços de uma placa tratada cultura do tecido, amarrarão fraca a superfície interna do poço; Esta ligação aplica a tensão ao Hydrogel. Desde que esta plataforma foi desenvolvida para isolar a importância de sinais físicos e químicos, é crítico que nenhuma força estranha está transmitida às pilhas27. Os hidrogéis flutuantes podem ser difíceis de alimentar porque a maioria dos meios de cultura celular está abaixo do hidrogel; para superar isso, incline a placa e use uma pipeta P100 para remover a mídia do lado da parede.

Quando a imagem latente as redes vasculares em um microscópio confocal, é crítico seguir todas as etapas de lavagem para assegurar-se de que o excesso fluoróforo não resulte em uma baixa relação do sinal à ruído. O excesso de fluorescência pode confundir os algoritmos de limiarização padrão e tornar a pilha z difícil de binarizar. Para superar esse problema, use a Phalloidin, uma toxina fúngica que seletivamente rótulos F-Actin e exibe limitado fora-alvo de ligação. Em geral, use anticorpos primários que foram pré-conjugados a um anticorpo secundário para limitar a concentração de fluoróforo livre que difunde através do gel. Ao gerar as pilhas z, uma profundidade de fatia de 10-20 mícrons é recomendada para equilibrar o tempo necessário para adquirir uma pilha z contra a necessidade de uma imagem de alta resolução.

Aqui um ensaio quantitativo para avaliar o potencial vasculogenic de iPSC-EPs em microambientes 3D é descrito. Este ensaio utiliza software de código aberto e não é afetado por vieses do usuário. Ainda assim, representa um modelo supersimplificado do nicho vascular fisiológico. Enquanto iPSC-EPs pode se diferenciar nas células necessárias para a vasculatura madura e funcional, este ensaio negligencia as contribuições de outros tipos de células (por exemplo, fibroblastos e macrófagos) que participam de processos vasculogênicos. Além disso, este sistema é estático e não expõe os vasos em desenvolvimento a fluir. Finalmente, enquanto o colágeno I é uma das proteínas dominantes no ECM28 e mantém sua arquitetura fibrilar in vitro, é muito dependente e é limitado a reticulação física fraca quando neutralizada em altas temperaturas. Apesar destas limitações, este ensaio representa um avanço significativo na busca para projetar a vasculatura funcional para a terapia e a modelagem de doenças cardiovasculares.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Associação Americana de coração (Grant Number 15SDG25740035, concedido a J.Z.), o Instituto Nacional de imagiologia biomédica e bioengenharia (NIBIB) dos institutos nacionais de saúde (número de subvenção EB007507, concedido a C.C.), e a Aliança para a pesquisa de reabilitação regenerativa & formação (AR3T, concessão número 1 P2C HD086843-01, concedida a J.Z.). Gostaríamos de reconhecer o Prof. Jeanne Stachowiak (a Universidade do Texas em Austin) por seu aconselhamento técnico sobre microscopia confocal. Estamos também gratos por discussões com Samuel Mihelic (a Universidade do Texas em Austin), Dr. Alicia Allen (a Universidade do Texas em Austin), Dr. Julie Rytlewski (Adaptive Biotech), e Dr. Leon Bellan (Universidade Vanderbilt) para a sua visão sobre o análise computacional de redes 3D. Finalmente, agradecemos ao Dr. Xiaoping Bao (Universidade da Califórnia, Berkeley) por seu Conselho sobre diferenciar iPSCs em iPSC-EPs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Slide Angiogenesis Ibidi N/A A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile Corning 7007 Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish
Accutase STEMCELL Technologies 7920 Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS
Advanced DMEM/F12 Thermo Scientific 12634010 The base media for iPSC-EP differentiation. 
Barnstead GenPure xCAD Plus  Thermo Fisher Scientific 50136165 Water purification system; others can be readily substituted
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture Fisher Scientific A8412 To preserve cell viability when FACs sorting
CD34-PE, human (clone: AC136) Miltenyi Biotec 130-098-140 Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs
CHIR99021 LC Laboratories C-6556 Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg VWR 354249 Main component of the 3D microenvironment
Conical centrifuge tubes (15/50 mL) Fisher Scientific 14-959-49D/A Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306 To counterstain and visualize cell nuclei
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11320-082 For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) ThermoFisher 14190-250 To wash monolayer cultures
EDTA Sigma-Aldrich E8008 For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCell C-22011 Promotes endothelial cell viability and proliferation
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001   For maintenance of pluripotent stem cells
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) Sigma-Aldrich 50046 Neutralizes remaining detergent
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% Sigma-Aldrich A8960 Component of iPSC-EP differentiation medium
MATLAB MathWorks 1.8.0_152 Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) Fisher Scientific 356231 Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation
Medium-199 10X Thermo Fisher Scientific 1825015 Used to balance final hydrogel osmolarity and pH
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) VWR 87003-294 Stores small volumes of reagents
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P3813 The main ingredient of the immunostaining solutions
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument
Recombinant Human VEGF 165 Protein R&D Systems 293-VE Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis
Rhodamine phalloidin Themo Fisher Scientific R415 To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks
Triton X-100 (nonionic surfactant) Sigma-Aldrich X-100 Detergent used to gently permeabilize cells
Tween-20 (emulsifying reagent) Fisher Scientific BP337 Increases the binding specificity of the added antibodies
VE-Cadherin (F-8) Santa Cruz Biotechnology sc-9989  To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels
Vitronectin ThermoFisher A14700 For maintenance of pluripotent stem cells
Y-27632 Selleck Chemicals S1049 Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded

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Crosby, C. O., Zoldan, J. An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors. J. Vis. Exp. (147), e59342, doi:10.3791/59342 (2019).

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