CRISPR/Cas12a multiplex genom redigering av Saccharomyces cerevisiae och skapandet av jäst pixel art

Summary

CRISPR/Cas12a-systemet i kombination med en enda crRNA-array möjliggör effektiv multiplex-redigering av S. cerevisiae -genomet vid flera loci samtidigt. Detta demonstreras genom att konstruera karotenoid producerar jäststammar som sedan används för att skapa jäst pixel konst.

Abstract

Hög effektivitet, användarvänlighet och mångsidighet av de grupperade regelbundet interfördelade korta palindrom repetitioner/CRISPR-Associated protein 9 (CRISPR/Cas9) systemet har underlättat avancerad genetisk modifiering av Saccharomyces cerevisiae, en modell organism och arbetshäst i industriell bioteknik. CRISPR-associerat protein 12a (Cas12a), en RNA-guidad endonukleas med funktioner som skiljer sig från Cas9 tillämpas i detta arbete, ytterligare utvidga den molekylära verktygslådan för genom redigering ändamål. En fördel med CRISPR/Cas12a-systemet är att den kan användas i multiplex genom redigering med flera RNAs-ledare som uttrycks från en enda transkriptionell enhet (Single CRISPR RNA (crRNA) array). Vi presenterar ett protokoll för multiplex integration av flera heterologa gener i oberoende loci av S. cerevisiae genomet med hjälp av CRISPR/Cas12a systemet med flera crRNAs uttrycks från en enda crrna array konstruera. Den föreslagna metoden utnyttjar förmågan hos S. cerevisiae att utföra in vivo rekombination av DNA-fragment för att montera den enda crrna matrisen i en Plasmid som kan användas för transformant urval, samt montering av givar-DNA sekvenser som integreras i genomet vid avsedda positioner. Cas12a är pre-uttryckt konstitutivt, underlätta klyvning av S. cerevisiae genomet vid de avsedda positionerna vid uttryck av den enda crrna array. Protokollet omfattar utformning och konstruktion av en enda crRNA array och givare DNA-uttryck kassetter, och utnyttjar en integrationsstrategi som använder sig av unika 50-BP DNA-kopplingar sekvenser och separata integration flank DNA-sekvenser, vilket förenklar experimentell design genom standardisering och modularisering och utökar utbudet av applikationer. Slutligen, vi visar en enkel teknik för att skapa jäst pixel konst med en akustisk flytande hanterare med olikfärgade karotenoid producerar jäst stammar som konstruerades.

Introduction

CRISPR/CAS-enzymer har otvivelaktigt revolutionerat molekylärbiologi och antagits i stor utsträckning som verktyg för ingenjörs genom i en hastighet som tidigare inte var genomförbar¹. Den första modifieringen av en Saccharomyces cerevisiae genom genom redigering av CRISPR/Cas9 Genome rapporterades av DiCarlo et al. ², demonstrera framgångsrik gen knock-out och göra punktmutationer med hjälp av externt introducerade oligonukleotides. Ytterligare jäst CRISPR Toolbox utveckling ingår: transkriptionell reglering genom fusion av katalytiskt inaktiva Dead Cas9 (dCas9) med transkriptionella effektordomäner för aktivering och ljuddämpning av transkription³, ansökan för både genom redigering och reglerande funktioner för metabolisk vägteknik genom samtidig aktivering, förtryck och radering⁴, radering av stora fragment från S. cerevisiae Genome⁵, och multipel-kromosom fusioner⁶ .

CRISPR/CAS genom redigering system hitta sitt ursprung i adaptiva immunsystem av bakterier och arkéer och dessa system har anpassats av molekylär biologer för genomredigering. Deras funktionalitet är baserad på de grupperade regelbundet Interfördelade korta Palindromic repetitioner (CRISPR) DNA regioner kodning RNA som ansvarar för erkännandet av den främmande DNA eller RNA och CRISPR associerade gener (CAS) som kodar RNA-guidad endonukleaser^1,7,8,9. Baserat på den senaste genomanalys av CRISPR/CAS-system föreslogs det att dela upp CRISPR/CAS-systemen i två klasser, fem typer och 16 subtyper¹⁰. De två klasserna är framstående baserat på organisationen av effektor komplex inblandade i mål klyvning. Vanligtvis kategoriseras CRISPR/CAS-system med en organisation med flera subenheter som klass 1, medan enstaka subenhet effektor-komplex tillhör klass 2^10,11. I detta dokument utforskar vi klass 2 typ V Cas12a, tidigare kallad Cpf1^10,12, vilket är ett alternativ till klass 2 typ II Cas9. Även om Cas9 är väl kännetecknas och ofta används i forskning, Cas12a erbjuder ytterligare funktioner¹². För det första, Cas12a bildar ett komplex med CRISPR RNA (crRNA) av 42 till 44 nukleotider utan att kräva en ytterligare trans-aktiverande CRISPR RNA (tracrRNA). Därför kan ett kortare guide-RNA utnyttjas i genomredigering med CRISPR/Cas12a-system jämfört med CRISPR/Cas9. För det andra, den unika Endonuklease och endoribonuclease aktivitet Cas12a möjliggör mognad av dess pre-crRNA¹³. Denna RNase aktivitet möjliggör kodning av flera crRNAs på en enda CRISPR crRNA array, medan Cas9 kräver separat uttryck för varje så kallade Single-guide RNA (sgRNA) eller alternativt till exempel uttryck för en ytterligare Endonuklease ( t. ex.Csy4) i kombination med igenkännings motiv för Csy4 kring varje sgrna^14,15. För det tredje kräver Cas12a mål plats erkännande ett protospacer angränsande motiv (PAM) vid 5 ' från målet och klyver efter + 18/+ 23 position från sin PAM resulterar i klyvs DNA med klibbiga ändar, medan Cas9 kräver en PAM ligger på 3 ' slutet från mål och klyver efter-3 position skapa trubbiga slutet nedskärningar i DNA¹². För det fjärde, den konsensus nukleotid sekvens av PAM skiljer mellan Cas12a ((T) TTV) och Cas9 (NGG), vilket gör Cas12a en lovande kandidat för inriktning T-Rich promotor och Terminator sekvenser¹⁶. Slutligen rapporterade en nyligen studie större mål specificitet för Cas12a än för de infödda Cas9¹⁷.

Vi presenterar ett protokoll för användning av CRISPR/Cas12a-systemet för genomredigering av S. cerevisiae med särskilt fokus på införandet av flera DNA-uttryckskassetter i oberoende genomisk loci samtidigt (multiplex genom redigering) med hjälp av en enda crRNA array. Protokollets viktigaste steg återges i figur 1. Som ett konceptbevis tillämpades CRISPR/Cas12a-systemet för införande av tre uttrycks kassetter i genomet hos S. cerevisiae som möjliggör framställning av β-karoten¹⁸ som schematiskt visas i figur 2. Produktion av β-karoten påverkar fenotyp av s. cerevisiae: dvs., efter en lyckad introduktion av alla tre heterologa gener som krävs för karotenoider biosyntes, vita S. cerevisiae celler blir gula eller orange, beroende på uttrycks styrkan hos varje gen promotor. På grund av den enkla visuella uppläsning av denna väg, har det införts för att utveckla avancerade CRISPR-baserade system och metoder för genomredigering^19,20. I detta arbete, uttrycks kassetter kodning av karotenoid gener crte, crtyb och crti har konstruerats med hjälp av en Golden Gate kloning (GGC) Approach²¹ med heterologa initiativtagare och homolog Terminators används för att framföra geners uttryck. Uttrycket kassetter är omgivna av unika 50-Base par (BP) sekvenser, kallas anslutningar, som möjliggör in vivo montering med integration flank DNA-sekvenser (Flanking regioner) med samma 50-BP sekvenser, och efterföljande integration i det genomiska DNA av jäst vid den position som bestäms av kompletterande regioner. Genom att använda olika promotor styrkor, stammar med olika nivåer av karotenoider produktionen erhölls resulterar i variation i färgen på cellerna. Dessa stammar-inspirerad av "Jästkonstprojektet"²² -användes i en spotting setup med en akustisk flytande hanterare för att skapa en 4-färg högupplöst "jäst fotografi" av Rosalind Franklin. Franklin (1920-1958) var en engelsk kemist och röntgenkristallograf välkänd för sitt bidrag till upptäckten av DNA-strukturen genom foto 51^23,24,25.

Protocol

1. beredning av Cas12a plasmider

Anmärkning: plasmid innehåller den Lachnospiraceae BAKTERIEN ND2006 Cas12a (LbCpf1, pCSN067) kodon optimerad för uttryck i S. cerevisiae, var tidigare konstruerat¹⁹, deponeras på en Plasmid repository (se tabellen över Material). Detta är en enda kopia episomalt s. cerevisiae/E. coli Shuttle plasmid innehåller en kanmx resistens markörgen för att möjliggöra val av s. cerevisiae Transformanter på geneticin (G418).

1. Få pCSN067 plasmid (se tabell över material).
2. Amplify den pCSN067 plasmid att få en hög mängd.
   1. Omvandla 25 μL inköpta kemiskt kompetenta E. coli -celler med plasmid pCSN067 enligt tillverkarens protokoll. Späd omvandlings mixen 10 och 50 gånger i 2x Peptone-jäst (PY). Platta ut 10X och 50x spädningar på 2x PY agar plattor som innehåller ampicillin (0,1 g/L) och inkubera över natten vid 37 ° c.
   2. Välj 2 till 3 kolonier och Inokulera varje koloni i 3 mL 2x PY och växa över natten vid 37 ° c i en skakande inkubator på 180 RPM.
   3. Rena plasmiden med hjälp av en Plasmid renings sats enligt tillverkarens anvisningar.

2. beredning av den enda crRNA array Expression kassett

1. Förbered den enda crRNA-matrisen.
   Anmärkning: den enda crRNA matrisen består av en SNR52 RNA-POLYMERAS III promotor från S. cerevisiae², en direkt upprepning specifik för LbCas12a och en spacer (genomisk målsekvens), tillsammans upprepas för varje mål¹⁹ och slutar med en SUP4 Terminator från S. cerevisiae². Den enda crRNA array monteras genom in vivo rekombination i linearized Plasmid pRN1120 att generera en cirkulär plasmid, således regioner homolog till plasmid pRN1120 måste vara närvarande vid början och slutet av den enda crrna array (se figur 2A ). Det rekommenderas att i förväg utvärdera funktionaliteten hos ett antal designade crRNAs separat¹⁹. Denna information används därefter för att välja de flesta funktionella crRNAs för att kombinera dessa till de direkta upprepningar och spacer sekvenser för att skapa en enda crRNA array för multiplexing syfte.
   1. Beställ den enda crRNA-matrisen för multiplex Genome Editing-experiment som syntetiskt DNA (se DNA-sekvensen för den enda crRNA-matrisen i kompletterande tabell 1).
   2. Förstärka den beställda enda crRNA-matrisen (t. ex.med PRIMERS kc-101 och kc-102 (kompletterande tabell 2)). Förbered PCR-amplifieringsblandningen som innehåller: 0,5 μl DNA-polymeras, 10 μl 5x buffert som krävs för DNA-polymeras, 1 μl 10 mm dNTPs, 2,5 μl av 10 μm framåt primer, 2,5 μl av 10 μm omvänd primer, 2 μl DNA-mall vid en koncentration av 5 ng/μl och ultrarent H ₂ O upp till en total volym på 50 μL.
      1. Utför reaktionen i en termocycler med hjälp av följande program: (i) 98 ° c för 3 min, (II) 98 ° c för 10 s, (III) 60 ° c för 20 s, (IV) 72 ° c för 15 s – Upprepa steg (II) till (IV) 30 gånger, (v) 72 ° c i 5 min (vi) Håll vid 12 ° c tills ytterligare analys.
   3. Analysera PCR-produkterna genom elektrofores genom att köra proverna på en 0,8% agaros gel vid 5 V/cm för 40 min med hjälp av en DNA-lastfärg och DNA-stege med DNA-fragment i ett intervall på 100 till 10 000 BP.
   4. Rena PCR-produkterna med hjälp av ett PCR-renings kit enligt tillverkarens anvisningar.
2. Förbered den enda crRNA array mottagare plasmid.
   Anmärkning: den enda crRNA array uttrycks från S. cerevisiae/E. coli Shuttle plasmid PRN1120¹⁹ (se tabellen över material). Denna multi-Copy plasmid innehåller en NatMX resistens markörgen för att möjliggöra val av S. cerevisiae transformanter på nourseothricin (NTC).
   1. Få pRN1120 plasmid.
   2. Amplify den pRN1120 plasmid att få en hög mängd.
      1. Omvandla 25 μL inköpta kemiskt kompetenta E. coli -celler med plasmid pRN1120 enligt tillverkarens protokoll. Späd omvandlings mixen 10 och 50 gånger i 2x PY. Platta ut 10X och 50x spädningar på 2x PY agar plattor som innehåller ampicillin (0,1 g/L) och inkubera över natten vid 37 ° c.
      2. Välj 2 till 3 kolonier och Inokulera varje koloni i 3 mL 2x PY och växa över natten vid 37 ° c i en skakande inkubator på 180 RPM.
      3. Rena plasmiden med hjälp av en Plasmid renings sats enligt tillverkarens anvisningar.
   3. Linearize plasmid pRN1120 med EcoRI-HF och xhoI. För detta, Förbered en digestionsblandning som består av 1 μg pRN1120 μL 10X buffert (1x buffert innehåller 50 mM kaliumacetat, 20 mM Tris-acetat, 10 mM magnesiumacetat, 100 μg/mL bovint serumalbumin [BSA]; pH 7,9), 1 μL EcoRI-HF (20 U) , 1 μl xhoI (20 U) och ultrarent H₂O upp till en total volym på 50 μl. Inkubera digestionsmixen vid 37 ° c i 2 timmar och inaktivera vid 65 ° c i 20 min.
   4. Analysera linearized Plasmid genom elektrofores på en aguppstod gel (0,8%, 40 min, 5 V/cm) med hjälp av en DNA-laddning färgämne och DNA-stege med DNA-fragment i en rad 100 till 10 000 BP. Som en kontroll inkluderar en cirkulär plasmid i analysen.
   5. Rena den lineariserade plasmiden med hjälp av ett PCR-renings kit enligt tillverkarens anvisningar.

3. beredning av promotorn-ORF-Terminator (POT) givare DNA-konstruktioner

1. Beställ en uppsättning av promotorn (P) av olika styrka, öppen läsbild (O) och terminatorsekvenser (T) som syntetiskt DNA så att varje element innehåller standardiserade 4-BP-igenkännings sekvenser som flankeras av BSAI-platser för att möjliggöra kloning av Golden Gate ( GGC) församling²⁶ (se detaljutformningen i kompletterande tabell 3 och sekvenser i tilläggs tabell 4).
2. Montera POT Expression kassetter består av en promotor, öppen läsram, Terminator och anslutningar sekvenser via en 4-del församling med en GGC reaktion²¹, i en destination vektor som redan innehåller förspecificerade 50-BP kontakter sekvenser ( Se kompletterande tabell 4 och hänvisningar^26,27).
   1. Mät koncentrationen av DNA-delar med hjälp av en spektrofotometer. Späd varje DNA-del i ultrarent H₂O till en slutlig koncentration på 15 fmol/μl.
   2. Bered en reaktionsblandning bestående av DNA-fragment: 2 μL promotor, 2 μL öppen läsram, 2 μL terminatoren och 2 μL stamnät (destinations vektorer på nivå 1 enligt beskrivningen i ²⁶), 4 μl 5x T4 DNA ligasbuffert, 2,5 μl av 1 U/μl T4 DNA Ligase , 1,5 μl av 20 U/μl BSAi-HF och ultrarent H₂O upp till en total volym på 20 μl.
   3. Utför GGC reaktion i en termocycler med följande program: (i) 37 ° c för 2 min, (II) 16 ° c i 5 min – Upprepa steg (i) och (II) 50 gånger, (III) 50 ° c för 60 min, (IV) 80 ° c för 45 min, (v) Håll vid 12 ° c tills ytterligare analys.
3. Omvandla 25 μL inköpta kemiskt kompetenta E. coli²⁸ -celler med 3 μl av GGC-reaktionsblandningen enligt tillverkarens protokoll. Späd omvandlings mixen 10 och 50 gånger i 2x PY. Platta ut 10X och 50x spädningar på 2x PY agar plattor som innehåller ampicillin (0,1 g/L) och inkubera över natten vid 37 ° c.
4. Välj 2 till 3 kolonier och Inokulera varje koloni i 3 mL 2x PY och växa över natten vid 37 ° c i en skakande inkubator på 180 RPM.
5. Rena plasmiderna med hjälp av en Plasmid renings sats enligt tillverkarens anvisningar.
6. Kontrollera om POT Expression kassetter var monterade korrekt i GGC reaktionen av PCR.
   1. Design primers kompletterar kopplingssekvensen som finns i början och slutet av varje uttrycks kassett (se figur 2b). För anslutningar som väljs i detta protokoll används primers KC-103 till KC-108 (se kompletterande tabell 2).
   2. Förbered PCR-amplifieringsmixar för varje plasmid innehållande: 0,5 μL korrekturläsning av DNA-polymeras, 10 μL 5x buffert som krävs för DNA-polymeras, 1 μL 10 mM dNTPs, 2,5 μL av 10 μM framåtprimer, 2,5 μL med omvänd primer på 10 μM, 2 μL DNA-mall med koncentrat 5 ng/μl och ultrarent H₂O upp till en total volym på 50 μl.
   3. Utför PCR-reaktionen i en termocyklern med hjälp av följande program: (i) 98 ° c 3 min, (II) 98 ° c för 10 s, (III) 60 ° c för 20 s, (IV) 72 ° c för 2 min 30 s – Upprepa steg (II) till (IV) 30 gånger, (v) 72 ° c i 5 min , (vi) Håll vid 12 ° c tills ytterligare analys.
      Anmärkning: resulterande PCR-produkter består av 50-BP av 5 '-kontakt, promotor, öppen läsram, Terminator och 50-BP av 3 '-kontakten.
7. Analysera PCR-produkterna genom elektrofores genom att köra prover på en 0,8% agaros gel vid 5 V/cm för 40 min med hjälp av en DNA-lastfärg och DNA-stege med DNA-fragment i ett intervall på 100 till 10 000 BP.

4. förberedelse av integration flank DNA-sekvenser som innehåller kopplingar sekvenser

1. Rena genomiskt DNA från vild typ S. cerevisiae CEN. PK113-7d²⁹.
   1. Odla stammen i en 500 ml Shake kolv fylld med 100 ml jästextrakt pepton dextros (yepd, 2% glukos) medium vid 30 ° c och skakning vid 250 RPM för 48 timmar.
   2. Skörda cellerna genom centrifugering av 2 mL buljong vid 16 000 x g för 1 min och Kassera supernatanten.
   3. Omsuspendera cellerna i fysiologiskt salt (200 μL; 0,85% NaCl-lösning) med RNase (10 μL, 10 mg/mL) och jäst lytiskt enzym (4 μL). Inkubera cellsuspensionen vid 37 ° c i 15 min.
   4. Tillsätt 300 μL cell Lys lösning (se tabell över material) och Vortex inom kort.
   5. Tillsätt 168 μL protein utfällnings lösning (se tabell över material) och blanda kraftigt i 20-talet.
   6. Separera protein fraktionen genom centrifugering vid 16 000 x g och 4 ° c i 10 min. samla 600 μl av supernatanten i ett nytt rör och blanda med 600 μl isopropanol och Vortex inom kort.
   7. Återvinna DNA genom att snurra ner på 16 000 x g vid rumstemperatur i 10 min. Kassera supernatanten och behåll pelleten.
   8. Tvätta pelleten med 200 μL etanol (70%). Centrifugera vid 16 000 x g vid rumstemperatur i 10 min och ta bort supernatanten. Avduns etanol genom inkuberande röret vid rumstemperatur i 10 min med locket öppnat.
      Anmärkning: om vätskan i röret fortfarande är synlig upprepar du steg 4.1.8. Torka inte pelleten längre än 10 min för att förhindra minskad löslighet i DNA.
   9. Lös upp DNA i 50 μL TE-buffert. Förvara renat DNA vid 4 ° c.
2. För varje integration plats, design integration flank DNA-sekvenser (ca. 500 BP) så att cirka 1000 BP av genomiskt DNA kommer att avlägsnas vid införandet av givar-DNA (se Schematisk design i figur 2b och sekvenser i kompletterande Tabell 4).
3. Design primers att generera kompletterande regioner med PCR.
   1. För den vänstra flanken regionen, design framåt och omvänd primers att förstärka cirka 500 BP i genomisk DNA-regionen placerad 5 "(vänster) av integration platsen av intresse.
      Anmärkning: framåt primer innehåller 20 BP av homologi med den avsedda kompletterande regionen. Den omvända primer innehåller 20 BP med homologi med den avsedda kompletterande regionen och innehåller den önskade 50-BP Connector sekvens för att möjliggöra in vivo montering i Cas12a redigering på arvsmassan senare.
   2. För rätt kompletterande regionen, design framåt och omvänd primers att förstärka cirka 500 BP i genomisk DNA-regionen placerad 3 ' (höger) av integration platsen av intresse.
      Anmärkning: den främre primer innehåller 20 BP med homologi med den avsedda kompletterande regionen och innehåller den önskade 50-BP Connector sekvens för att möjliggöra in vivo församling i Cas12a redigering på arvsmassan senare. Den omvända primer innehåller 20 BP av homologi med den avsedda kompletterande regionen.
4. Förstärka de kompletterande områdena med de konstruerade grundfärger (t. ex.PRIMERS kc-109 till kc-120 inneslutna i tilläggstabell 2).
   1. Mät koncentrationen av renat genomiskt DNA som kommer att fungera som mall i PCR. Justera DNA-koncentrationen till 50 ng/μL.
   2. Förbered PCR-amplifieringsblandningar som består av genomiskt DNA (1 – 4 μL av 50 ng/μL genomisk DNA-utspädning) renat i steg 4,1, framåtriktad och omvänd primer (10 μM vardera), 1 μL 10 mM dNTPs, 10 μL 5x buffert krävs för DNA-polymeras, 0,5 μL DNA-polymeras (1,0 U) och ultrarent H₂O upp till total volym 50 μl.
   3. Utför PCRS i en termocyklern med hjälp av följande program: (i) 98 ° c för 3 min, (II) 98 ° c för 20 s, (III) 60 ° c för 20 s, (IV) 72 ° c för 15 s, upprepa steg (II) till (IV) 30 gånger, (v) 72 ° c i 5 min , (vi) Håll vid 12 ° c tills ytterligare analys.
5. Analysera PCR-produkterna genom elektrofores på en 0,8% agaros gel vid 5 V/cm för 40 min med hjälp av en DNA-lastfärg och DNA-stege med DNA-fragment i ett intervall på 100 till 10 000 BP.
6. Rengör de korrekta PCR-produkterna med hjälp av ett PCR-renings kit enligt tillverkarens anvisningar.

5. omvandling till S. cerevisiae

Anmärkning: utför omvandling med hjälp av ett protokoll baserat på de metoder som utvecklats av Gietz et al. (1995) ³⁰ och Hill et al. ³¹ som kan användas för olika stammar av S. cerevisiae. Det protokoll som beskrivs nedan är tillräckligt för 1 omvandling.

1. Förbered lösningar som krävs för omvandling.
   1. Förbered följande lagerlösningar och filtersterilisera: 10X TE-buffert som innehåller 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA, total volym 50 mL; 1 M LiAc vid pH 7,5, total volym 50 mL; 50% PEG 4000, total volym 100 mL.
      Obs: Kontrollera alltid att PEG 4000 beståndet är pH 5. Detta bestånd bör inte lagras längre än en månad.
   2. Förbered följande lösningar med hjälp av lager: Förbered LiAc-TE lösning som innehåller 0,1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, total volym av 0,5 mL. Förbered PEG-LiAc-TE lösning som innehåller 40% PEG 4000, 0,1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, total volym av 1 mL.
      Obs: det är avgörande för en lyckad omvandling som PEG-LiAc-TE och LiAc-TE lösningar är nyberedda.
2. Första omvandling runda (Förbered stammen pre-uttrycker Cas12a).
   Anmärkning: i alla omvandlingssteg, Använd vatten med ett pH högre än 5. Det rekommenderas att använda demineraliserat vatten i alla steg i omvandlingen.
   1. Förbered en för-kultur genom växande stam CEN. PK113-7D i en 100 mL Shake kolv innehållande 20 mL YEPD (2% glukos) medium och inkubera över natten vid 30 ° c med skakning vid 250 RPM.
   2. Mät OD₆₀₀ för för kulturen (OD_PC). Beräkna utspädningsfaktorn (DF) mellan volymen av för kulturen och den volym av färskt medium som krävs för beredning av de celler som uttrycker Cas12a och som skall användas i omvandlingen (omvandlings kultur). I beräkningarna antar den optiska densiteten av Transformations kulturen (OD_TC) att vara 1,0 efter inkubations steget som beskrivs i 5.2.3 (ti).
      
      där ti och τ är inkubationstiden respektive fördubblings tiden.
      1. Beräkna den volym av pre-Culture (v_i) som krävs för inympning av omvandlings kulturen (v_TC) baserat på utspädningsfaktorn.
         
   3. Förbered omvandlings kulturen genom inympning av 20 mL YEPD (2% glukos) (v_TC) med volymen av pre-Culture bestäms i föregående steg (v_i). Inkubera vid 30 ° c med skakning vid 250 RPM.
   4. Mät omformnings kulturens OD₆₀₀ tills en OD₆₀₀ på 1,0 har uppnåtts.
   5. Skörda cellerna genom centrifugering av 20 mL buljong vid 2 500 x g i 5 min. Kassera supernatanten och tvätta cellerna i 20 ml avmineraliserat vatten i rumstemperatur. Upprepa centrifugeringssteget och behåll cellpelleten.
   6. Omsuspendera cellerna i 100 μL av LiAc-TE-lösningen och överför till ett microcentrifugerör.
   7. Tillsätt 5 μL enkelsträngat bärar-DNA (10 mg/mL laxspermie-DNA) och blanda genom pipettering.
   8. Pipettera över 1 μg plasmid pCSN067 till microcentrifugeröret.
      Anmärkning: den totala volymen av DNA-blandningen bör inte överstiga 100 μL för att förhindra en lägre omvandlings effektivitet.
   9. Tillsätt 600 μL PEG-LiAc-TE-lösning och blanda genom pipettering. Inkubera i 30 minuter vid 30 ° c medan du skakar vid 450 rpm i ett bords topp värmeblock.
   10. Tillsätt 70 μL DMSO (100%) till omvandlings blandningen och blanda genom pipettering. Utför värme chock genom inkuberande omvandlings blandningen vid 42 ° c i 15 minuter i ett vattenbad.
   11. Återvinna cellerna genom att överföra blandningen till en 15 mL rund botten röret och tillsätt 10 mL YEPD (2% glukos) till röret. Inkubera över natten vid 30 ° c med skakning vid 250 RPM.
   12. Centrifugera omvandlings blandningen vid 2 500 x g i 5 min. Kassera supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i cirka 200 μl av den kvarvarande lösningen.
   13. Platta ut 150 μL av omvandlings blandningen och en 20x utspädning i YEPD (2% glukos) av omvandlings blandningen på YEPD (2% glukos) agar plattor kompletteras med 0,2 g/L G418. Inkubera plattorna vid 30 ° c i 48 – 72 timmar.
   14. Välj en enda transformant och re-Streak på en YEPD (2% glukos) agar plattan kompletteras med 0,2 g/L G418 att få enstaka kolonier.
3. Andra omvandlings rundan (utför multiplex genom redigering med CRISPR/Cas12a).
   1. Förbered en för-kultur genom att odla stammen pre-uttrycker Cas12a, som skapats i den första omvandlingen omgången (steg 5,2), i en 100 mL Shake kolv som innehåller 20 mL YEPD (2% glukos) medium kompletterat med 0,2 g/L G418. Inkubera över natten vid 30 ° c med skakning 250 RPM.
      Obs: för flera transformationer, anpassa volymen av för kulturen.
   2. Följ stegen 5.2.2 till 5.2.7 för den första omvandlings rundan.
      Obs: för flera transformationer, anpassa volymerna av nödvändiga lösningar och kultur av stammen pre-uttrycka Cas12a.
   3. Pipettera över 1 μg av det enda crrna-matrisen, 1 μg av den lineariserade mottagaren plasmid för crrna-matrisen, 1 μg givar-DNA och 1 μg av varje kompletterande-region (steg 4,3) i microcentrifugeröret.
      Anmärkning: den totala volymen av DNA-blandningen bör inte överstiga 100 μL för att förhindra en lägre omvandlings effektivitet.
   4. Förbered följande kontroller för omvandlingen: negativ kontroll (ultrapure H₂O); positiv kontroll för bestämning av omvandlings effektiviteten (1 μg cirkulär pRN1120). en kontroll som kontrollerar om införandet av givar-DNA sker via CRISPR-redigering (1 μg cirkulär pRN1120, 1 μg av alla givar-DNA-uttryckskassetter och 1 μg flanerande regioner men ingen enskild crRNA-matris). kontroll kontrollera om givaren DNA kan integreras utanför målet (1 μg linearized pRN1120, 1 μg givare DNA-uttryck kassetter och 1 μg av den enda crrna array men inga kompletterande regioner); en kontroll som verifierar full Linearisering av pRN1120 (1 μg linearized pRN1120).
   5. Följ stegen 5.2.9 till 5.2.12 för den första omvandlings rundan.
   6. Platta ut 150 μL av omvandlings blandningen och 20x utspädning i YEPD (2% glukos) av transformation mix på YEPD (2% glukos) agar kompletterad med 0,2 g/L G418 och 0,2 g/L NTC. Plattan ut kontroller på YEPD (2% glukos) agar kompletteras med lämpligt urval (G418 och/eller NTC eller inget urval). Inkubera plattorna vid 30 ° c i 48 – 72 timmar.
   7. Välj en enda färgad transformant och re-Streak på en YEPD (2% glukos) agar plattan för att få enfärgade kolonier.

6. utvärdering av genomredigeringseffektiviteten

1. Räkna antalet färgade kolonier och vita kolonier på omformnings plattorna.
2. Beräkna genomredigering effektivitet genom att dividera antalet färgade kolonier av det totala antalet kolonier (både vita och färgade), som visas i tabell 1.

7. bekräftelse av integrering av givar-DNA vid avsedd lokalisering

1. Re-Streak en färgad enda koloni från en omformnings platta på en YEPD (2% glukos) agar tallrik utan G418 och NTC val och inkubera i 48 timmar vid 30 ° c.
2. Välj en enda koloni och Inokulera en 500 mL skakkolv fylld med 100 mL YEPD (2% glukos) medium. Inkubera i 48 timmar vid 30 ° c och skaka vid 250 RPM.
3. Isolera det genomiska DNA som beskrivs i avsnitt 4,1.
   Anmärkning: Alternativt, använda ett protokoll för beredning av jäst för Colony PCR tidigare föreslagits av looke et al. ³². i detta fall kan tillväxt i flytande medium (avsnitt 7,2) hoppas över.
4. Kontrollera korrekt integrering genom förstärkning av två fragment per integrerad uttrycks kassett.
   1. Design primers som glödas till genomiskt DNA utanför de omformade flanella regionerna och genen av intresse (se exempel i kompletterande tabell 2, kc-121 till kc-132). Vid användning av primers KC-121 till KC-132, Ställ in glödgningstemperaturen i PCR-programmet till 62 ° c.
   2. Område av intresse som beskrivs i avsnitt 4.4.2. Anpassa PCR-programmet, specifikt justera tiden för förlängningen steg i PCR enligt längden på mallen och tillverkarens rekommendationer för DNA-polymeras.
5. Kontrollera storleken på PCR-produkterna genom elektrofores på en agaros gel (0,8%, 40 min,5 V/cm) med hjälp av en DNA-lastfärg och DNA-stege med DNA-fragment i ett intervall på 100 till 10 000 BP.

8. skapandet av jäst pixel konst med hjälp av en akustisk vätska handler

1. Förbered en bildmall för jästen pixel konst.
   1. Ändra storlek på den ursprungliga RGB-bilden (220 × 280 pixlar, se representativa resultat), t. ex. med imagej för att skapa en slutlig 64 × 96 pixlar (bredd × höjd) grå skala bild visualiseras i avsedda färger (representativa resultat).
   2. Konvertera RGB-bilden till gråskala med denna formel:
      
      där jag_gr, i_r, i_g, jag_b är de grå, röda, gröna och blå intensiteter, respektive.
   3. För att kategorisera pixlarna, utveckla en ImageJ plugin tillämpa följande regler: (a) om jag_gr är ≤ 64, Använd den mörka apelsinjäst (stam 1, kompletterande tabell 3) för denna pixel. b om 64 < i_gr ≤ 128, Använd den orangefärgade jästen (stam 2, tilläggstabell 3) för denna pixel. c om 128 < i_gr ≤ 192, Använd den gula jästen (stam 3, tilläggstabell 3) för denna pixel. d) om jag_gr > 192, Använd den vita jästen (CEN. PK113-7D) för denna pixel.
2. Spot jästceller för att skapa jästen pixel konst.
   1. Inokulera 500 mL skaka flaskor innehållande 100 mL YEPD (2% glukos) medium med tre olikfärgade karotenoid producerar S. cerevisiae stam och vild typ CEN. PK113-7D. Inkubera kulturer över natten vid 30 ° c med skakning vid 250 RPM.
   2. Överför 0,5 mL av natt kulturen till ett rör fyllt med 0,5 mL sterilt icke-joniska densitetsgradientmedium (se tabell över material). Blanda genom vortexa kort.
   3. Överför cellsuspensionen till en kvalificerad reservoar, 2 x 3 väl. Utför spotting med hjälp av en akustisk vätska handler instrument från en kvalificerad reservoar källa plattan till en mikrotiterplattor (se tabellen av material) som innehåller 50 ml av yepd (2% glukos) agar. För att förenkla pläteringen, definiera brunnar på plattan, t. ex. Använd en mikrotiterplattor som en 6144 väl tallrik (64 × 96).
   4. Spot 25 nL av varje S. cerevisiae stam från 2x 3 brunnen reservoar källa plattan med hjälp av en. csv-fil med vätske kalibrering inställning 6Res_aq_gpsa2 på destinationen Microplate. Definiera var och en av dessa 25 nL droppar som en pixel i 64 x 96 rutnät som översätts till brunnen positioner (A01, B01, C01 etc.).
   5. Inkubera mikroplattan vid 30 ° c i 48 timmar. För att intensifiera färgerna på stammarna förvara agarplattan vid 4 ° c i minst 72 timmar.

Representative Results

Protokollet för multiplex genom redigering med crisrp/Cas12a demonstrerades genom att konstruera tre karotenoidproducerande S. cerevisiae stammar uttrycker crte, crtyb och crti gener med heterologa främjare av hög, medelhög och låg hållfasthet: stam 1, 2 respektive 3 (tilläggstabell 3). Byggandet av dessa stammar krävs generering av tre givare DNA-uttryck kassetter och sex kompletterande regioner per stam för inriktning på tre olika loci i genomiskt DNA (visas i figur 2B). Som beskrivs häri, promotor, öppen läsram, Terminator och två sammanhängande 50-BP kontakter sekvenser samlades till en Expression kassett via en Golden Gate kloning reaktion och församlingen kontrollerades av PCR (figur 3a). Den enda crRNA-matrisen beställdes som ett syntetiskt DNA-fragment och förstärdrades med PCR (figur 3B). Mottagaren plasmid för den enda crRNA array (plasmid pRN1120) var linearized med EcoRI-HF och xhoI och linearisering bekräftades genom elektrofores (figur 3C). Utformningen och nukleotidsekvenserna hos de införda kassetterna av givar-DNA-uttrycket och de kompletterande regionerna visas i tabell 3 och kompletterande tabell 4. Sekvensen av enstaka crRNA array uttrycks kassetter finns i kompletterande tabell 1. Funktionaliteten hos spacerarna som ingick i den enda crRNA-matrisen testades i förväg av singleplex genom redigering med individuella crRNAs¹⁹.

Effektiviteten i genomredigering med Cas12a utvärderades först baserat på antalet färgade kolonier som erhållits efter omvandling (tabell 1, figur 4). Redigerings effektiviteten hos de tre konstruerade stammarna varierade från 50% till 94%. Särskilt införandet av uttrycks kassetter som används för att generera stam 1 visade den lägsta redigeringen effektivitet, möjligen orsakad av arten av givaren DNA (dvs.dessa uttrycks kassetter koda crte, Crtyb och crti från tre höghållfasta promotorer). För det andra bekräftades korrekt integrering av de tre kassetterna av givar-DNA-uttrycket vid den avsedda loci på genomiskt DNA med PCR (figur 5). Primers utformades på ett sådant sätt att PCR-produkter erhölls när korrekt integrering av givar-DNA vid den avsedda Locus inträffade. För varje omvandlings experiment plockades åtta kolonier från omvandlings plattan och testades (Observera att endast tre presenteras i figur 5). I allmänhet, av 8 kolonier testade per donator DNA, korrekt integration av Crte givare DNA på int1 Locus, CRTYB vid INT2 Locus och crti vid INT3 Locus bekräftades i > 90% av omvandlare. Dessa resultat visar CRISPR/Cas12a systemet i kombination med en enda crRNA array möjliggör effektiv multiplex redigering av S. cerevisiae genomet på flera loci samtidigt.

Dessutom visar vi skapandet av "jäst pixel art" med hjälp av de tre karotenoid som producerar stammar som konstruerades tillsammans med en icke-färgad vildtyp stam. Från en svartvit bild av Rosalind Franklin (figur 6a), en 4-färg bild (figur 6B) och spotting lista skapades som sedan användes för att upptäcka de fyra olika jäststammar på en agar mikrotiterplattor med en akustisk vätske hanterare, vilket resulterar i en högupplöst "jäst målning" av Rosalind Franklin (figur 6C, D, E).

Figur 1 : Arbetsflöde för protokollet för CRISPR/Cas12a multiplex genom redigering i S. cerevisiae. Arbetsflödet innehåller viktiga steg i den presenterade metoden. Mer information finns i protokollet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Schema för CRISPR/Cas12a multiplex genom redigering med en enda crRNA array. (A) den enda crrna matrisen består av tre crRNAs enheter i sin mogna form, en 20-BP direkt upprepa specifika för LbCas12a (grå kvadrater) med en 23-BP guide sekvens (färgade diamanter). Uttrycket för crRNA-matrisen aktiveras av SNR52 promotorn och SUP4 terminatorn. Omvandling av S. cerevisiae med en linearized pRN1120 och den enda crrna array Expression kassett innehållande homologi med pRN1120 (Diagonala ränder) möjliggör in vivo rekombination i en cirkulär plasmid i celler pre-uttrycker LbCas12a. Den enda crRNA array bearbetas därefter av Cas12a. (B) Cas12a riktar sig till avsedda int1, INT2 och INT3 genomiska målplatser och skapar dubbla strandsatta raster. I omvandlings blandningen ingick donator-DNA som bestod av flanerande regioner och karotenoid gen uttrycks kassett. Givare DNA-sammansättningar riktade sig till en sträcka av DNA i genomisk DNA runt int1 (crte), INT2 (crtyb) och INT3 (crti) loci genom in vivo rekombination på grund av närvaron av 50-BP homolog kopplingar sekvenser, anges som 5, A, B, C, D eller E. P1 – P3, olika projektansvariga. T1 – T3, olika Terminators. Denna siffra har modifierats från VERWAAL et al. 2018¹⁹. Genetiska konstruktioner visas med hjälp av syntetiska biologi öppna språk (SBOL) visuella symboler⁴⁰. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 : PCR som verifierar genomredigeringsexperimenten. Averifiering av gyllene Gatens klonings reaktioner hos monterade GIVAR-DNA-kassetter. Erhållna resultat är i samförstånd med förväntade längder. BPCR för den enda crrna-matrisen. CLinearisering av plasmid pRN1120. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 : Plattor av S. cerevisiae omvandlingar med hjälp av multiplex Genome redigering metod. (A) stam 1 uttrycker crte, Crtyb och crti från tre starka initiativtagare (mörkt orange kolonier). B) stam 2 som uttrycker crte, Crtyb och crti från tre medelstarka promotorer (orangefärgade kolonier). C) stam 3 som uttrycker crte, Crtyb och crti från tre lågstyrke-promotorer (gula kolonier). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 : PCR som verifierar integrationen av donatorns DNA-uttryckkassetter på den avsedda loci inom genomiskt DNA. Akontroll av tre kolonier av stammen 1. Bkontroll av tre kolonier av stammen 2. Ckontroll av tre kolonier av stammen 3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6 : Jäst pixel konst av Rosalind Franklin. (A) svartvit RGB-bild av 220 × 280 pixlar av Rosalind Franklin som användes som mall. (B) dator omvandling av svartvita foto av Rosalind Franklin i en 4-färg 64 × 96 pixel lista. (C) foto av jäst pixel konst med 64 × 96 jästkolonier med en inzoomad sektion. Dfoto av en akustisk vätske hanterare med två fullvuxna plattor. (E) foto av en fullvuxen mikrotiterplattor med 64 × 96 jästkolonier. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

	Stam 1	Stam 2	Stam 3
Färgade kolonier	16	279	220
Vita kolonier	16	18	18
Totalt antal kolonier	32	297	238
Effektivitet	50%	94%	92%

Tabell 1: redigera effektiviteten i multiplex genomredigeringsmetoden.

crRNA array sekvensa, b, c, d, e, f

Catgtttgacagcttatcatcgataatccggagctagcatgcggccgctctagaactagtggatcccccgggctgcag Tctttgaaaa GATAATGTATGATTATGCTTTCACTCATATTTATACAGAAACTTGATGTTTTCTTTCGAGTATATACAAGG TGATTACATGTACGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTGTAGTGCCCTCTTGGGCTAGCGGTAAAGGTGCGCA TTTTTTCACACCCTACAATGTTCTGTTCAAAAGATTTTGGTCAAACGCTGTAGAAGTGAAAGTTGGTGCGC ATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCAatttctactaagtgtagat CTGGTGGGAGAGAAAGCTTATGAAatttctactaagtgtagatgtgccgtac GCCGGAGCCGACGGAatttctactaagtgtagattgcccctcttatacgattatatttt TTTTTGTTTTTTATGTCTggggggcccggtacccagcttttgttccctttagtgagg GTTAATTCCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG

a. homologi till pRN1120 (fet). b. SNR52 promotor (kursiv stil). c. genomiska målsekvenser (understrukna). d. guide direkt upprepar specifika för LbCas12a (kursiv, fet). e. SUP4 Terminator (kursiv stil). f. homologi till pRN1120 (fet).

Tilläggstabell 1: Single crRNA array för LbCas12a innehållande homologi med plasmid pRN1120.

Namn	Sekvensa	Beskrivningb	Som används i punkt
KC-101	CATGTTTGACAGCTTATCATC	FW primer för amplifiering av Single crRNA array	2.1.4
KC-102	CACACAGGAAACAGCTATGAC	RV primer för amplifiering av Single crRNA array	2.1.4
KC-103	AAGCGACTTCCAATCGCTTTGC	FW primer för förstärkning av givar-DNA med kontakt 5	3.6.1
KC-104	AAAGCAAAGGAAGGAGAGAAC	RV primer för förstärkning av givar-DNA med kontakt A	3.6.1
KC-105	CGGATCGATGTACACAACCG	FW primer för förstärkning av givar-DNA med kontakt B	3.6.1
KC-106	CAACAGGAGGCGGATGGATATAC	RV primer för förstärkning av givar-DNA med kontakt C	3.6.1
KC-107	AACGTTGTCCAGGTTTGTATCC	FW primer för förstärkning av givar-DNA med kontakt D	3.6.1
KC-108	AGGTACAACAAGCACGACCG	RV primer för förstärkning av givar-DNA med kontakt E	3.6.1
KC-109	CACTATAGCAATCTGGCTATATG	FW primer för amplifiering av INT1 5 ' med kontakt 5	4,4
KC-110	AAACGCCTGTGGGTGTGGTAC TGGATATGCAAAGCGATTGGAA GTCGCTTgactcctctgccgtc ATTCC	RV primer för amplifiering av INT1 5 ' med kontakt 5	4,4
KC-111	TTGCCCATCGAACGTACAAG TACTCCTGTTCTCTCCTTCCTT TGCTTTaagcgttgaagtttcctc TTTG	FW primer för amplifiering av INT1 3 ' med kontakt A	4,4
KC-112	TGTCAACTGGAGAGCTATCG	RV primer för amplifiering av INT1 3 ' med kontakt A	4,4
KC-113	AGAAGATTTCTCTTCAATCTC	FW primer för amplifiering av INT2 5 ' med kontakt B	4,4
KC-114	TGCTAAGATTTGTGTTCGTT TGGGTGCAGTCGGTTGTGTACAT CGATCCGcccttatcaaggatacc TGGTTG	RV primer för amplifiering av INT2 5 ' med kontakt B	4,4
KC-115	ACGCTTTCCGGCATCTTCCA GACCACAGTATATCCATCCGCCT CCTGTTGggcgattacacaagcg GTGG	FW primer för amplifiering av INT2 3 ' med kontakt C	4,4
KC-116	TCTCCTCTTCGATGACCGGG	RV primer för amplifiering av INT2 3 ' med kontakt C	4,4
KC-117	GGTCGTTTTTGTGCAGCATATTG	FW primer för amplifiering av INT3 5 ' med kontakt D	4,4
KC-118	GCGGAATATTGGCGGAACGG ACACACGTGGATACAAACCTG Mer från GACAACGTTttccaaggaggtg AAGAACG	RV primer för amplifiering av INT3 5 ' med kontakt D	4,4
KC-119	AAATAACCACAAACATCCTT CCCATATGCTCGGTCGTGCTTGTT GTACCTgatgggacgtcagcact GTAC	FW primer för amplifiering av INT3 3 ' med kontakt E	4,4
KC-120	GAGCTTACTCTATATATTCATTC	RV primer för amplifiering av INT3 3 ' med kontakt E	4,4
KC-121	GTTACTAAACTGGAACTGTCCG	FW primer för verifiering av integrationen av con5-crtE-conA till INT1 5 '	7.4.1
KC-122	CACTGCTAACTACGTTTACTTC	FW primer för verifiering av integrationen av con5-crtE-conA till INT1 3 '	7.4.1
KC-123	CACTGGAACTTGAGCTTGAG	FW primer för verifiering av integrationen av conB-crtYB-conC till INT2 5 '	7.4.1
KC-124	GTCTCCAGCTGAATTGGTCC	FW primer för verifiering av integrationen av conB-crtYB-conC till INT2 3 '	7.4.1
KC-125	CTCTCATGAAGCAGTCAAGTC	FW primer för verifiering av integrationen av conD-crtI-conE till INT3 5 '	7.4.1
KC-126	GATCGGTCAATTAGGTGAAG	FW primer för verifiering av integrationen av conD-crtI-conE till INT3 3 '	7.4.1
KC-127	CCTTGTCCAAGTAGGTGTCC	RV primer för verifiering av integrationen av con5-crtE-conA till INT1 5 '	7.4.1
KC-128	GCTGTCATGATCTGTGATAAC	RV primer för verifiering av integrationen av con5-crtE-conA till INT1 3 '	7.4.1
KC-129	CTGGCAATGTTGACCAATTGC	RV primer för verifiering av integrationen av conB-crtYB-conC till INT2 5 '	7.4.1
KC-130	CCAACGTGCCTTAAAGTCTG	RV primer för verifiering av integrationen av conB-crtYB-conC till INT2 3 '	7.4.1
KC-131	CCTTACCTTCTGGAGCAGCAG	RV primer för verifiering av integrationen av conD-crtI-conE till INT3 5 '	7.4.1
KC-132	CTGGTTACTTCCCTAAGACTG	RV primer för verifiering av integrationen av conD-crtI-conE till INT3 3 '	7.4.1
	a. djärva sekvenser betecknar kopplingssekvenser. b. forward och reverse primers betecknas som FW respektive RV.

Tilläggstabell 2: primer-sekvenser.

Tilläggstabell 3: utformning av konstruerade stammar.

Kompletterande tabell 4: sekvenser av donatorns DNA-uttryckskassetter och flagande områden. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Discussion

Det tillhandahållna protokollet beskriver multiplex genom redigering av S. cerevisiae med hjälp av Cas12a från Lachnospiraceae bakterie ND2006 i kombination med en enda crrna array och donator DNA. Utformningen av den enda crRNA-matrisen och givar-DNA förklaras i detalj. I motsats till det väletablerade CRISPR/Cas9-systemet har CRISPR/Cas12a den unika ytterligare förmågan att bearbeta flera crrnas som uttrycks från en enda crrna-matris^13,33. På grund av den här funktionen är samtidig redigering av flera mål enklare att ställa in och kan uppnås i en enda omvandling. Denna enda crRNA array tillvägagångssätt visades före av Zetsche et al. ³⁴ som samtidigt redigerade upp till fyra gener i däggdjursceller med hjälp av AsCas12a, och genom Swiat et al. ³⁵ som introducerade fyra DNA-fragment i ett jästgenomet med FnCas12a. Till vår kännedom har ett större antal samtidiga genomiska modifieringar med hjälp av ett Cas12a-system inte rapporterats och den maximala gränsen för mål per enskild matris för Cas12a är ännu inte fastställt. Ytterligare forskning som utnyttjar enstaka crrna matriser i kombination med Cas12a inkluderar multiplex transkriptionell reglering reglering i ett brett spektrum av organismer^33,36,37.

Det finns några kritiska steg i det presenterade protokollet. Noggrant utforma alla DNA-sekvenser som är inblandade i Cas12a genom redigering experiment, särskilt i fall när nya DNA-sekvenser introduceras. Bestäm funktionaliteten hos nya spacer sekvenser del av ett crRNA, till exempel genom en singleplex genomredigering experiment som beskrivs av VERWAAL et al. ¹⁹ innan du kombinerar dem till en enda crrna array. Följ rekommendationerna för beredning av omvandling buffert lösningar som används i Cas12a redigering experiment för att uppnå en god omvandling effektivitet jäst.

Det finns några valfria modifieringar av tekniken. Det rekommenderas att använda 1 μg av varje givardna, linearized pRN1120 eller enda crRNA array Expression kassett i omvandlingen, även om användningen av ett lägre DNA-belopp förväntas också resultera i en tillfredsställande omvandlings effektivitet. Utför en test omvandling för att avgöra om lägre DNA-mängder kan användas. Omvandlingen av S. cerevisiae kan utföras med en annan metod än den som beskrivs i detta protokoll, till exempel det protokoll som beskrivs av Gietz et al. (2007) ³⁸. guiden RNA-mottagare plasmid pRN1120 lämpar sig för uttrycket av ett enda crrna och ett enda crrna-utbud av olika Cas12a varianter (t. ex.från acidaminococcus spp. BV3L6 eller Francisella novicida U112) as well as för uttryckt av sgRNA i kombination med Cas9¹⁹. Givaren DNA behöver inte begränsas till karotenoid gen uttrycks kassetter och kompletterande regioner som riktar sig till donator DNA till de beskrivna int1, INT2 och INT3 platser i genomiskt DNA. Alla DNA av intresse kan införas i ett multiplex sätt, till genomiskt DNA av värden av de konstruktionsprinciper som beskrivs i detta protokoll, alternativt kan donator DNA användas för att ta bort DNA från en värd arvsmassa. Den modulära strukturen av Single crRNA array underlättar enkel justering av spacer och direkta upprepningssekvenser. Modifiering av spacer sekvenser möjliggör en ändring av den avsedda integrations Locus som kan utformas med ett av verktygen för identifiering av en genomisk mål plats, t. ex. guidescan programvara 1,0³⁹. Istället för att använda stora flanerande sekvenser som innehåller kopplingar sekvenser, 50-BP i kompletterande regionen kan ingå i givaren DNA sekvenser genom att införliva dessa 50-BP kompletterande region sekvenser i primers som används i PCR. I det här fallet, totalt bara tre i stället för nio givare DNA-fragment krävs för en lyckad multiplex Genome redigering experiment.

Sammanfattnings, detta protokoll ger steg-för-steg-anvisningar för att utföra multiplex genom redigering i S. cerevisiae med Cas12a i kombination med en enda crrna array metod. Protokollet demonstrerades av multiplex genom redigering med 9 givardna fragment och en enda crRNA array kodning för tre gRNAs. Vi visar höga övergripande redigerings frekvenser mellan 50% och 94% för de tre stam konstruktioner som rapporteras här. Avslutande, den unika funktionen hos Cas12a är möjligheten att bearbeta en enda crRNA array i enskilda crRNAs i en cell, vilket gör Cas12a ett utmärkt verktyg för att möjliggöra multiplex genom redigering och utveckla transkriptionella förordning moduler inriktning flera uttrycks kassetter på en och samma gå. I slutändan, tre stammar erhölls producera karotenoider på en annan nivå och färger i nyanser mellan gult och orange. Med dessa stammar och en vild-typ stam, vi visade hur en akustisk vätska hanterare kan användas rakt för att göra jäst pixel konst-detta för att hedra Rosalind Franklin som bidrog till upptäckten av DNA-strukturen 65 år sedan av hennes berömda foto 51^{23 < /C1 >.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals specific for the protocol
1 Kb Plus DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	10787018	Electrophoresis
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A9518	Selection of E. coli transformants
BsaI-HF (20 U/µl)	New England BioLabs	R353L	Golden Gate Cloning
Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)	QIAGEN	854016	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
CutSmart Buffer	New England BioLabs	B7204S	Linearization of pRN1120
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes	Sigma Aldrich	D1626	Transfromation of S. cerevisiae (carrier DNA)
dNTPs	Invitrogen	10297018	PCRs
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S	Linearization of pRN1120
Ethanol absolute for analysis	Merck	100983	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Ethylenediamine-tetraacetic acid	Sigma Aldrich	ED	Transformation of S. cerevisiae
G418 disulfate salt	Sigma Aldrich	A1720	Selection of S. cerevisiae transformants
Histodenz	Sigma Aldrich	D2158	Yeast pixel art
Isopropanol	Merck	100993	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Lithium acetate dihydrate	Sigma Aldrich	L6883	Transformation of S. cerevisiae
Nancy-520 DNA Gel Stain	Sigma Aldrich	1494	Electrophoresis
NEB10 competent E. coli cells	New England BioLabs	C3019H	Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6
Nourseothricin	Jena Bioscience	AB102	Selection of S. cerevisiae transformants
Phusion buffer	New England BioLabs	M0530L	PCRs
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England BioLabs	M0530L	PCRs
Polyethylene glycol 4000	Merck	7490	Transformation of S. cerevisiae
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)	QIAGEN	854016	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Purple loading dye	New England BioLabs	B7024S	Electrophoresis
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27106	Purification of plasmids
RNase coctail enzyme mix	Thermo Fisher Scientific	AM2286	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
T4 DNA ligase buffer	Invitrogen	46300-018	Golden Gate Cloning
T4 DNA Ligase (1 U/µl)	Invitrogen	1705218	Golden Gate Cloning
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500	Electrophoresis
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit	Promega	A9282	Purification of PCR products and linearized pRN1120
Xhol	New England BioLabs	R0146S	Linearization of pRN1120
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL)	Zymo Research	E1006	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)
Zymolyase storage buffer	Zymo Research	E1004-B	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)
Chemicals of general use
2*Peptone-Yeast extract (PY) agar			Plate growth of E. coli
2*PY medium			Cultivation of E. coli
Demineralized water			Transformation of S. cerevisiae
ELFO buffer			Electrophoresis
MQ			Multiple steps
Physiological salt solution			Transformation of S. cerevisiae
TE buffer			Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium			Cultivation of S. cerevisiae
YEPD (2% glucose) agar			Plate growth of S. cerevisiae
Consumables
Eppendorf tubes
Falcon tubes (50 mL)
Microplate 96 wells
Petri dishes
Pipette tips 0.5 - 10 µL
Pipette tips 10 - 200 µL
Pipette tips 100 - 1000 µL
Shake flasks (500 mL)
Sterile filters
Equipment
Centrifuge (Falcon tubes)
Echo 525 acoustic liquid handler
Incubator
NanoDrop
Set for eletrophoresis
Spectrophotometer
Table centrifuge (Eppendorfs tubes)
Thermocycler
Plasmids
pCSN067	Addgene	ID 101748	https://www.addgene.org/
pRN1120	Addgene	ID 101750	https://www.addgene.org/
Strains
S. cerevisiae strain CEN.PK113-7D	EUROSCARF collection		http://www.euroscarf.de