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Developmental Biology

Un modelo 3D In Vitro y una tubería computacional para cuantificar el potencial vasculogénico de los progenitores endoteliales derivados de iPSC

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59342
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin

Summary

Los progenitores endoteliales derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-EP) tienen el potencial de revolucionar los tratamientos de enfermedades cardiovasculares y permitir la creación de modelos de enfermedades cardiovasculares más fieles. En este documento, se describe la encapsulación de iPSC-EPs en microambientes tridimensionales de colágeno (3D) y un análisis cuantitativo del potencial vasculogénico de estas células.

Abstract

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son una fuente celular proliferativa específica del paciente que puede diferenciarse en cualquier tipo de célula somática. Los progenitores endoteliales bipotentes (EP), que pueden diferenciarse en los tipos celulares necesarios para ensamblar la vasculatura funcional madura, se han derivado de células madre embrionarias e pluripotentes inducidas. Sin embargo, estas células no han sido rigurosamente evaluadas en entornos tridimensionales, y una medida cuantitativa de su potencial vasculogénico sigue siendo esquiva. Aquí, la generación y el aislamiento de iPSC-EPs a través de la clasificación de células activadas por fluorescentes se describen primero, seguido de una descripción de la encapsulación y el cultivo de iPSC-EPs en hidrogeles de colágeno. Este microambiente de imitación de matriz extracelular (ECM) fomenta una respuesta vasculogénica robusta; redes vasculares se forman después de una semana de cultivo. Se delinea la creación de una canalización computacional que utiliza software de código abierto para cuantificar esta respuesta vasculogénica. Esta canalización está diseñada específicamente para preservar la arquitectura 3D del plexo capilar para identificar de forma robusta el número de ramas, los puntos de bifurcación y la longitud total de la red con una mínima entrada del usuario.

Introduction

Las células endoteliales de las venas umbilicales humanas (HUVEC) y otros tipos de células endoteliales primarias se han utilizado durante dos décadas para modelar la brotación de vasos sanguíneos y el desarrollo in vitro1. Estas plataformas vasculares prometen iluminar los mecanismos moleculares y a nivel tisular de las enfermedades cardiovasculares y pueden presentar información fisiológica sobre el desarrollo de las redes vasculares primitivas2,3. Aunque el campo del modelado vascular ha sido testigo de avances significativos, un ensayo de "estándar de oro" que puede modelar cuantitativamente y evaluar el desarrollo vascular fisiológico sigue siendo esquiva. La mayoría de los protocolos publicados no recapitulan adecuadamente el nicho vascular para fomentar la formación de vasos sanguíneos maduros y funcionales o no tienen un método para comparar cuantitativamente el potencial vasculogénico de los tipos de células evaluados en tres dimensiones ( 3D).

Muchos modelos vasculares actuales están limitados en su capacidad para imitar el nicho vascular fisiológico. Una de las plataformas in vitro más comúnmente empleadas es el ensayo de formación de tubos a base de mezcla de proteínage. Brevemente, los HUVEC se sembran como células individuales en una capa delgada de gel que consiste en proteínas cosechadas a partir de la matriz extracelular de sarcoma murino (ECM); dentro de uno o dos días, los HUVECse autoensamblan en tubos primitivos 4. Sin embargo, este proceso se produce en dos dimensiones (2D) y las células endoteliales (CE) utilizadas en este ensayo no forman lúmenes huecos cerrados, limitando así la importancia fisiológica de estos estudios. Más recientemente, las CE y las células de apoyo (por ejemplo, células madre mesenquimales (MSC) y pericitas) han sido cocultivadas en microambientes 3D quesimulan la arquitectura fibrosa del ECM nativo, como el colágeno o los hidrogeles de fibrina 5. Para modelar el desarrollo vascular en este microambiente, las perlas poliméricas recubiertas con CE se emplean típicamente6. La adición de factores de crecimiento exógenos y/o factores de crecimiento secretados por otras células interstitialmente incrustadas en el hidrogel puede inducir a los CE, cubriendo las cuentas poliméricas, a brotar y formar un solo lumen; el número y el diámetro de los brotes y recipientes se pueden calcular. Sin embargo, estos brotes son singulares y no forman una red cerrada y conectada como se ve en condiciones fisiológicas y, por lo tanto, recuerda más a un modelo de vasculatura tumoral. También se han utilizado dispositivos microfluídicos para imitar el nicho vascular y promover la formación de vasculatura en hidrogeles cargados por LA CE7,8. Típicamente, un factor de crecimiento angiogénico-gradiente se aplica al medio de cultivo celular circulante para inducir la migración EC y la brotación. Las CE que constituyen el lumen de los vasos desarrollados son sensibles a la tensión de cizallamiento inducida por la aplicación del flujo de fluidos a través del dispositivo microfluídico; por lo tanto, estos dispositivos microfluídicos capturan parámetros fisiológicos clave que no son accesibles en los modelos estáticos. Sin embargo, estos dispositivos requieren costosas capacidades de microfabricación.

Lo más importante es que los tres modelos vasculares (2D, 3D, microfluídicos) utilizan abrumadoramente los CE primarios, así como los tipos de células de soporte primarias. Las células primarias no se pueden desarrollar en una terapia cardiovascular eficaz porque las células generarían una respuesta inmune tras la implantación; además, los HUVEC y tipos de células primarias similares no son específicos del paciente y no capturan anomalías vasculares que se producen en pacientes con una disposición genética o condiciones de salud preexistentes, por ejemplo, diabetes mellitus. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) han surgido en la última década como una fuente celular proliferativa específica para el paciente que se puede diferenciar en todas las células somáticas del cuerpo humano9. En particular, se han publicado protocolos que describen la generación y el aislamiento de progenitores endoteliales derivados de la IPSC (iPSC-EP)10,11; los iPSC-EP son bipotentes y, por lo tanto, pueden diferenciarse aún más en células endoteliales y células musculares lisas/pericitas, los bloques de construcción de la vasculatura funcional madura. Sólo un estudio ha detallado convincentemente el desarrollo de un plexo capilar primario a partir de iPSC-EPs en un microambiente 3D12; aunque este estudio es fundamental para la comprensión del montaje y la diferenciación de iPSC-EP en hidrogeles naturales y sintéticos, no comparó cuantitativamente las topologías de red de la vasculatura resultante. Otro estudio reciente ha utilizado el modelo de cordón polimérico para comparar la brotación de HUVECs y ECs derivados de iPSC5. Por lo tanto, existe una clara necesidad de dilucidar aún más los mecanismos de señalización física y química que regulan la vasculogénesis iPSC-EP en microambientes 3D y determinar si estas células son adecuadas para la terapia isquémica y las enfermedades cardiovasculares Modelado.

En la última década, se han desarrollado diferentes canalizaciones computacionales de código abierto y algoritmos de esqueletización para cuantificar y comparar la longitud de la red vascular y la conectividad. Por ejemplo, Charwat y otros desarrollaron una canalización basada en Photoshop para extraer una imagen filtrada y binariza de redes vasculares derivadas de un cocultivo de células madre derivadas de adiposos y EF de crecimiento en una matriz de fibrina13,14. Tal vez la herramienta de comparación de topología más utilizada es AngioTool, un programa publicado en línea por el Instituto Nacional del Cáncer15; a pesar de la adopción generalizada del programa y la fidelidad bien documentada, el programa se limita a analizar estructuras similares a buques en dos dimensiones y otros programas, incluyendo AngioSys y Wimasis, comparten la misma limitación de dimensionalidad16. Se han desarrollado potentes conjuntos de software como Imaris, Lucis y Metamorph para analizar la topología de red de la microvasculatura de ingeniería; sin embargo, estas suites son prohibitivas para la mayoría de los laboratorios académicos y limitan el acceso al código fuente, lo que puede dificultar la capacidad del usuario final para personalizar el algoritmo a su aplicación específica. 3D Slicer, un paquete de resonancia magnética/tomografía computarizada de código abierto, contiene un kit de herramientas de modelado vascular que puede analizar eficazmente la topología de las redes vasculares 3D17; sin embargo, el análisis depende de que el usuario coloque manualmente los puntos finales de la red, lo que puede llegar a ser tedioso al analizar un dataset grande y puede verse influenciado por los sesgos subconscientes del usuario. En este manuscrito, se describe en detalle una canalización computacional que puede cuantificar redes vasculares 3D. Para superar las limitaciones anteriores, esta canalización computacional de código abierto utiliza ImageJ para preprocesar imágenes confocales adquiridas para cargar el volumen 3D en un analizador de esqueletos. El analizador de esqueletos utiliza un algoritmo de adelgazamiento del eje medial paralelo, y fue desarrollado originalmente por Kerschnitzki et al. para analizar la longitud y conectividad de las redes de osteocitos18; este algoritmo se puede aplicar eficazmente para caracterizar la longitud y la conectividad de la microvasculatura de ingeniería.

En conjunto, este protocolo describe la creación de redes microvasculares en microambientes 3D y proporciona una canalización computacional libre de código abierto y sesgo de usuario para comparar fácilmente el potencial vasculogénico de iPSC-EPs.

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Protocol

1. Preparación de medios de cultivo y soluciones de recubrimiento

  1. Para preparar la solución de recubrimiento vitronectina, diluir vitronectina 1:100 en la solución salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco.
    ADVERTENCIA: Una vez diluido, no se recomienda almacenar esta solución para su uso futuro.
  2. Al recibir la mezcla de proteína gelatinosa reducida en el factor de crecimiento (ver Tabla de Materiales)del fabricante, descondece sobre hielo a 4oC hasta que la mezcla sea transparente y fluida. Manteniendo la mezcla sobre hielo en una campana de flujo laminar, pipeta 75 s de la mezcla en un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml y congela inmediatamente a -20 oC. Estas alícuotas se pueden almacenar hasta por un año.
    ADVERTENCIA: Esta mezcla de proteína gelatinosa se vuelve muy viscosa cuando se mantiene a temperatura ambiente y se solidificará a temperaturas más altas. Mantenga esta solución helada.
  3. Para preparar esta mezcla para el recubrimiento, descongelar una alícuota de 75 ol sobre hielo y diluir con 6 ml de medio de águila modificado de Dulbecco en frío en hielo: Mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12). Este volumen preparado es suficiente para recubrir una placa de 12 pocillos.
  4. Preparar una solución de 100 mg/ml de magnesio-2-fosfato ácido ascórbico (un polvo liofilizado blanco) en agua ultrapura añadiendo 500 mg de polvo a 5 ml de agua en un vial de centelleo de vidrio de 10 ml. Agitar con una barra de agitación hasta que la solución esté completamente transparente (esto puede tardar hasta una hora). Esta solución se puede almacenar a -20 oC durante un año.
  5. Cree un stock de 10 mM de CHIR99021 (CHIR) disolviendo 10 mg de polvo liofilizado en 1.9928 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) en un tubo centrífugo cónico de 15 ml y caliente en un baño de perlas (o agua) de 37 oC hasta que la solución sea transparente. Aliquot en tubos de microcentrífuga de 1,8 ml y almacenar a -20 oC durante un año.
  6. Crear un stock de 10 mM de Y-27632, un inhibidor de ROCK (ROCKi), disolviendo 10 mg de polvo liofilizado en 3.1225 ml de dimetil sulfóxido (DMSO) en un tubo centrífugo cónico de 15 ml y calentar en un baño de perlas (o agua) de 37 oC hasta que la solución sea transparente. Aliquot en tubos de microcentrífuga de 1,8 ml y almacenar a -20 oC durante un año.
  7. Para preparar el medio Esencial 8 (E8), descongelar suplementos congelados, añadir a la botella de 500 ml de medio basal, y filtrar esterilizar. Esta solución se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de dos semanas.
    ADVERTENCIA: Es muy importante no calentar este medio a 37oC, ya que las proteínas de la formulación media pueden degradarse con un uso prolongado. En su lugar, mantenga este medio a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos antes de su uso.
  8. Para preparar el tampón de clasificación, agregue 1,33 ml de albúmina sérica bovina (BSA) al 7,5% en DPBS y 200 ml de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) de 0,5 mM a 48,5 ml de DPBS para crear una solución final de 0,5% de BSA y 2 mM de EDTA.
  9. Para preparar LaSR Basal, añadir 300 ml de 100 mg/ml de magnesio ascórbico-2-fosfato y 5 ml de GlutaMAX a 500 ml de DMEM avanzado/F12. Esta solución se puede almacenar a 4 oC durante un mes.
  10. Para preparar el crecimiento celular endotelial Medio-2 (EGM-2), suplementos de descongelación y añadir a 500 ml botella de medio basal. Esta solución se puede almacenar a 4 oC durante un mes.
  11. Para preparar el tampón de bloqueo, agregue 500 mg de albúmina sérica bovina liofilizada (BSA) y 50 l de un reactivo emulsionante (ver Tabla de Materiales)a 48 ml de DPBS. Incubar a 37 oC durante al menos 15 minutos para asegurarse de que la BSA no se agrupe y, posteriormente, se separe de la solución.

2. Descongelación, mantenimiento y passaging de iPSCs

  1. Antes de descongelar un vial crioconservado iPSC, cubra un solo pozo de una placa de 6 pocillos con 1 ml de solución de vitronectina (preparado como se describe en el paso 1.1). Incubar durante una h a temperatura ambiente. No deje que este recubrimiento se seque al aire antes de añadir el medio E8 a la placa.
  2. Para descongelar los ISPS, recupere un vial crioconservado de isPSC de su contenedor de almacenamiento de nitrógeno líquido y descondece a 37 oC hasta que quede un pequeño cristal de hielo. Transfiera cuidadosamente (en sentido a la gota) el contenido del vial descondescongelado a un tubo centrífugo cónico de 15 ml que contenga 8 ml de DMEM/F12 helado. Lave el vial descongelado con una adición de 1 ml de DMEM/F12 helado para minimizar la pérdida celular. Centrífuga durante 5 min a 300 x g.
  3. Mientras espera la centrífuga, aspirar la solución vitronectina y añadir 1 ml de medio E8 (preparado como se describe en el paso 1.6) al pozo. A continuación, retire el sobrenadante DMEM/F12 del tubo cónico centrifugado y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de medio E8. Transfiera las células a la placa recién recubierta, asegurándose de agitar la suspensión para evitar que las colonias se agrupen al sembrar.
  4. Por lo general, hay una muerte celular sustancial después de la descongelación. A la mañana siguiente, retire el medio y sustitúyalo por un medio E8 fresco.
    NOTA: Incluso en condiciones óptimas, los iPSC tienden a recuperarse mal de la criopreservación. Se recomienda criopreservar un pozo de 6 ofluentes cercano para futuras semillas en un solo 6 pozos. La presencia de desechos celulares es normal durante los primeros 2-3 días durante la recuperación celular.
  5. Reemplace el medio E8 diariamente hasta que las células estén listas para el paso (70%–80% de confluencia).
  6. Para el paso, primero prepare los pozos recubiertos con vitrocción (como se describe en el paso 2.1).
    1. Una vez que los pozos recubiertos con vitrocintina estén listos (aproximadamente 1 h), aspirar el medio E8 de pozo a pasar y lavar dos veces con 1 mL de DPBS. Incubar con 1 mL de 0,5 mM EDTA durante 5-7 min a 37oC. Durante la incubación, retire la solución vitronectina del pozo recién recubierto y sustitúyala por 1-2 ml de medio E8.
    2. Retire la solución EDTA de los pozos a pasar y separe las colonias lavándose suavemente una o dos veces con 1 ml de E8. Transfiera 75-200 l de suspensión celular a los pozos recién recubiertos de E8, agite la placa para asegurar una cobertura uniforme y colóquela en la incubadora inmediatamente.
      ADVERTENCIA: El tiempo de incubación para el desprendimiento de iPSC depende de la línea celular; se recomienda que el usuario de este protocolo pruebe un rango de veces al ampliar suficientemente una línea iPSC recibida/generada. 75 l de suspensión celular generalmente resulta en 4 días entre pasajes; 150 o más conducen a 2-3 días entre pasajes.

3. Generación de progenitores endoteliales derivados de iPSC (Figura 1).

  1. Al mantener iPSCs, asegúrese de que las colonias están bien compactadas y que hay un bajo número de células diferenciadas en el cultivo. Si las colonias comienzan a ponerse en contacto entre sí, lo más probable es que las células sean demasiado confluentes y necesiten ser pasajes inmediatamente.
  2. Cuando los iPSC sis 70%–80% confluentes, cubra una placa de 24 pocillos con la mezcla de proteína gelatinosa (preparada como se describe en 1.2/1.3). Pipetear 250 l de esta mezcla en cada poca y mantener durante 1 h a temperatura ambiente.
  3. Durante la incubación de 1 h anterior, retire el medio E8 y el Y-27632 del refrigerador y el congelador, respectivamente. Una vez que el medio E8 y la Y-27632 alcancen la temperatura ambiente, prepare El E8 + ROCKi añadiendo 13 éL de 10 M Y-27632 a 13 mL de E8 en un tubo centrífugo cónico de 15 ml.
  4. Retire el medio E8 de los pozos iPSC, lave dos veces con 1 ml de DPBS y luego incubar con EDTA de 0,5 mM durante 5-7 min a 37 oC. Después del período de incubación, retire el EDTA y corte rápidamente las células en una suspensión de una sola célula con una punta de pipeta P1000 con 1 ml de medio E8 + ROCKi.
  5. Cuente las células con un hemocaquímetro. Para una suspensión que puede contener millones de iPSCs, agregue 20 s de suspensión celular a 180 s de trippan azul. Determine el número total de celdas en la suspensión de una sola célula.
  6. Transfiera 0.432 x 106 a 1.296 x 106 celdas (104 a 3 x 104 células/cm2) al medio E8 + ROCKi restante. Retire el recubrimiento de mezcla gelatinosa de la placa de 12 pocillos recién recubierta y agregue 500 l de suspensión celular a cada poca, asegurándose de que las células estén bien distribuidas y no formen pequeños grumos.
    NOTA: Este rango de densidades es óptimo para la diferenciación de células positivas CD34; sin embargo, estas densidades de sembrado dependen de la línea celular y pueden necesitar ser optimizadas por el usuario de este protocolo.
  7. Después de 24 h de cultivo, sustituya el medio por 500 ml de medio Fresco E8. Incubar durante 24 h adicionales en las mismas condiciones.
  8. Retire el medio E8 y sustitúyalo por LaSR Basal complementado con 6-12 m de CHIR99021. Este punto de tiempo se define como D0 de diferenciación. Después de 24 h de cultivo, reemplace con el mismo medio de cultivo celular.
    NOTA: Como se describió anteriormente, la cantidad de CHIR99021 agregada a este medio dependerá de la línea iPSC utilizada. Pruebe un rango de concentraciones de CHIR99021 para garantizar resultados óptimos.
  9. Después de 48 h de incubación con CHIR99021, reemplazar con 1 mL de LaSR Basal.
  10. Reemplace el medio diario por 2 ml de LaSR Basal durante 2-3 días adicionales. En este momento (D5 de diferenciación), una proporción significativa de estas células expresará CD34 y se puede caracterizar como progenitores endoteliales. Un esquema de este protocolo se describe con resultados representativos en la Figura 1 y descrito en su totalidad por los investigadores que publicaron por primera vez este método 11,19.
    NOTA: Estos progenitores endoteliales se pueden diferenciar aún más a lo largo de un linaje endotelial (35%–99%) o un linaje muscular liso (1%–65%). Las eficiencias de diferenciación varían según el tipo de recubrimiento ECM y el medio de cultivo celular utilizado durante la diferenciación 20.

4. FACS de progenitores endoteliales

  1. Antes de disociar las células diferenciadas D5/D6, prepare el tampón de clasificación como se describe en el paso 1.8 y manténgalo en hielo.
  2. Incubar las células diferenciadas con 250 ml de solución de desprendimiento de células por poca (ver Tabla de Materiales)durante 10 min a 37 oC.
  3. Disociar las células con una punta de pipeta P1000 en una suspensión de una sola célula en solución de desprendimiento celular. Consolidar la mezcla de solución de desprendimiento de células celulares en un tubo de centrífuga cónica de 15 ml y centrífuga durante 5 min a 300 x g.
  4. Retire el sobrenadante y resuspenda en 200 ml de tampón de clasificación helada (preparado como se describe en el paso 1.7. Añadir 5 l del anticuerpo cd34-PE concentrado a la suspensión tampón de clasificación celular e incubar durante 10 min a 4 oC.
  5. Vuelva a suspender en 5 ml de tampón de clasificación en frío. Filtrar esta suspensión a través de un colador de células con una tapa de 40 m antes de colocar la clasificadora.
  6. En el canal fluorescente adecuado, ordene 10.000 celdas que no hayan sido etiquetadas con un anticuerpo fluorescente. Atraviese una región con una intensidad fluorescente alta que no contenga ninguna de estas 10.000 celdas (Figura1D). Esto servirá como un control negativo.
  7. Ejecute el ejemplo que contiene iPSC-EPs etiquetados con una solución fluorescente y comience la ordenación. CD34 está muy expresado en estos progenitores endoteliales y se separa fácilmente de la población principal. Después de la clasificación, transfiera la solución a un tubo de centrífuga cónica de 15 ml y centrífuga durante 5 min a 300 x g. Retire el sobrenadante.
    NOTA: Si la solución está en un tubo más grande que un tubo de microcentrífuga (por ejemplo, un tubo de poliestireno de 5 ml comúnmente empleado en muchos protocolos DE FAB), vuelva a suspender el pellet de célula clasificado en 1 ml de tampón de clasificación y transfiera esta solución a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 300 x g durante 5 min y quitar el sobrenadante.
    1. Opcional: si se desea una mayor caracterización de iPSC-EP, añada otros anticuerpos primarios (por ejemplo, CD31-APC) simultáneamente con CD34-PE. Asegúrese de que la conversación cruzada entre diferentes canales fluorescentes se minimice.

5. Encapsulación y cultivo a largo plazo de hidrogeles de colágeno cargados de iPSC-EP

  1. Preparar el medio de sembrado añadiendo 40 sl de 10x medio 199 a 400 l de medio de crecimiento endotelial (EGM-2) complementado con 10 M Y-27632 en una microcentrífuga de 1,8 ml y colocar el tubo en el hielo.
    NOTA: Si bien se desaconseja el uso de antibióticos para el cultivo de células madre y el mantenimiento de células diferenciadas, se recomienda la dosificación con Pluma/Strep después de la clasificación porque es difícil garantizar la esterilidad en el entorno de clasificación (esto es más imperativo si el clasificador se comparte entre muchos laboratorios).
  2. Retire todo el sobrenadante de la suspensión celular y agregue 200 éL de EGM-2 complementado con 10 M Y-27632. Transfiera la suspensión celular al medio de sembrado y mezcle vigorosamente.
  3. Añadir 350 ml de colágeno a la solución preparada en el paso 5.2 y mezclar bien. La solución se volverá de color amarillo pálido.
    NOTA: La concentración final de colágeno puede tener un impacto significativo en la formación del plexo capilar. Este protocolo supone que el colágeno se ha suministrado a 10 mg/ml y que los hidrogeles tienen una concentración final de 3,5 mg/ml. Ajustar estos volúmenes para lograr su concentración final de colágeno; se recomienda restringir la concentración final de colágeno de 2 mg/ml a 4 mg/ml.
  4. Añadir 5 l de NaOH de 1M a la solución preparada en 5.3 y mezclar bien, evitando la introducción de burbujas de aire. La solución se convertirá en rosa brillante.
  5. Pipeta de 56 ml de solución de células de colágeno neutralizadas preparada en 5.4 en pozos individuales de una placa de cultivo de células En U de conexión ultrabaja de 96 pocillos. Incubar a 37oC durante 30 min. Antes de agregar medios, compruebe que las células se han distribuido uniformemente examinando las muestras con un microscopio de campo brillante.
  6. Preparar 1 ml de medio de cultivo compuesto por EGM-2 complementado con 10 M Y-27632 y 50 ng/ml de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) añadiendo 1 l de cada solución en stock a un tubo de microcentrífuga. Después de mezclar bien, pipeta 100 l de este medio de cultivo celular en los hidrogeles cargados de células. Transfiera la placa a 37 oC para un cultivo a largo plazo.
  7. Reemplazar el medio de cultivo diariamente, añadiendo factores de crecimiento angiogénicos adicionales o inhibidores de moléculas pequeñas según lo dictado por el objetivo del estudio. Para extraer el soporte de forma óptima, incline la placa y utilice una punta P100 para aspirar suavemente el medio sin perturbar el hidrogel.

6. Fijación, inmunomancha y visualización de redes vasculares basadas en EP

  1. Después de una semana de cultivo, agregue 250 ml de solución de paraformaldehído (PFA) al 48% a una placa de 48 pocillos. Llenar tantos pozos como hidrogeles. Retire el medio de los hidrogeles (PFA) y utilice pinzas de punta fina para transferir los hidrogeles a los pozos que contienen PFA. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente y eliminar el PFA lavando rápidamente con PBS.
  2. Permeabilizar añadiendo 250 ml de 0,5% de un tensioactivo no iónico (ver Tabla de Materiales)durante 5 min a temperatura ambiente. Lavar dos veces con 250 sL de PBS suplementado con 300 mM de glicina. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min para cada paso de lavado para asegurar la eliminación del exceso de detergente. Bloquear sumergiendo los hidrogeles en 250 ml de tampón de bloqueo durante 30 min.
  3. Incubar con los anticuerpos primarios deseados diluidos en el tampón de bloqueo durante la noche a 4oC. Por ejemplo, si la inmunomancha con faloideicina y VE-cadherina, diluya 1:40 y 1:200, respectivamente, en el tampón de bloqueo.
  4. Al día siguiente, retire la solución primaria de anticuerpos y lave dos veces con un reactivo emulsionante del 0,5% en DPBS. Cubra con papel de aluminio e incubar con un anticuerpo secundario específico de la especie (por ejemplo, 1:200 Alexa Fluor 488 en PBS) durante 2 horas a temperatura ambiente.
  5. Retire la solución secundaria de anticuerpos y lávela dos veces con un reactivo emulsionante del 0,5% en DPBS. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min para cada paso de lavado para asegurar la eliminación de fluoróforos libres.
  6. Para visualizar los núcleos celulares, diluir 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:10000 en PBS y añadir a la muestra(s).
    1. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente y lavar dos veces con PBS. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min para cada paso de lavado para asegurar la eliminación de fluoróforos libres.
  7. Transfiera las muestras a una angiogénesis o a un plato de petri con fondo de vidrio utilizando pinzas de punta fina. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas debajo del hidrogel.
  8. Imagen en un microscopio confocal mediante la adquisición de pilas z que se extienden desde la parte inferior hasta la parte superior de la muestra. Asegúrese de que el detector no esté saturado y de que el aumento más bajo disponible esté en uso (es deseable un campo de visión grande).
    NOTA: Para el procesamiento futuro, asegúrese de que las pilas z se guardan con una compresión mínima (por ejemplo, .czi).

7. Uso de la canalización computacional para analizar y comparar topologías de redes vasculares

  1. Inspeccione cada pila z para asegurarse de que los sectores solo contienen recipientes. Abra la pila z en ImageJ y mejore el contraste haciendo clic en Imagen > Ajustar > Brillo/Contraste. Las fronteras de los buques ahora están claramente demarcadas, y el nivel de fondo se minimiza. A menudo, las dimensiones z no coinciden con las dimensiones x/y. Para corregir esto, haga clic en Imagen > Ajustar > Tamaño y cambie el número de sectores z para que la distancia entre cada sector sea equivalente a un píxel en x/a. ImageJ se interpolará automáticamente. Si este paso no se realiza correctamente, los volúmenes 3D finales aparecerán comprimidos.
    ADVERTENCIA: Los CE migrarán hacia los bordes del gel y formarán pequeñas colonias de adoquines. Si bien estos son útiles para estimar los límites del hidrogel, interferirán con el análisis final de la imagen y deben eliminarse.
    NOTA: ImageJ es un software de análisis de imágenes de código abierto basado en Java desarrollado en conjunto por los Institutos Nacionales de Salud y el Laboratorio de Instrumentación Óptica y Computacional. Se recomienda descargar Fiji, que es simplemente ImageJ incluido con plugins útiles (https://fiji.sc/).
  2. En ImageJ, desenfoque la imagen en 3 dimensiones haciendo clic en Proceso > Filtros > Desenfoque gaussiano 3D y, a continuación, estableciendo los valores sigma en las 3 dimensiones en 2.0 (este valor podría necesitar ser ajustado por el usuario final).
  3. En ImageJ, haga clic en Proceso > Binario > Hacer binario y, a continuación, seleccione un algoritmo de umbral adecuado. El algoritmo de umbral de entropía cruzada desarrollado por Li et al. es eficaz en la separación de los vasos del fondo21. Calcule el umbral para cada imagen y establezca el fondo en "Predeterminado".
  4. En ImageJ, elimine el ruido no esencial y rellene "agujeros" en lúmenes haciendo clic en Proceso > Ruido > Eliminar valores atípicos.
    NOTA: La eliminación de los valores atípicos "brillantes" rellenará pequeños agujeros en los recipientes conectados; eliminar los valores atípicos "oscuros" eliminará las células muertas. El tamaño del radio de extracción variará en función de la ampliación y el tamaño de los buques. Para las imágenes adquiridas con un objetivo de campo amplio de 512 x 512 píxeles, los radios normalmente oscilarán entre 4 y 6 píxeles.
  5. Procesar todos los archivos sin procesar (por ejemplo, extensión czi) y convertir en archivos .tif antes de proceder al paso 7.6. Para ayudar en este procesamiento, se ha adjuntado a este manuscrito una escritura ImageJ, "Binarize and Filter.ijm".
  6. Guarde los archivos .tif procesados en la misma carpeta que el archivo "BatchProcessSkeleton.m", disponible para su descarga en el manuscrito. Este guion, desarrollado por los autores, llama a las funciones publicadas por Phillip Kollmannsberger22 y lleva a cabo alguna sobra de manipulación de archivos adicional.
  7. Descargue y descomprima todos los archivos asociados con las dos funciones principales "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) y "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d). Guarde todas las funciones en la misma carpeta que la pila z procesada abierta.
  8. Abra un entorno de computación numérica multiparadigma (consulte Tabla de materiales) y vaya a la carpeta donde se han guardado todos los archivos descritos anteriormente.
  9. Ejecute "BatchProcessSkeleton.m" escribiendo BatchProcessSkeleton en la ventana de comandos o abriendo el script y pulsando el botón Ejecutar (flecha verde orientada a la derecha) en el Editor.
    NOTA: Para analizar un dataset grande con un solo comando, asegúrese de que la cadena dentro de la función dir en la línea 6 contenga un asterisco (por ejemplo, '*.tif'). De lo contrario, reemplace el asterisco por el nombre de archivo si desea el análisis de un único archivo.
  10. El tiempo que este script tardará en ejecutarse variará sustancialmente en función de la potencia informática disponible. Se recomienda realizar este análisis en un equipo con al menos 8 GB de RAM para que el usuario pueda acceder a otros programas mientras se ejecuta el script.
    ADVERTENCIA: Aunque no es estrictamente necesario, graficar la adquisición confocal original (en gris) y superponerse con esta matriz de imagen con la matriz de esqueleto (en rojo) puede ayudar a evaluar el rendimiento del algoritmo de esqueletización. Además, el lector puede crear un gráfico nodal, tal como lo implementa Kollmannsberger et al., para evaluar la precisión del análisis de red. La creación de ambos gráficos, aunque útil, aumentará drásticamente el tiempo de ejecución del script y requerirá memoria adicional; si el usuario simplemente requiere un análisis de topología final y no desea visualizar el conjunto de datos, simplemente comente las líneas 44 a 61 (gráfico de esqueleto) y las líneas 104 a 143 (gráfico de topología).
  11. Al finalizar, la matriz De datos, visible en el espacio de trabajo, ahora contiene los datos procesados. Haga doble clic en Datos y abra esta celda en el editor de variables.
    1. Tenga en cuenta que esta matriz contendrá, de izquierda a derecha: 1) el nombre del archivo, 2) el número de nodos (puntos de bifurcación + puntos finales), 3) puntos de bifurcación, 4) enlaces (es decir, buques), 5) longitud de red (incluidos los recipientes aislados) y 6) el número de sectores contenidos en la pila z. Guarde estos datos como un archivo .csv y exporte para su posterior análisis a cualquier software de su elección.

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Representative Results

Despuésde la diferenciación (Figura 1), FACS y encapsulación de iPSC-EPs en hidrogeles de colágeno, las células normalmente permanecerán redondeadas durante 24 horas antes de comenzar a migrar y formar lúmenes iniciales. Después de unos 6 días de cultivo, un plexo capilar primitivo será visible en el hidrogel cuando se vea con microscopía de campo brillante (Figura2). Después de tomar imágenes de los hidrogeles fijos, de células teñidas en un microscopio confocal (Película1, Película suplementaria 1), las imágenes preprocesadas se convierten en un esqueleto que permite un análisis de la longitud total y la conectividad de la red. Estas medidas cuantitativas se pueden utilizar para determinar qué conjunto de condiciones son óptimas para producir redes vasculares robustas.

Este protocolo permite el desarrollo de un plexo capilar tridimensional robusto que responde a las señales físicas y químicas locales. En trabajos anteriores, se ha demostrado que esta formación de red es sensible a la densidad de la matriz, la rigidez de la matriz, la inhibición de la metaloprotasaa matricial y el tipo y la concentración de varios mitógenos angiogénicos20,23.

Figure 1
Figura 1: Generación de iPSC-EPs a partir de células madre pluripotentes. (A) WiCell 19-9-11 iPSCs, que mancharon positivo para Oct4, fueron cultivados en medio E8 complementado con 10 M Y-27632 inhibidor DE ROCK para 48 h. (B) Los iPSC fueron entonces inducidos con 6 m de CHIR99021 en medio Basal LaSR durante 48 h, momento en el que las células células células fueron inducidas con 6 m de CHIR99021 en medio Basal LaSR durante 48 h, momento en el que las células células células fueron positivos para Brachyury, un marcador de mesodermo. (C) Las células se cultivaron aún más en medios Basales de LaSR hasta que expresaron CD34, un marcador para progenitores endoteliales. (D) Aproximadamente 15%–25% de las celdas diferenciadas expresadas CD34. Todas las barras de escala representan longitudes de 200 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Generación y análisis de redes vasculares iPSC-EP en hidrogeles de colágeno. (A) Una sección transversal del microambiente 3D utilizado en este ensayo para promover la formación de redes vasculares a partir de iPSC-EPs. Un hidrogel de colágeno flotante se sembra con iPSC-EPs y se expone a EGM-2 complementado con 50 ng/ml VEGF y una dosis temporal de Y-27632. (B) El plexo capilar resultante está altamente ramificado e interconectado, como se visualiza mediante la tinción con F-actina (cian). La imagen binarizada, que se muestra a la izquierda, se genera mediante el preprocesamiento con ImageJ. Esta pila z se analiza a través de un algoritmo previamente desarrollado, que esqueletiza la red (que se muestra en una colección de líneas rojas delgadas) y luego analiza la topología de red para ramas (amarillo), puntos finales (azul), vasos aislados (negros) y conectados buques (rojos). La barra de escala representa una longitud de 100 m. (C) Cambios morfológicos de hidrogeles de colágeno cargados de iPSC-EP: 24 h después de la sembración, los iPSC-EP permanecen esféricos y dentro de 96 h gradualmente toman un fenotipo más alargado. El cultivo posterior da como resultado el montaje de la red VE-Cadherin que contiene lúmenes, como se muestra en el recuadro en el punto de tiempo de 144 horas. Las barras de escala representan longitudes de 400 m; verde: VE-Cadherin, rojo, F-actin, y azul, DAPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Movie 1
Película 1: Z-pila de VASCULATURE GENERATED FRom iPSC-EPs. Las redes vasculares se fijaron, se tiñó con F-actina y se visualizó mediante la adquisición de pilas z en un microscopio confocal. Las rebanadas se adquirieron a intervalos de 17 m. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)

Película suplementaria 1: renderizado 3D de recipientes. Las redes vasculares se fijaron, se tiñó con F-actina (rojo) y VE-cadherina (verde), y se visualizaron mediante la adquisición de pilas z en un microscopio confocal. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Este protocolo implica el cultivo a largo plazo de células en tres tipos de medios de cultivo celular: E8, LaSR Basal y EGM-2. Por lo tanto, se debe tener mucho cuidado para esterilizar adecuadamente todos los materiales. Además, las batas de laboratorio y los guantes limpiados con etanol siempre deben usarse cuando se trabaja en la campana de flujo laminar del laboratorio. Se recomienda realizar pruebas frecuentes de contaminación por micoplasma; si se observa una gran cantidad de escombros durante el cultivo de iPSC o se observa una caída repentina en la eficiencia de diferenciación, la contaminación por micoplasma es una causa probable. Los iPSC-EP generados con este protocolo tienden a depositar una cantidad significativa de ECM, lo que alarga el tiempo de disociación y hace que la suspensión de una sola célula se separe en pequeños grumos. No utilice Trypsin-EDTA (0,25%), ya que la solución puede interrumpir los epítopos CD34 en iPSC-EPs. Sin embargo, el tratamiento con solución de colagenasa/dispensación puede eliminar el ECM depositado y facilitar la disociación con una solución de desprendimiento celular estándar. Después de una extensa disociación, algunos pequeños grupos de células y ECM pueden permanecer; eliminar estos grumos con una punta de pipeta P100, ya que es probable que obstruyan los coladores de células o interfieran con el FACS.

Las células madre pluripotentes son sensibles a la disociación y sufrirán apoptosis en una suspensión de una sola célula a menos que se añada un inhibidor DE LA ROCA (comúnmente Y-27632) al medio24. los IEP-EPsC también son sensibles a la disociación; incluyendo Y-27632 a 10 m durante las primeras 24 horas de cultivo es imperativo para aumentar la supervivencia celular y la proliferación. Por lo tanto, es fundamental que se incluya un inhibidor DE ROCK tanto en el hidrogel como en el medio circundante inmediatamente después de FACS. La densidad de sembración de iPSC-EPs también afecta significativamente el desarrollo de los buques y el tamaño total de la red. Generalmente, una concentración de 500.000 células/ml a 3 millones de células/ml es un rango apropiado de densidades de sembrado. Un aumento adicional en la densidad de sembración a menudo conduce a la compactación de hidrogel y la muerte celular.

Se ha encontrado que la densidad de proteínas estructurales ECM tiene un impacto significativo en el desarrollo de microvasculatura sin ingeniería25,26. Generalmente, el aumento de la densidad de un hidrogel a base de ECM (a menudo colágeno o fibrina) limita la longitud y conectividad de la red vascular. Por lo tanto, es fundamental que se preste atención cuidadosa a la densidad de la matriz de colágeno; concentraciones inferiores a 2 mg/ml promueve la degradación proteolítica prematura de los hidrogeles de colágeno, lo que resulta en una pérdida irreparable de la integridad estructural del hidrogel. Por el contrario, las concentraciones superiores a 4 mg/ml inducen la formación de lumen cortos y anchos que presentan una conectividad deficiente; la deformabilidad del hidrogel y el cambio en el tamaño de los poros son los principales responsables de esta derogación20.

Los hidrogeles de colágeno acelulares y cargados de células no se unen a las placas de unión ultrabaja; los hidrogeles tienden a permanecer suspendidos en los medios de comunicación y ocasionalmente flotan hasta la parte superior del pozo. Si se emplean placas tratadas con cultivo de tejido en este protocolo, los progenitores incrustados migrarán a la parte inferior del pozo y formarán una monocapa casi confluente en la parte inferior de la placa. La disminución resultante en la densidad de sembración celular inhibe el ensamblaje de estos progenitores en redes 3D. Además, si los hidrogeles se funden en los pozos de una placa tratada con cultivo tisular, se unirán débilmente la superficie interna del pozo; esta unión aplica tensión al hidrogel. Dado que esta plataforma fue desarrollada para aislar la importancia de las señales físicas y químicas, es fundamental que no se impartan fuerzas extrañas a las células27. Los hidrogeles flotantes pueden ser difíciles de alimentar porque la mayoría de los medios de cultivo celular se encuentran debajo del hidrogel; para superar esto, incline la placa y utilice una pipeta P100 para quitar los medios del lado de la pared.

Al tomar imágenes de las redes vasculares en un microscopio confocal, es fundamental seguir todos los pasos de lavado para garantizar que el exceso de fluoróforo no resulte en una baja relación señal/ruido. El exceso de fluorescencia puede confundir los algoritmos de umbral predeterminados y hacer que la pila z sea difícil de binarizlar. Para superar este problema, utilice la faloidetina, una toxina fúngica que etiqueta selectivamente la F-actina y muestra una unión limitada fuera del objetivo. En general, utilizar anticuerpos primarios que han sido pre-conjugados a un anticuerpo secundario para limitar la concentración de fluoróforo libre que se difunde a través del gel. Al generar las pilas z se recomienda una profundidad de sector de 10-20 micras para equilibrar el tiempo necesario para adquirir una pila z con la necesidad de una imagen de alta resolución.

Aquí se describe un ensayo cuantitativo para evaluar el potencial vasculogénico de iPSC-EPs en microambientes 3D. Este ensayo utiliza software de código abierto y no se ve afectado por los sesgos del usuario. Aún así, representa un modelo demasiado simplificado del nicho vascular fisiológico. Mientras que iPSC-EPs puede diferenciarse en las células necesarias para la vasculatura funcional madura, este ensayo descuida las contribuciones de otros tipos de células (por ejemplo, fibroblastos y macrófagos) que participan en los procesos vasgenicculos. Además, este sistema es estático y no expone el flujo de los buques en desarrollo. Finalmente, mientras que el colágeno I es una de las proteínas dominantes en el ECM28 y mantiene su arquitectura fibrilar in vitro, depende del lote y se limita a la reticulación física débil cuando se neutraliza a altas temperaturas. A pesar de estas limitaciones, este ensayo representa un avance significativo en la búsqueda de diseñar la vasculatura funcional para la terapia y el modelado de enfermedades cardiovasculares.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Asociación Americana del Corazón (número de subvención 15SDG25740035, otorgado a J.Z.), el Instituto Nacional de Imagen Biomédica y Bioingeniería (NIBIB) de los Institutos Nacionales de Salud (número de concesión EB007507, otorgado a C.C.), y la Alianza para la Investigación y Formación en Rehabilitación Regenerativa (AR3T, concesión número 1 P2C HD086843-01, otorgada a J.Z.). Nos gustaría reconocer a la profesora Jeanne Stachowiak (Universidad de Texas en Austin) por su asesoramiento técnico sobre microscopía confocal. También estamos agradecidos por las discusiones con Samuel Mihelic (La Universidad de Texas en Austin), la Dra. Alicia Allen (La Universidad de Texas en Austin), la Dra. Julie Rytlewski (Biotech Adaptativa) y el Dr. Leon Bellan (Universidad Vanderbilt) por su visión sobre la análisis computacional de redes 3D. Por último, agradecemos al Dr. Xiaoping Bao (Universidad de California, Berkeley) su consejo sobre la diferenciación de iPSC en iPSC-EPs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Slide Angiogenesis Ibidi N/A A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile Corning 7007 Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish
Accutase STEMCELL Technologies 7920 Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS
Advanced DMEM/F12 Thermo Scientific 12634010 The base media for iPSC-EP differentiation. 
Barnstead GenPure xCAD Plus  Thermo Fisher Scientific 50136165 Water purification system; others can be readily substituted
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture Fisher Scientific A8412 To preserve cell viability when FACs sorting
CD34-PE, human (clone: AC136) Miltenyi Biotec 130-098-140 Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs
CHIR99021 LC Laboratories C-6556 Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg VWR 354249 Main component of the 3D microenvironment
Conical centrifuge tubes (15/50 mL) Fisher Scientific 14-959-49D/A Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306 To counterstain and visualize cell nuclei
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11320-082 For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) ThermoFisher 14190-250 To wash monolayer cultures
EDTA Sigma-Aldrich E8008 For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCell C-22011 Promotes endothelial cell viability and proliferation
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001   For maintenance of pluripotent stem cells
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) Sigma-Aldrich 50046 Neutralizes remaining detergent
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% Sigma-Aldrich A8960 Component of iPSC-EP differentiation medium
MATLAB MathWorks 1.8.0_152 Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) Fisher Scientific 356231 Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation
Medium-199 10X Thermo Fisher Scientific 1825015 Used to balance final hydrogel osmolarity and pH
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) VWR 87003-294 Stores small volumes of reagents
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P3813 The main ingredient of the immunostaining solutions
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument
Recombinant Human VEGF 165 Protein R&D Systems 293-VE Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis
Rhodamine phalloidin Themo Fisher Scientific R415 To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks
Triton X-100 (nonionic surfactant) Sigma-Aldrich X-100 Detergent used to gently permeabilize cells
Tween-20 (emulsifying reagent) Fisher Scientific BP337 Increases the binding specificity of the added antibodies
VE-Cadherin (F-8) Santa Cruz Biotechnology sc-9989  To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels
Vitronectin ThermoFisher A14700 For maintenance of pluripotent stem cells
Y-27632 Selleck Chemicals S1049 Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded

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Un modelo 3D In Vitro y una tubería computacional para cuantificar el potencial vasculogénico de los progenitores endoteliales derivados de iPSC
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