CRISPR/Cas12a multiplex Genome redigering af Saccharomyces cerevisiae og skabelsen af gær pixel kunst

Summary

CRISPR/Cas12a-systemet i kombination med et enkelt crRNA-array muliggør effektiv multiplex-redigering af S. cerevisiae -genomet på flere loci samtidigt. Dette påvises ved at konstruere carotenoid producerer gær stammer, som efterfølgende bruges til at skabe gær pixel kunst.

Abstract

Høj effektivitet, brugervenlighed og alsidighed af grupperet regelmæssigt hinanden korte palindromiske gentagelser/crispr-associerede protein 9 (crispr/Cas9) system har lettet avanceret genetisk modifikation af Saccharomyces cerevisiae, en model organisme og arbejdshest i industriel bioteknologi. CRISPR-associeret protein 12a (Cas12a), en RNA-styret endonuklease med funktioner, der adskiller sig fra Cas9, anvendes i dette arbejde, hvilket yderligere udvider den molekylære værktøjskasse til genom-redigeringsformål. En fordel ved crispr/Cas12a systemet er, at det kan bruges i multiplex genom redigering med flere guide RNAs udtrykt fra en enkelt transkriptional enhed (enkelt crispr RNA (crrna) array). Vi præsenterer en protokol for multiplex integration af flere heterologe gener i uafhængige loci af S. cerevisiae genom ved hjælp af crispr/Cas12a system med flere crrnas udtrykt fra en enkelt crrna array konstruktion. Den foreslåede metode udnytter S. cerevisiae evne til at udføre in vivo rekombination af DNA-fragmenter til at samle den enkelte crrna array i en plasmid, der kan bruges til transformerende udvælgelse, samt samling af donor DNA sekvenser, der integreres i genomet på de tilsigtede positioner. Cas12a er præ-udtrykt konstitutivt, lette spaltning af S. cerevisiae genom på de påtænkte positioner ved ekspression af den enkelte crrna array. Protokollen omfatter design og konstruktion af et enkelt crRNA-array og donor-DNA-udtryks kassetter og udnytter en integrationstilgang, der gør brug af unikke 50-BP-DNA-stik sekvenser og separate integrations flanke-DNA-sekvenser, hvilket forenkler Eksperimentel design gennem standardisering og modularisering og udvider rækken af applikationer. Endelig viser vi en ligetil teknik til at skabe gær pixel kunst med en akustisk væske handler ved hjælp af forskelligt farvet carotenoid producerer gærstammer, der blev konstrueret.

Introduction

CRISPR/CAS-enzymer har utvivlsomt revolutioneret molekylær biologi og er blevet bredt vedtaget som værktøjer til ingeniør genomer med en hastighed, der ikke tidligere var gennemførlig¹. Den første ændring af en Saccharomyces cerevisiae genom ved crispr/Cas9 genom redigeringssystem blev rapporteret af DiCarlo et al. ², viser vellykket gen knock-out og gøre punktmutationer ved hjælp af eksternt introducerede oligonucleotides. Yderligere udvikling af gær CRISPR Toolbox omfattede: transkriptional regulering ved fusion af katalytisk inaktive Dead Cas9 (dCas9) med transkriptional Effector domæner for at muliggøre aktivering og hæmning af transkriptionen³, ansøgning om både genomredigering og reguleringsfunktioner for metabolisk pathway Engineering ved samtidig aktivering, undertrykkelse og sletning⁴, sletning af store fragmenter fra S. cerevisiae genom⁵og multiple-kromosom fusioner⁶ .

CRISPR/CAS-genomredigeringssystemer finder deres oprindelse i adaptive immun systemer af bakterier og archaea, og disse systemer er blevet tilpasset af molekylære biologer til genomredigering. Deres funktionalitet er baseret på klynger regelmæssigt Interspaced korte Palindromic gentagelser (CRISPR) DNA regioner kodning RNA ansvarlig for anerkendelse af det fremmede DNA eller RNA og CRISPR associerede gener (CAS) som koder RNA-guidede endonukleaser^1,7,8,9. På baggrund af den nylige genomanalyse af CRISPR/CAS-systemer blev det foreslået at opdele CRISPR/CAS-systemerne i to klasser, fem typer og 16 undertyper¹⁰. De to klasser er kendetegnet på grundlag af organiseringen af Effector komplekser involveret i Target kavalergang. CRISPR/CAS-systemer med en organisation med flere under enheder kategoriseres typisk som klasse 1, hvorimod enkelt enheder under enheds-Effector tilhører klasse 2^10,11. I dette papir udforsker vi klasse 2 type V Cas12a, tidligere kaldet Cpf1^10,12, som er et alternativ til klasse 2 type II Cas9. Selv om Cas9 er velkarakteriseret og meget udbredt i forskning, Cas12a tilbyder yderligere funktioner¹². For det første danner Cas12a et kompleks med CRISPR RNA (crRNA) på 42 til 44 nucleotider uden at kræve en yderligere Trans-aktivering af CRISPR RNA (tracrRNA). Derfor kan en kortere guide RNA udnyttes i genomredigering med CRISPR/Cas12a systemer sammenlignet med CRISPR/Cas9. For det andet muliggør den unikke endonuklease-og endoribonucleaseaktivitet af Cas12a modning af dens præ-crRNA¹³. Denne RNase aktivitet giver mulighed for kodning af flere crrnas på en enkelt crispr crrna array, mens Cas9 kræver separat udtryk for hver såkaldt single-guide RNA (sgrna) eller alternativt for eksempeludtryk for en yderligere endonuklease ( f. eks.Csy4) i kombination med genkendelses motiver for Csy4 omkring hver sgrna^14,15. For det tredje, Cas12a Target site Recognition kræver en protospacer tilstødende motiv (PAM) ved 5 ' ende fra målet og kløver efter + 18/+ 23 position fra sin PAM resulterer i kløvet DNA med klæbrig ender, mens Cas9 kræver en PAM placeret på 3 ' ende fra den Target og spalter efter den-3 position skabe stump ende nedskæringer i DNA¹². For det fjerde er den konsensus-nukleotid sekvens af PAM adskiller mellem Cas12a ((T) TTV) og Cas9 (NGG), hvilket gør Cas12a en lovende kandidat til målretning T-rige promotor og Terminator sekvenser¹⁶. Endelig rapporterede en nylig undersøgelse større målspecificitet for Cas12a end for de indfødte Cas9¹⁷.

Vi præsenterer en protokol for brug af crispr/Cas12a system til genomredigering af S. cerevisiae med særligt fokus på indførelse af flere DNA-udtryks kassetter i uafhængig genomisk loci samtidigt (multiplex genom editing) ved hjælp af et enkelt crRNA-array. De vigtigste trin i protokollen er afbildet i figur 1. Som et bevis på konceptet blev CRISPR/Cas12a-systemet anvendt til at indføre tre udtryks kassetter i genomet i S. cerevisiae , som gør det muligt at fremstille β-caroten¹⁸ som skematisk vist i figur 2. Produktion af β-caroten påvirker fænotype S. cerevisiae: dvs., efter vellykket indførelse af alle tre heterologe gener, der kræves for carotenoider biosyntese, de hvide s. cerevisiae celler bliver gule eller orange, afhængigt af udtryks styrken for hvert gene's promotor. På grund af den simple visuelle læsning af denne vej, er det blevet introduceret til at udvikle avancerede crispr-baserede systemer og metoder til genomredigering^19,20. I dette arbejde er udtryks kassetter, der koder for carotenoide gener Crte, crtyb og crti , blevet konstrueret ved hjælp af en Golden Gate kloning (GGC) approach²¹ med heterologe promotorer og homologe terminatorer bruges til at drive ekspression af gener. Udtrykket kassetter er omgivet af unikke 50-base par (BP) sekvenser, kaldet stik, der giver mulighed for in vivo -samling med integration FLANKE DNA-sekvenser (flankerer regioner) med de samme 50-BP sekvenser, og efterfølgende integration i det genomiske DNA af gær på den position, som er fastlagt af de flankkende regioner. Ved at bruge forskellige promotor styrker, stammer med forskellige niveauer af carotenoider produktion blev opnået resulterer i variation i farven på cellerne. Disse stammer-inspireret af "gær kunstprojekt"²² -blev brugt i en spotting setup med en akustisk væske handler til at skabe en 4-farve høj opløsning "gær fotografi" af Rosalind Franklin. Franklin (1920-1958) var en engelsk kemiker og X-ray crystallographer kendt for sit bidrag til opdagelsen af DNA-strukturen ved foto 51^23,24,25.

Protocol

1. klargøring af Cas12a plasmider

Bemærk: plasmid indeholdende lachnospiraceae bakterie ND2006 Cas12a (LbCpf1, pCSN067) codon, der er optimeret til ekspression i S. cerevisiae, blev tidligere opført¹⁹, deponeret i et plasmid-depot (Se tabellen over Materialer). Dette er en enkelt-kopi episomal s. cerevisiae/E. coli shuttle plasmid indeholdende en kanmx resistens markør gen at tillade udvælgelse af s. cerevisiae transformerede på geneticin (G418).

1. Få pCSN067 plasmid (Se tabellen over materialer).
2. Amplificere pCSN067 plasmid for at opnå en høj mængde.
   1. Transformér 25 μL af de kemisk kompetente E. coli -celler med plasmid-pCSN067 i henhold til producentens protokol. Fortynd transformation mix 10 og 50 gange i 2x peptone-gær (PY). Plader ud 10x og 50x fortyndinger på 2x PY agar plader indeholdende ampicillin (0,1 g/L) og Inkuber natten over ved 37 °C.
   2. Pick 2 til 3 kolonier og inokulere hver koloni i 3 mL 2x PY og vokse natten over ved 37 °C i en ryste inkubator ved 180 rpm.
   3. Rense plasmid ved hjælp af en plasmid rensning kit i henhold til producentens anvisninger.

2. klargøring af den enkelt crRNA array-udtryks kassette

1. Forbered det enkelte crRNA-array.
   Bemærk: det enkelte crRNA-array består af en SNR52 RNA polymerase III-promotor fra S. cerevisiae², en direkte gentagelse, der er specifik for LbCas12a og et afstandsstykke (genomisk målsekvens), sammen gentages for hvert mål¹⁹ og slutter med en SUP4 Terminator fra S. cerevisiae². Det enkelte crRNA-array samles ved in vivo -rekombination i det lineariserede plasmid-pRN1120 for at generere et cirkulært plasmid, således at regioner, der er homologe til plasmid-pRN1120, skal være til stede i starten og slutningen af det enkelte crrna-array (Se figur 2a ). Det anbefales på forhånd at evaluere funktionaliteten af en række designede crRNAs separat¹⁹. Disse oplysninger bruges efterfølgende til at vælge de fleste funktionelle crRNAs for at kombinere disse i de direkte gentagelses-og afstands sekvenser for at oprette et enkelt crRNA-array til multiplexing-formål.
   1. Bestil det enkelte crRNA-array til multiplex-genomredigeringseksperimenter som syntetisk DNA (Se DNA-sekvensen af det enkelte crRNA-array i supplerende tabel 1).
   2. Amplificere det bestilte enkelt crrna-array (f. eks.ved hjælp af primere KC-101 og KC-102 (supplerende tabel 2)). PCR-amplifikationmixet indeholdende: 0,5 μl DNA-Polymerase, 10 μl 5x buffer kræves til DNA-Polymerase, 1 μl 10 mm dntps, 2,5 μl 10 μm fremad primer, 2,5 μl 10 μm omvendt primer, 2 μl DNA-skabelon ved en koncentration på 5 ng/μl og ultrarent H ₂ O op til et samlet volumen på 50 μL.
      1. Udfør reaktionen i en termo cycler ved hjælp af følgende program: i) 98 °C i 3 min., (II) 98 °C i 10 s, (III) 60 °C i 20 s, (IV) 72 °C i 15 s – Gentag trin (II) til (IV) 30 gange, (v) 72 °C i 5 min. (vi) hold ved 12 °C indtil yderligere analyse.
   3. Analysér PCR-produkterne ved elektroforese ved at køreprøverne på en 0,8% agopstået gel ved 5 V/cm for 40 min ved hjælp af et DNA-indlæsnings farve-og DNA-stigen med DNA-fragmenter i et interval på 100 til 10.000 BP.
   4. Du skal rense PCR-produkterne ved hjælp af et PCR-rensningsudstyr i henhold til producentens anvisninger.
2. Forbered den enkelte crRNA array modtager plasmid.
   Bemærk: det enkelte crRNA-array udtrykkes fra S. cerevisiae/E. coli shuttle plasmid PRN1120¹⁹ (Se tabellen over materialer). Denne multi-Copy plasmid indeholder en natmx resistens markør gen til at tillade udvælgelse af S. cerevisiae transformerede på nourseothricin (NTC).
   1. Få pRN1120 plasmid.
   2. Amplificere pRN1120 plasmid for at opnå en høj mængde.
      1. Transformér 25 μL købte kemisk kompetente E. coli -celler med plasmid pRN1120 i henhold til producentens protokol. Fortynde transformation mix 10 og 50 gange i 2x PY. Plader ud 10x og 50x fortyndinger på 2x PY agar plader indeholdende ampicillin (0,1 g/L) og Inkuber natten over ved 37 °C.
      2. Pick 2 til 3 kolonier og inokulere hver koloni i 3 mL 2x PY og vokse natten over ved 37 °C i en ryste inkubator ved 180 rpm.
      3. Rense plasmid ved hjælp af en plasmid rensning kit i henhold til producentens anvisninger.
   3. Linearize plasmid pRN1120 med EcoRi-HF og xhoI. Til dette, forberede en fordøjelse blanding sammensat af 1 μg pRN1120, 5 μL 10x buffer (1x buffer indeholder 50 mM kaliumacetat, 20 mM Tris-acetat, 10 mM magnesium acetat, 100 μg/mL bovin serumalbumin [BSA]; pH 7,9), 1 μL EcoRi-HF (20 U) , 1 μl xhoi (20 U) og ultrarent H₂O op til et samlet volumen på 50 μl. Inkuber fordøjelses blandingen ved 37 °c i 2 timer og inaktiveres ved 65 °c i 20 min.
   4. Analysér lineariseret plasmid ved elektroforese på en agopstået gel (0,8%, 40 min, 5 V/cm) ved hjælp af et DNA-indlæsnings farvestof og DNA-stigen med DNA-fragmenter i et interval på 100 til 10.000 BP. Som en kontrol omfatter en cirkulær plasmid i analysen.
   5. Rense den lineariserede plasmid ved hjælp af en PCR rensning kit i henhold til producentens anvisninger.

3. klargøring af Promoter-ORF-Terminator (POT) donor DNA-konstruktioner

1. Bestil et sæt promotor (P) af forskellig styrke, åben læse ramme (O) og Terminator (T) sekvenser som syntetisk DNA, således at hvert element indeholder standardiserede 4-BP genkendelses sekvenser, der er flankeret af BSAi sites for at muliggøre Golden Gate kloning ( GGC) montering²⁶ (se de detaljerede design i supplerende tabel 3 og sekvenser i supplerende tabel 4).
2. Saml POT Expression kassetter bestående af en promotor, åben læse ramme, Terminator og stik sekvenser via en 4-del samling ved hjælp af en GGC reaktion²¹, ind i en destination vektor, der allerede indeholder præ-specificerede 50-BP-stik sekvenser ( Se supplerende tabel 4 og referencer^26,27).
   1. Mål koncentrationen af DNA-dele ved hjælp af et spektrofotometer. Hver DNA-del fortyndes i ultrarent H₂O til en endelig koncentration på 15 fmol/μl.
   2. Forbered en reaktionsblanding bestående af DNA-fragmenter: 2 μL promotor, 2 μL åben læse ramme, 2 μL Terminator og 2 μL backbone (niveau 1 destinations vektorer som beskrevet i ²⁶), 4 μl 5X T4 DNA-ligasebuffer, 2,5 μl 1 U/ΜL T4 DNA-ubiquitinligase , 1,5 μl af 20 e/μl BSAi-HF og ultrarent H₂O op til et samlet volumen på 20 μl.
   3. Udfør GGC reaktionen i en termo cycler ved hjælp af følgende program: (i) 37 °C i 2 min, (II) 16 °C i 5 min – Gentag trin (i) og (II) 50 gange, (III) 50 °C for 60 min, (IV) 80 °C for 45 min, (v) hold ved 12 °C indtil yderligere analyse.
3. 25 μL af de indkøbte kemisk kompetente E. coli²⁸ -celler transformeres med 3 μl af GGC-reaktionsblandingen i henhold til fabrikantens protokol. Fortynde transformation mix 10 og 50 gange i 2x PY. Plader ud 10x og 50x fortyndinger på 2x PY agar plader indeholdende ampicillin (0,1 g/L) og Inkuber natten over ved 37 °C.
4. Pick 2 til 3 kolonier og inokulere hver koloni i 3 mL 2x PY og vokse natten over ved 37 °C i en ryste inkubator ved 180 rpm.
5. Rense plasmiderne ved hjælp af en plasmid rensning kit i henhold til producentens anvisninger.
6. Kontroller, om POT Expression-kassetterne blev samlet korrekt i GGC-reaktionen med PCR.
   1. Design primere supplerer den konnektor sekvens, som er til stede ved starten og enden af hver udtryks kassette (Se figur 2b). For konnektorer, som er valgt i denne protokol, anvendes primere KC-103 til KC-108 (Se supplerende tabel 2).
   2. Klargør PCR-amplifikationblandinger for hvert plasmid, der indeholder: 0,5 μL korrekturlæsning af DNA-Polymerase, 10 μL 5x buffer, der kræves til DNA-Polymerase, 1 μL 10 mM dNTPs, 2,5 μL 10 μM fremad primer, 2,5 μL 10 μM omvendt primer, 2 μL DNA-skabelon med en koncentrat 5 ng/μl og ultrarent H₂O op til et samlet volumen på 50 μl.
   3. Udfør PCR-reaktionen i en termo cycler ved hjælp af følgende program: (i) 98 °C 3 min, (II) 98 °C for 10 s, (III) 60 °C for 20 s, (IV) 72 °C i 2 min 30 s – Gentag trin (II) til (IV) 30 gange, (v) 72 °C i 5 min , vi) holde ved 12 °C indtil yderligere analyse.
      Bemærk: resulterende PCR-produkter består af 50-BP af 5 ' Connector, promotor, åben læse ramme, Terminator og 50-BP af 3 '-stikket.
7. Analysér PCR-produkterne ved elektroforese ved at køreprøver på en 0,8% agopstået gel ved 5 V/cm for 40 min ved hjælp af et DNA-indlæsnings farve-og DNA-stigen med DNA-fragmenter i et interval på 100 til 10.000 BP.

4. forberedelse af integration flanke DNA-sekvenser, der indeholder forbindelses sekvenser

1. Rense genomisk DNA fra vildtype S. cerevisiae CEN. PK113-7d²⁹.
   1. Pres stammen i en 500 ml ryste kolbe fyldt med 100 ml gærekstrakt pepton dextrose (yepd, 2% glukose) medium ved 30 °c og omrystning ved 250 rpm i 48 timer.
   2. Cellerne høstes ved centrifugering af 2 mL bouillon ved 16.000 x g i 1 min., og supernatanten kasseres.
   3. Cellerne opslæmmes i fysiologisk salt (200 μL; 0,85% NaCl-opløsning) med RNase (10 μL, 10 mg/mL) og gær lytisk enzym (4 μL). Cellesuspensionen inkubates ved 37 °C i 15 minutter.
   4. Tilsæt 300 μL cellelyse opløsning (Se tabel over materialer) og vortex kort tid.
   5. Tilsæt 168 μL protein fældnings opløsning (Se tabel over materialer) og vortex kraftigt i 20 s.
   6. Du udskille proteinfraktionen ved centrifugering ved 16.000 x g og 4 °c i 10 min. Saml 600 μl supernatanten i et nyt rør og bland med 600 μl isopropanol og vortex om kort tid.
   7. Gendan DNA ved at dreje ned ved 16.000 x g ved stuetemperatur i 10 min. kassér supernatanten og opbevar pellet.
   8. Pelleten vaskes med 200 μL ethanol (70%). Centrifugeres ved 16.000 x g ved stuetemperatur i 10 minutter, og supernatanten fjernes. Ethanol fordampe ved inkubering af røret ved stuetemperatur i 10 minutter med låget åbnet.
      Bemærk: Hvis væsken i røret stadig er synlig, gentages trin 4.1.8. Du må ikke tørre pellet i mere end 10 minutter for at forhindre nedsat Opløselighed af DNA.
   9. DNA opløses i 50 μL TE-buffer. Oprenset DNA opbevares ved 4 °C.
2. For hvert integrations sted vil design integration flankere DNA-sekvenser (ca. 500 BP), således at ca. 1000 BP af genomisk DNA fjernes ved indføring af donor-DNA (Se skematisk design i figur 2b og sekvenser i supplerende Tabel 4).
3. Design primere til at generere de ledsage regioner ved PCR.
   1. For den venstre ledsage region, design fremad og reverse primere at forstærke ca 500 BP af genomisk DNA region placeret 5 ' (venstre) af integrations stedet af interesse.
      Bemærk: Forward primer indeholder 20 BP af homologi med den tilsigtede ledsage region. Den omvendte primer indeholder 20 BP med homologi med den tilsigtede ledsage region og indeholder den ønskede 50-BP Connector sekvens for at muliggøre in vivo samling i Cas12a redigering på genomet senere.
   2. For den højre ledsage region, design fremad og reverse primere at forstærke ca 500 BP af genomisk DNA-region placeret 3 ' (højre) af integrations stedet af interesse.
      Bemærk: Forward primer indeholder 20 BP med homologi med den tilsigtede ledsage region og indeholder den ønskede 50-BP Connector sekvens for at muliggøre in vivo assembly i Cas12a redigering på genom senere. Den omvendte primer indeholder 20 BP af homologi med den tilsigtede ledsage region.
4. Forstærke flankerings regionerne med de designede primere (f. eks.primere KC-109 til KC-120 omsluttet af supplerende tabel 2).
   1. Mål koncentrationen af renset genomisk DNA, der vil fungere som skabelon i PCR. DNA-koncentrationen justeres til 50 ng/μL.
   2. Forbered PCR amplifikationblandinger bestående af genomisk DNA (1 – 4 μL af 50 ng/μL genomisk DNA-fortynding) renset i trin 4,1, fremad og omvendt primer (10 μM hver), 1 μL 10 mM dNTPs, 10 μL 5x buffer, der kræves til DNA-Polymerase, 0,5 μL DNA-Polymerase (1,0 U) , og ultrarent H₂O op til total volumen på 50 μl.
   3. Udfør PCRs i en termo cycler ved hjælp af følgende program: (i) 98 °C i 3 min, (II) 98 °C for 20 s, (III) 60 °C for 20 s, (IV) 72 °C for 15 s, Gentag trin (II) til (IV) 30 gange, (v) 72 °C i 5 min , vi) holde ved 12 °C indtil yderligere analyse.
5. Analysér PCR-produkterne ved elektroforese på en 0,8% agopstået gel ved 5 V/cm for 40 min ved hjælp af et DNA-indlæsnings farve-og DNA-stigen med DNA-fragmenter i et interval på 100 til 10.000 BP.
6. Rens de korrekte PCR-produkter ved hjælp af et PCR-rensnings sæt i henhold til producentens anvisninger.

5. omdannelse til S. cerevisiae

Bemærk: Udfør transformation ved hjælp af en protokol baseret på de metoder, der er udviklet af Gietz et al. (1995) ³⁰ og Hill et al. ³¹ , som kan anvendes til forskellige stammer af S. cerevisiae. Den nedenfor beskrevne protokol er tilstrækkelig til 1 transformation.

1. Forbered de nødvendige løsninger til transformation.
   1. Forbered følgende stamopløsninger og filter-sterilize: 10x TE buffer indeholdende 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA, samlet volumen på 50 mL; 1 M LiAc ved pH 7,5, totalt rumfang 50 mL; 50% PEG 4000, samlet volumen på 100 mL.
      Bemærk: Kontrollér altid, at PIND 4000-bestanden er på pH 5. Denne bestand bør ikke opbevares længere end en måned.
   2. Forbered følgende opløsninger ved hjælp af lagre: Forbered LiAc-TE-opløsning, der indeholder 0,1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, samlet volumen på 0,5 mL. Forbered PEG-LiAc-TE-opløsning, der indeholder 40% PEG 4000, 0,1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, samlet volumen på 1 mL.
      Bemærk: det er afgørende for en vellykket transformation, at PEG-LiAc-TE-og LiAc-TE-opløsninger er frisklavede.
2. Første Transformations runde (Forbered stammen på præudtrykkende Cas12a).
   Bemærk: Brug vand med en pH højere end 5 i alle Transformations trinene. Det anbefales at bruge demineraliseret vand i alle faser af omdannelsen.
   1. Forbered en præ-kultur af voksende stamme CEN. PK113-7D i en 100 mL ryste kolbe indeholdende 20 mL YEPD (2% glucose) medium og Inkuber natten over ved 30 °C med omrystning ved 250 rpm.
   2. Mål OD₆₀₀ af præ-kultur (OD_PC). Fortyndingsfaktoren (DF) beregnes mellem prækulturens volumen og den mængde frisk medium, der kræves til fremstilling af de celler, der Præudtrykker Cas12a, og som skal anvendes i omdannelsen (Transformations kulturen). I beregningerne forudsættes den optiske densitet af Transformations kulturen (OD_TC) at være 1,0 efter det inkubations trin, der er beskrevet i punkt 5.2.3 (ti).
      
      hvor ti og τ er henholdsvis inkubationstiden og fordoblings tiden.
      1. Mængden af den præ-kultur (v_i), der kræves til inokulering af Transformations kulturen (v_TC), beregnes på grundlag af fortyndingsfaktoren.
         
   3. Transformations kulturen forberedes ved inokulering af 20 mL YEPD (2% glucose) (v_TC) med det prækulturvolumen, som er fastlagt i det foregående trin (v_i). Inkuber ved 30 °C med omrystning ved 250 rpm.
   4. Mål OD₆₀₀ af Transformations kulturen, indtil en OD₆₀₀ af 1,0 er nået.
   5. Cellerne høstes ved centrifugering af 20 mL bouillon ved 2.500 x g i 5 min. kassér supernatanten og vask cellerne i 20 ml rumtemperatur demineraliseret vand. Gentag Centrifugerings trinnet, og opbevar celle pellet.
   6. Cellerne opslæmmes i 100 μL LiAc-TE opløsning og overføres til et mikrocentrifuge glas.
   7. Tilsæt 5 μL enkelt-strenget bære-DNA (10 mg/mL lakse sæddna) og bland ved pipettering.
   8. 1 μg plasmid pCSN067 afpipetteres til mikrocentrifuge røret.
      Bemærk: det totale volumen af DNA-blandingen må ikke overstige 100 μL for at forhindre en lavere Transformations effektivitet.
   9. Tilsæt 600 μL PEG-LiAc-TE-opløsning, og bland ved pipettering. Inkuber i 30 minutter ved 30 °C, mens der rystes ved 450 rpm i en bordplade varmeblok.
   10. Tilsæt 70 μL DMSO (100%) til Transformations blandingen og blandes ved pipettering. Udfør varmechok ved at inkube Transformations blandingen ved 42 °C i 15 minutter i et vandbad.
   11. Genopret cellerne ved at overføre blandingen til en 15 mL rund bund slange og tilsæt 10 mL YEPD (2% glucose) til røret. Inkuber natten over ved 30 °C med omrystning ved 250 rpm.
   12. Omdannelses blandingen centrifugeres ved 2.500 x g i 5 min. kassér supernatanten og resuspender celle pellet i ca. 200 μl af den resterende opløsning.
   13. Pladen ud 150 μL af Transformations blandingen og en 20x fortynding i YEPD (2% glucose) af transformation mix på YEPD (2% glucose) agar plader suppleret med 0,2 g/L G418. Pladerne inkubates ved 30 °C i 48 – 72 timer.
   14. Vælg en enkelt transformant og re-streak på en YEPD (2% glucose) agar plade suppleret med 0,2 g/L G418 for at opnå enkelt kolonier.
3. Anden Transformations runde (Udfør multiplex genom-redigering med crispr/Cas12a).
   1. Forbered en præ-kultur ved at dyrke stammen præudtrykkende Cas12a, skabt i den første Transformations runde (trin 5,2), i en 100 mL ryste kolbe indeholdende 20 mL YEPD (2% glukose) medium suppleret med 0,2 g/L G418. Inkuber natten over ved 30 °C med omrystning 250 rpm.
      Bemærk: for flere transformationer, tilpasse mængden af præ-kultur.
   2. Følg trinene 5.2.2 til 5.2.7 for den første Transformations runde.
      Bemærk: for flere transformationer, tilpasse mængden af nødvendige løsninger og kultur af stammen præ-udtrykke Cas12a.
   3. 1 μg af det enkelte crRNA-array afpipetteres, 1 μg af det lineariserede recipient plasmid til crRNA-systemet, 1 μg donor-DNA og 1 μg af hver flanken region (trin 4,3) i mikrocentrifuge røret.
      Bemærk: det totale volumen af DNA-blandingen må ikke overstige 100 μL for at forhindre en lavere Transformations effektivitet.
   4. Forbered følgende kontrolelementer til omdannelsen: negativ kontrol (ultrapure H₂O); positiv kontrol til bestemmelse af Transformations effektiviteten (1 μg cirkulær pRN1120) en kontrol, der kontrollerer, om indførelsen af donor-DNA udføres via crispr-redigering (1 μg cirkulært pRN1120, 1 μg af alle donor-DNA-udtryks kassetter og 1 μg ledsage-regioner, men ingen enkelt crrna-array); kontrollere, om donor-DNA kan integreres uden for Target (1 μg lineariseret pRN1120, 1 μg donor-DNA-udtryks kassetter og 1 μg af det enkelte crRNA-array, men ingen flankområder); et kontrolelement, der verificerer fuld linearisering af pRN1120 (1 μg lineariseret pRN1120).
   5. Følg trinnene 5.2.9 for at 5.2.12 for den første Transformations runde.
   6. Pladen ud 150 μL af Transformations blandingen og 20x fortynding i YEPD (2% glucose) af transformation mix på YEPD (2% glucose) agar suppleret med 0,2 g/L G418 og 0,2 g/L NTC. Kontrol på YEPD (2% glukose) agar suppleret med det relevante valg (G418 og/eller NTC eller intet valg). Pladerne inkubates ved 30 °C i 48 – 72 timer.
   7. Vælg en enkelt farvet transformant og re-streak på en YEPD (2% glukose) agar plade for at opnå enkeltfarvede kolonier.

6. evaluering af genomredigeringen effektivitet

1. Tæl antallet af farvede kolonier og hvide kolonier på Transformations pladerne.
2. Beregn genomredigeringen effektivitet ved at dividere antallet af farvede kolonier med det samlede antal kolonier (både hvide og farvede), som vist i tabel 1.

7. bekræftelse af integration af donor-DNA på det tilsigtede loci

1. Re-streak en farvet enkelt koloni fra en transformation plade på en YEPD (2% glukose) agar plade uden G418 og NTC udvælgelse og inkubere i 48 timer ved 30 °C.
2. Vælg en enkelt koloni og inokulere en 500 mL ryste kolbe fyldt med 100 mL YEPD (2% glukose) medium. Inkuber i 48 timer ved 30 °C og rystes ved 250 rpm.
3. Isolerer det genomiske DNA som beskrevet i afsnit 4,1.
   Bemærk: Alternativt kan du bruge en protokol til fremstilling af gær til koloni PCR, som tidligere blev foreslået af looke et al. ³². i dette tilfælde kan væksten i flydende medium (afsnit 7,2) springes over.
4. Bekræft korrekt integration ved forstærkning af to fragmenter pr. integreret udtryks kassette.
   1. Design primere, som udgløder til genomisk DNA uden for de transformerede flankerings områder og det gen af interesse (Se eksemplerne i supplerende tabel 2, kc-121 til kc-132). Når du bruger primere KC-121 til KC-132, skal du indstille udglødnings temperaturen i PCR-programmet til 62 °c.
   2. Amplificere region af interesse som beskrevet i afsnit 4.4.2. Tilpas PCR-programmet ved specifikt at justere tidspunktet for udvidelses trinnet i PCR i henhold til skabelonens længde og producentens anbefalinger til DNA-Polymerase.
5. Kontroller størrelsen af PCR-produkterne ved elektroforese på en agrose gel (0,8%, 40 min, 5 V/cm) ved hjælp af et DNA-indlæsnings farve-og DNA-stigen med DNA-fragmenter i et interval på 100 til 10.000 BP.

8. skabelse af gær pixel kunst ved hjælp af en akustisk væske handler

1. Forbered en billed skabelon til gær pixel kunst.
   1. Tilpas størrelsen på det oprindelige RGB-billede (220 × 280 pixels, se de repræsentative resultater), f. eks. brug af ImageJ til at oprette en endelig 64 × 96 pixels (bredde × højde) gråskalabillede visualiseret i tilsigtede farver (repræsentative resultater).
   2. Konverter RGB-billedet til gråskala ved hjælp af denne formel:
      
      hvor jeg_gr, jeg _r, jeg_g, jeg_b er den grå, rød, grøn og blå intensiteter, hhv.
   3. For at kategorisere pixels, udvikle en ImageJ plugin anvende følgende regler: (a) Hvis jeg_gr er ≤ 64, skal du bruge den mørke appelsin gær (stamme 1, supplerende tabel 3) for denne pixel. b) Hvis 64 < i_gr ≤ 128, anvendes den orange gær (stamme 2, supplerende tabel 3) til denne pixel. c) hvis 128 < i_gr ≤ 192, anvendes den gule gær (stamme 3, supplerende tabel 3) til denne pixel. d) Hvis jeg_gr > 192, anvendes den hvide gær (CEN. PK113-7D) for denne pixel.
2. Spot gærceller at skabe gær pixel kunst.
   1. 500 mL ryste kolber indeholdende 100 mL YEPD (2% glucose) medium med tre forskelligt farvet carotenoid, der producerer S. cerevisiae stamme og vildtype CEN. PK113-7D. Inkuber kulturer natten over ved 30 °C med omrystning ved 250 rpm.
   2. Overfør 0,5 mL af natten kultur til et rør fyldt med 0,5 mL steril ikke-ionisk tæthed gradient medium (Se tabellen over materialer). Bland med vortexning kortvarigt.
   3. Overfør cellesuspensionen til et kvalificeret reservoir, 2 x 3 brønd. Udfør spotting ved hjælp af et akustisk væske håndterings instrument fra en kvalificeret reservoir kilde plade til en mikropladen (Se tabellen over materialer) indeholdende 50 ml yepd (2% glukose) agar. For at forenkle plating, definere brønde på pladen, f. eks. Brug en mikropladen som en 6144 brønd plade (64 × 96).
   4. Spot 25 nL af hver S. cerevisiae stamme fra 2x 3 brønd reservoir kilde pladen ved hjælp af en. csv-fil med væsken kalibrering indstilling 6Res_aq_gpsa2 på destinationen mikropladen. Definer hver af disse 25 nL dråber som en pixel i 64 x 96 gitter, som er oversat til brønden positioner (A01, B01, C01 etc.).
   5. Mikropladen inkubates ved 30 °C i 48 timer. For at intensivere farverne på stammerne opbevares agarpladen ved 4 °C i mindst 72 timer.

Representative Results

Protokollen til multiplex-genomredigering ved hjælp af CRISRP/Cas12a blev påvist ved at konstruere tre carotenoid-producerende S. cerevisiae -stammer, som udtrykker crte-, Crtyb -og crti -gener ved hjælp af heterologe høj, medium og lav styrke: stamme 1, 2 og, 3 henholdsvis (supplerende tabel 3). Opførelsen af disse stammer nødvendig generation af tre donor DNA-udtryk kassetter og seks ledsage regioner pr stamme for målretning til tre forskellige loci i genomisk DNA (vist i figur 2B). Som beskrevet heri blev Promoter, åben læse ramme, Terminator og to sammenhængende 50-BP-stik sekvenser samlet i en udtryks kassette via en Golden Gate-klonings reaktion, og samlingen blev verificeret af PCR (figur 3a). Det enkelte crRNA-array blev bestilt som et syntetisk DNA-fragment og blev forstærket af PCR (figur 3B). Recipient plasmid for det enkelte crRNA array (plasmid pRN1120) blev lineariseret med EcoRi-HF og xhoI og linearisering blev bekræftet af elektroforese (figur 3C). Design-og nukleotidsekvenserne for de indførte donor-DNA-udtryks kassetter og flankerings områder er vist i supplerende tabel 3 og supplerende tabel 4. Sekvensen af enkelt-crRNA-matrix udtryks kassetter findes i supplerende tabel 1. Funktionaliteten af Spacers inkluderet i den enkelte crrna array blev testet på forhånd af singleplex genom redigering med individuelle crrnas¹⁹.

Effektiviteten af genomredigeringen ved hjælp af Cas12a blev først evalueret baseret på antallet af farvede kolonier opnået efter transformation (tabel 1, figur 4). Redigeringen effektiviteten af de tre konstruerede stammer varierede fra 50% til 94%. Indførelsen af udtryks kassetter, der anvendes til generering af stamme 1, viste den laveste redigerings effektivitet, muligvis forårsaget af donor-DNA'ET (dvs.disse udtryks kassetter indkode crte, Crtyb og crti fra tre højstyrke promotorer). For det andet blev korrekt integrering af de tre donor-DNA-udtryks kassetter ved det tilsigtede loci på det genomiske DNA bekræftet af PCR (figur 5). Primere blev konstrueret på en sådan måde, at PCR-produkter blev opnået, når den korrekte integration af donor-DNA på det tilsigtede locus forekom. For hvert Transformations eksperiment blev otte kolonier plukket fra Transformations pladen og afprøvet (Bemærk, at kun tre er præsenteret i figur 5). I almindelighed, ud af 8 kolonier testet pr donor DNA, korrekt integration af Crte donor DNA på INT1 locus, CRTYB på INT2 Locus og crti på INT3 locus blev bekræftet i > 90% af transformanterne. Disse resultater demonstrere crispr/Cas12a system i kombination med en enkelt crrna array muliggør effektiv multiplex redigering af S. cerevisiae genom på flere loci samtidigt.

Derudover viser vi skabelsen af "gær pixel kunst" ved hjælp af de tre carotenoid producerende stammer, der blev bygget sammen med en ikke-farvet vildtype stamme. Med udgangspunkt i et sort og hvidt billede af Rosalind Franklin (figur 6a) blev der oprettet et 4-farvet billede (figur 6B) og spotting List, som derefter blev brugt til at spotte de fire forskellige gærstammer på en agar-mikroplade ved hjælp af en akustisk væske handler, hvilket resulterer i en høj opløsning "gær maleri" af Rosalind Franklin (figur 6C, D, E).

Figur 1 : Workflow af protokollen for crispr/Cas12a multiplex genom redigering i S. cerevisiae. Arbejdsprocessen indeholder vigtige trin i den præsenterede metode. For detaljer se protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Skema af crispr/Cas12a multiplex genom redigering ved hjælp af en enkelt crrna array. (A) det enkelte crrna-array er sammensat af tre crRNAs-enheder i deres modne form, en 20-BP Direct REPEAT-specifik for LbCas12a (grå firkanter) med en 23-BP guide sekvens (farvede diamanter). Udtryk af crRNA-arrayet aktiveres af SNR52 promoter og SUP4 Terminator. Omdannelse af S. cerevisiae med en lineariseret pRN1120 og den enkelt crrna array Expression kassette indeholdende homologi med pRN1120 (diagonal striber) giver mulighed for in vivo rekombination i en cirkulær plasmid i celler præ-udtrykke LbCas12a. Det enkelte crRNA-array behandles efterfølgende af Cas12a. B) Cas12a er rettet mod de tilsigtede INT1, INT2 og INT3 genomiske målområder og skaber dobbelt strandede pauser. I Transformations blandingen blev donor-DNA bestående af ledsage-regioner og carotenoid-genekspressions kassetten inkluderet. Donor-DNA-samlinger blev rettet mod en enkelt strækning af DNA i genomisk DNA omkring INT1 (Crte), INT2 (crtyb) og INT3 (crti) loci ved in vivo rekombination på grund af tilstedeværelsen af 50-BP homologe stik-sekvenser, angivet som 5, A, B, C, D eller E. P1-P3, forskellige initiativtagere T1 – T3, forskellige terminatorer. Dette tal er blevet modificeret fra Verwaal et al. 2018¹⁹. Genetiske konstruktioner vist ved hjælp af syntetisk biologi Open Language (SBØL) visuelle symboler⁴⁰. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : PCR kontrollerer eksperimenter med genomredigering. (A) verifikation af Golden Gate kloning reaktioner af MONTEREDE donor DNA kassetter. Opnåede resultater er i enighed med forventede længder. (B) PCR af det enkelte crrna-array. C) linearisering af plasmid pRN1120. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 : Plader af S. cerevisiae transformationer ved hjælp af multiplex genom redigeringsmetode. A) stamme 1,derudtrykker crte, crtyb og crti fra tre stærke initiativtagere (mørke orange kolonier). B) stamme 2, som udtrykker crte, Crtyb og crti fra tre medium styrke promotorer (appelsin kolonier). C) stamme 3, som udtrykker crte, Crtyb og crti fra tre lavstyrke promotorer (gule kolonier). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5 : PCR, som verificerer integrationen af donor-DNA-udtryks kassetterne ved det tilsigtede loci inden for genomisk DNA. A) verifikation af tre kolonier af stammen 1. B) verifikation af tre kolonier af stammen 2. C) verifikation af tre kolonier af stammen 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6 : Gær pixel kunst af Rosalind Franklin. (A) sort og hvid RGB foto af 220 × 280 pixels af Rosalind Franklin, der blev brugt som en skabelon. (B) computer konvertering af det sorte og hvide foto af Rosalind Franklin ind i en 4-farvet 64 × 96 pixel liste. (C) foto af gær pixel kunst med 64 × 96 gær kolonier med en zoomet-in sektion. (D) foto af en akustisk væske handler med to fulde dyrkede plader. (E) foto af en fuld dyrket mikropladen med 64 × 96 gær kolonier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

	Stamme 1	Stamme 2	Stamme 3
Farvede kolonier	16	279	220
Hvide kolonier	16	18	18
Kolonier i alt	32	297	238
Effektivitet	50%	94%	92%

Tabel 1: redigering af effektiviteten af multiplex-genomredigeringstilgangen.

crRNA array sekvensa, b, c, d, e, f

Har du ikke mere at gøre med, er det ikke en af de mest iøjne faldende, men ikke en af de andre...... Tctttgaaaa HAR du en af de andre, som har været med til at gøre det, er det ikke en af de andre. TGATTACATGTACGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTGTAGTGCCCTCTTGGGCTAGCGGTAAAGGTGCGCA TTTTTTCACACCCTACAATGTTCTGTTCAAAAGATTTTGGTCAAACGCTGTAGAAGTGAAAGTTGGTGCGC har studeret på AATGTTCGKCCT-Pccgtaagataättätka har studeret påGccn-CCT-Pkttn-AATGA GCCGGAGCCGACGGAatttctactaagtgtagattgcccctcttatacgattatattTT TTTTTGTTTTTTATGTCTggggggcccggtacccagcttttgttccctttagtgagg GTTAATTCCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG

a. homologi til pRN1120 (fed). b. SNR52 promotor (kursiv). c. genomiske målsekvenser (understreget). d. guide direkte gentagelser specifikke for LbCas12a (kursiv, fed). e. SUP4 Terminator (kursiv). f. Homology til pRN1120 (fed).

Supplerende tabel 1: enkelt crRNA-array for LbCas12a indeholdende homologi med plasmid pRN1120.

Navn	Sekvensa	Beskrivelseb	Anvendt i punkt
KC-101	CATGTTTGACAGCTTATCATC	FW primer til forstærkning af enkelt crRNA-array	2.1.4
KC-102	CACACAGGAAACAGCTATGAC	RV primer til forstærkning af enkelt crRNA-array	2.1.4
KC-103	AAGCGACTTCCAATCGCTTTGC	FW primer til forstærkning af donor DNA med stik 5	3.6.1
KC-104	AAAGCAAAGGAAGGAGAGAAC	RV primer til forstærkning af donor DNA med Connector A	3.6.1
KC-105	CGGATCGATGTACACAACCG	FW primer til forstærkning af donor DNA med stik B	3.6.1
KC-106	CAACAGGAGGCGGATGGATATAC	RV primer til forstærkning af donor DNA med stik C	3.6.1
KC-107	AACGTTGTCCAGGTTTGTATCC	FW primer til forstærkning af donor DNA med Connector D	3.6.1
KC-108	AGGTACAACAAGCACGACCG	RV primer til forstærkning af donor DNA med stik E	3.6.1
KC-109	CACTATAGCAATCTGGCTATATG	FW primer til forstærkning af INT1 5 ' med stik 5	4,4
KC-110	AAACGCCTGTGGGTGTGGTAC TGGATATGCAAAGCGATTGGAA GTCGCTTgactcctctgccgtc ATTCC	RV primer til forstærkning af INT1 5 ' med stik 5	4,4
KC-111	TTGCCCATCGAACGTACAAG TACTCCTCTGTTCTCTCCTTCCTT TGCTTTaagcgttgaagtttcctc TTTG	FW primer til forstærkning af INT1 3 ' med Connector A	4,4
KC-112	TGTCAACTGGAGAGCTATCG	RV primer til forstærkning af INT1 3 ' med Connector A	4,4
KC-113	AGAAGATTTCTCTTCAATCTC	FW primer til forstærkning af INT2 5 ' med Connector B	4,4
KC-114	TGCTAAGATTTGTGTTCGTT TGGGTGCAGTCGGTTGTGTACAT CGATCCGcccttatcaaggatacc TGGTTG	RV primer til forstærkning af INT2 5 ' med stik B	4,4
KC-115	ACGCTTTCCGGCATCTTCCA GACCACAGTATATCCATCCGCCT CCTGTTGggcgattacacaagcg GTGG	FW primer til forstærkning af INT2 3 ' med stik C	4,4
KC-116	TCTCCTCTTCGATGACCGGG	RV primer til forstærkning af INT2 3 ' med stik C	4,4
KC-117	GGTCGTTTTTGTGCAGCATATTG	FW primer til forstærkning af INT3 5 ' med Connector D	4,4
KC-118	GCGGAATATTGGCGGAACGG ACACACGTGGATACAAACCTG GACAACGTTttccaaggaggtg AAGAACG	RV primer til forstærkning af INT3 5 ' med Connector D	4,4
KC-119	AAATAACCACAAACATCCTT CCCATATGCTCGGTCGTGCTTGTT GTACCTgatgggacgtcagcact GTAC	FW primer til forstærkning af INT3 3 ' med stik E	4,4
KC-120	GAGCTTACTCTATATATTCATTC	RV primer til forstærkning af INT3 3 ' med stik E	4,4
KC-121	GTTACTAAACTGGAACTGTCCG	FW primer til verifikation af integrationen af con5-crtE-conA til INT1 5 '	7.4.1
KC-122	CACTGCTAACTACGTTTACTTC	FW primer til verifikation af integrationen af con5-crtE-conA til INT1 3 '	7.4.1
KC-123	CACTGGAACTTGAGCTTGAG	FW primer til verifikation af integrationen af conB-crtYB-conC til INT2 5 '	7.4.1
KC-124	GTCTCCAGCTGAATTGGTCC	FW primer til verifikation af integrationen af conB-crtYB-conC til INT2 3 '	7.4.1
KC-125	CTCTCATGAAGCAGTCAAGTC	FW primer til verifikation af integrationen af conD-crtI-conE til INT3 5 '	7.4.1
KC-126	GATCGGTCAATTAGGTGAAG	FW primer til verifikation af integrationen af conD-crtI-conE til INT3 3 '	7.4.1
KC-127	CCTTGTCCAAGTAGGTGTCC	RV primer til verifikation af integrationen af con5-crtE-conA til INT1 5 '	7.4.1
KC-128	GCTGTCATGATCTGTGATAAC	RV primer til verifikation af integrationen af con5-crtE-conA til INT1 3 '	7.4.1
KC-129	CTGGCAATGTTGACCAATTGC	RV primer til verifikation af integrationen af conB-crtYB-conC til INT2 5 '	7.4.1
KC-130	CCAACGTGCCTTAAAGTCTG	RV primer til verifikation af integrationen af conB-crtYB-conC til INT2 3 '	7.4.1
KC-131	CCTTACCTTCTGGAGCAGCAG	RV primer til verifikation af integrationen af conD-crtI-conE til INT3 5 '	7.4.1
KC-132	CTGGTTACTTCCCTAAGACTG	RV primer til verifikation af integrationen af conD-crtI-conE til INT3 3 '	7.4.1
	a. fed-sekvenser angiver forbindelses sekvenser. b. fremad-og bakgrundere betegnes henholdsvis FW og RV.

Supplerende tabel 2: primer-sekvenser.

Supplerende tabel 3: udformning af konstruerede stammer.

Supplerende tabel 4: sekvenser af donor-DNA-udtryks kassetter og afskalning af regioner. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Den medfølgende protokol beskriver multiplex genomredigering af S. cerevisiae ved hjælp af Cas12a fra lachnospiraceae bakterie ND2006 i kombination med et enkelt crrna-array og donor-DNA. Design af det enkelte crRNA-array og donor-DNA forklares i detaljer. I modsætning til det veletablerede crispr/Cas9-system har crispr/Cas12a den unikke ekstra evne til at behandle flere crrnas udtrykt fra et enkelt crrna-array^13,33. På grund af denne funktion er samtidig redigering af flere mål lettere at opsætte og kan opnås i en enkelt transformation. Denne enkelt crRNA array tilgang blev demonstreret før af Zetsche et al. ³⁴ , som samtidig redigerede op til fire gener i pattedyrsceller ved hjælp af AsCas12a, og ved Swiat et al. ³⁵ , som INTRODUCEREDE fire DNA-fragmenter i et gærgenom ved hjælp af FnCas12a. Til vores kendskab er et større antal samtidige genomændringer ved hjælp af et Cas12a system ikke blevet rapporteret, og den maksimale grænse for mål pr. enkelt array for Cas12a er endnu ikke fastlagt. Yderligere forskning ved hjælp af enkelt crrna-systemer i kombination med Cas12a omfatter multiplex transkriptional regulering i en bred vifte af organismer^33,36,37.

Der er nogle kritiske trin i den præsenterede protokol. Design omhyggeligt alle DNA-sekvenser, der er involveret i Cas12a genomredigerende eksperiment, især i tilfælde, hvor nye DNA-sekvenser introduceres. Bestem funktionaliteten af nye afstands sekvenser del af en crRNA, for eksempel ved en singleplex genomredigering eksperiment som beskrevet af Verwaal et al. ¹⁹ før du kombinerer dem i et enkelt crrna-array. Følg anbefalingerne for udarbejdelse af transformation buffer løsninger, der anvendes i Cas12a redigering eksperiment for at opnå en god transformation effektivitet af gær.

Der er nogle valgfrie modifikationer af teknikken. Det anbefales at bruge 1 μg af hver donor DNA, lineariseret pRN1120 eller enkelt crRNA array Expression kassette i omdannelsen, selv om brugen af et lavere DNA-beløb forventes også at resultere i en tilfredsstillende transformation effektivitet. Udfør en test transformation for at afgøre, om der kan anvendes lavere DNA-mængder. Omdannelse af S. cerevisiae kan udføres ved hjælp af en anden metode end den, der er beskrevet i denne protokol, for eksempel den protokol, der er beskrevet af gietz et al. (2007) ³⁸. guide RNA-modtager plasmid pRN1120 er egnet til ekspression af et enkelt crrna og enkelt crrna-array af forskellige Cas12a varianter (f. eks.fra acidaminococcus spp. BV3L6 eller Francisella novicida U112) samt til ekspression af sgRNA i kombination med Cas9¹⁹. Donor-DNA behøver ikke at være begrænset til carotenoid genekspression kassetter og ledsage regioner, der er målrettet donor DNA til de beskrevne INT1, INT2 og INT3 steder i genomisk DNA. Ethvert DNA af interesse kan indføres på en multiplex måde i genomisk DNA af værten ved de designprincipper, der er beskrevet i denne protokol, eller alternativt donor DNA kan bruges til at slette DNA fra et værts-genom. Den modulære struktur af enkelt crRNA-array letter nem justering af spacer og direkte gentagelses sekvenser. Ændring af afstands sekvenser giver mulighed for en ændring af den tilsigtede integration locus, som kan være designet af et af de værktøjer til identifikation af en genomisk mål site, f. eks guidescan software 1,0³⁹. I stedet for at bruge store ledsage sekvenser, der indeholder stik sekvenser, kan 50-BP af ledsage regionen medtages i donor DNA-sekvenser ved at indarbejde disse 50-BP ledsage region sekvenser i primere, der anvendes i PCR. I dette tilfælde, i alt kun tre i stedet for ni donor DNA fragmenter er nødvendige for en vellykket multiplex genomredigering eksperiment.

I Resumé, denne protokol giver trin-for-trin anvisninger til at udføre multiplex genom redigering i S. cerevisiae ved hjælp af Cas12a i kombination med en enkelt crrna array tilgang. Protokollen blev demonstreret af multiplex genom editing ved hjælp af 9 donor DNA fragmenter og enkelt crrna array kodning for tre grnas. Vi viser høje samlede redigerings frekvenser mellem 50% og 94% for de tre stamme designs, som rapporteres her. Afsluttende, det unikke træk ved Cas12a er evnen til at behandle en enkelt crRNA array i individuelle crRNAs i en celle, hvilket gør Cas12a et glimrende værktøj til at muliggøre multiplex genomredigering og udvikle transkriptionelle regulerings moduler rettet mod flere udtryk kassetter på én go. I sidste ende, tre stammer blev opnået producerer carotenoider på et andet niveau og farver i nuancer mellem gul og orange. Med disse stammer og en vild-type stamme, vi viste, hvordan en akustisk væske handler kan bruges ligefremdet at gøre gær pixel kunst-dette til ære for Rosalind Franklin, der bidrog til opdagelsen af DNA-strukturen 65 år siden af hendes berømte billede 51^{23 < /C1 >.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals specific for the protocol
1 Kb Plus DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	10787018	Electrophoresis
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A9518	Selection of E. coli transformants
BsaI-HF (20 U/µl)	New England BioLabs	R353L	Golden Gate Cloning
Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)	QIAGEN	854016	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
CutSmart Buffer	New England BioLabs	B7204S	Linearization of pRN1120
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes	Sigma Aldrich	D1626	Transfromation of S. cerevisiae (carrier DNA)
dNTPs	Invitrogen	10297018	PCRs
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S	Linearization of pRN1120
Ethanol absolute for analysis	Merck	100983	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Ethylenediamine-tetraacetic acid	Sigma Aldrich	ED	Transformation of S. cerevisiae
G418 disulfate salt	Sigma Aldrich	A1720	Selection of S. cerevisiae transformants
Histodenz	Sigma Aldrich	D2158	Yeast pixel art
Isopropanol	Merck	100993	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Lithium acetate dihydrate	Sigma Aldrich	L6883	Transformation of S. cerevisiae
Nancy-520 DNA Gel Stain	Sigma Aldrich	1494	Electrophoresis
NEB10 competent E. coli cells	New England BioLabs	C3019H	Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6
Nourseothricin	Jena Bioscience	AB102	Selection of S. cerevisiae transformants
Phusion buffer	New England BioLabs	M0530L	PCRs
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England BioLabs	M0530L	PCRs
Polyethylene glycol 4000	Merck	7490	Transformation of S. cerevisiae
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)	QIAGEN	854016	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Purple loading dye	New England BioLabs	B7024S	Electrophoresis
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27106	Purification of plasmids
RNase coctail enzyme mix	Thermo Fisher Scientific	AM2286	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
T4 DNA ligase buffer	Invitrogen	46300-018	Golden Gate Cloning
T4 DNA Ligase (1 U/µl)	Invitrogen	1705218	Golden Gate Cloning
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500	Electrophoresis
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit	Promega	A9282	Purification of PCR products and linearized pRN1120
Xhol	New England BioLabs	R0146S	Linearization of pRN1120
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL)	Zymo Research	E1006	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)
Zymolyase storage buffer	Zymo Research	E1004-B	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)
Chemicals of general use
2*Peptone-Yeast extract (PY) agar			Plate growth of E. coli
2*PY medium			Cultivation of E. coli
Demineralized water			Transformation of S. cerevisiae
ELFO buffer			Electrophoresis
MQ			Multiple steps
Physiological salt solution			Transformation of S. cerevisiae
TE buffer			Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium			Cultivation of S. cerevisiae
YEPD (2% glucose) agar			Plate growth of S. cerevisiae
Consumables
Eppendorf tubes
Falcon tubes (50 mL)
Microplate 96 wells
Petri dishes
Pipette tips 0.5 - 10 µL
Pipette tips 10 - 200 µL
Pipette tips 100 - 1000 µL
Shake flasks (500 mL)
Sterile filters
Equipment
Centrifuge (Falcon tubes)
Echo 525 acoustic liquid handler
Incubator
NanoDrop
Set for eletrophoresis
Spectrophotometer
Table centrifuge (Eppendorfs tubes)
Thermocycler
Plasmids
pCSN067	Addgene	ID 101748	https://www.addgene.org/
pRN1120	Addgene	ID 101750	https://www.addgene.org/
Strains
S. cerevisiae strain CEN.PK113-7D	EUROSCARF collection		http://www.euroscarf.de