Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

CRISPR/Cas12a मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन Saccharomyces cerevisiae और खमीर पिक्सेल कला का निर्माण

Published: May 28, 2019 doi: 10.3791/59350
Automatic Translation
1,2, 1, 3,4, 1, 1
1DSM Biotechnology Center, 2Biochemistry and Molecular Biology, Department of Chemistry, University of Hamburg, 3BrisSynBio, University of Bristol, Life Sciences Building, 4School of Biological Sciences, University of Bristol, Life Sciences Building

Summary

CRISPR/Cas12a प्रणाली एक एकल crRNA सरणी के साथ संयोजन में एस cerevisiae जीनोम के कुशल बहुसंकेतन संपादन एक साथ कई loci पर सक्षम बनाता है. यह बाद में खमीर पिक्सेल कला बनाने के लिए उपयोग किया जाता है जो खमीर उपभेदों का उत्पादन carotenoid निर्माण द्वारा प्रदर्शन किया है.

Abstract

उच्च दक्षता, उपयोग में आसानी और संकुल की बहुमुखी प्रतिभा नियमित रूप से अंतराल वाले लघु पैलिड्रोमिक दोहराता है/CRISPR-संबद्ध प्रोटीन 9 (CRISPR/Cas9) प्रणाली ने Saccharomyces cerevisiaeके उन्नत आनुवंशिक संशोधन की सुविधा प्रदान की है, एक मॉडल जीव और औद्योगिक जैव प्रौद्योगिकी में workhorse. CRISPR-संबद्ध प्रोटीन 12a (Cas12a), Cas9 से अलग सुविधाओं के साथ एक आरएनए निर्देशित endonuclease इस काम में लागू किया जाता है, आगे जीनोम संपादन प्रयोजनों के लिए आणविक उपकरण बॉक्स का विस्तार. CRISPR/Cas12a प्रणाली का एक लाभ यह है कि यह एकाधिक गाइड RNAs एक एकल प्रतिलिपि इकाई (एकल CRISPR आरएनए (crRNA) सरणी से व्यक्त के साथ मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन में इस्तेमाल किया जा सकता है। हम कई हेटेरोलॉजियस जीनों के मल्टीप्लेक्स एकीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो एक ही crRNA सरणी निर्माण से व्यक्त कई crRNAs के साथ CRISPR/Cas12a प्रणाली का उपयोग करके एस सेरेविसी जीनोम के स्वतंत्र लोकी में होता है। प्रस्तावित विधि एस cerevisiae की क्षमता का शोषण डीएनए टुकड़े के vivo पुनर्संयोजन में प्रदर्शन करने के लिए एक प्लाज्मिड कि transformant चयन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में एकल crRNA सरणी इकट्ठा करने के लिए, साथ ही दाता डीएनए की विधानसभा दृश्यों कि इरादा पदों पर जीनोम में एकीकृत. Cas12a पूर्व expressed गठन है, एकल crRNA सरणी की अभिव्यक्ति पर इरादा पदों पर एस cerevisiae जीनोम के दरार की सुविधा. प्रोटोकॉल डिजाइन और एक एकल crRNA सरणी और दाता डीएनए अभिव्यक्ति कैसेट का निर्माण भी शामिल है, और एक एकीकरण दृष्टिकोण अद्वितीय 50-बीपी डीएनए कनेक्टर्स दृश्यों और अलग एकीकरण पार्श्व डीएनए दृश्यों, जो सरल का उपयोग कर शोषण मानकीकरण और प्रतिरूपीकरण के माध्यम से प्रयोगात्मक डिजाइन और अनुप्रयोगों की सीमा फैली हुई है। अंत में, हम अलग तरह से रंग carotenoid का निर्माण खमीर उपभेदों कि निर्माण किया गया का उपयोग कर एक ध्वनिक तरल हैंडलर के साथ खमीर पिक्सेल कला बनाने के लिए एक सीधी तकनीक का प्रदर्शन.

Introduction

CRISPR/Cas एंजाइमों ने निर्विवाद रूप से आण्विक जीव विज्ञान में क्रांति ला दीहै और इसे इंजीनियरिंग जीनोम के लिए उस गति से उपकरण के रूप में व्यापक रूप से अपनाया गया है जो पहले अव्यवहार्य था . CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन प्रणाली द्वारा एक Saccharomyces cerevisiae जीनोम के पहले संशोधन DiCarlo एट अल द्वारा सूचित किया गया था. 2, सफल जीन नॉक आउट का प्रदर्शन और बाह्य शुरू oligonucleotides का उपयोग कर बिंदु उत्परिवर्तन बनाने. इसके अलावा खमीर CRISPR Toolbox विकास शामिल: उत्प्रेरक निष्क्रिय मृत Cas9 के संलयन द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन (dCas9) ट्रांसक्रिप्शन प्रभावक डोमेन के साथ ट्रांसक्रिप्शन प्रभावक डोमेन के साथ ट्रांसक्रिप्शन3,दोनों के लिए आवेदन जीनोम संपादन और एक साथ सक्रियण, दमन और विलोपन4द्वारा चयापचय मार्ग इंजीनियरिंग के लिए नियामक कार्यों , एस cerevisiae जीनोम5से बड़े टुकड़े को हटाने , और एकाधिक क्रोमोसोम संलयन6 .

CRISPR/Cas जीनोम संपादन प्रणालियों बैक्टीरिया और आर्किया के अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली में अपने मूल पाते हैं और इन प्रणालियों जीनोम संपादन के लिए आणविक जीवविज्ञानियों द्वारा अनुकूलित किया गया है. उनकी कार्यक्षमता क्लस्टर्ड नियमित रूप से अंतराल लघु Palindromic दोहराता है पर आधारित है (CRISPR) डीएनए क्षेत्रों विदेशी डीएनए या आरएनए और CRISPR संबद्ध जीन (Cas) जो आरएनए निर्देशित encodes की मान्यता के लिए जिम्मेदार आरएनए एन्कोडिंग क्षेत्रों अंत:प्रणय1,7,8,9. CRISPR/Cas प्रणालियों के हाल के जीनोम विश्लेषण के आधार पर यह प्रस्ताव किया गया था कि CRISPR/Cas प्रणालियों को दो वर्गों, पांच प्रकार और 16 उपप्रकारों10में विभाजित किया जाए। दोनों वर्गों को लक्ष्य दरार में शामिल effector परिसरों के संगठन के आधार पर प्रतिष्ठित कर रहे हैं. आमतौर पर, एक बहु-उपइकाई संगठन के साथ CRISPR/Cas प्रणालियों को वर्ग 1 के रूप में वर्गीकृत किया गया है, जबकि एकल सबयूनिट प्रभावक परिसर कक्षा 210,11के हैं। इस कागज में, हम वर्ग 2 प्रकार V Cas12a, पूर्व Cpf110,12कहा जाता है, जो वर्ग 2 प्रकार द्वितीय Cas9 के लिए एक विकल्प है का पता लगाने. हालांकि Cas9 अच्छी तरह से विशेषता है और व्यापक रूप से अनुसंधान में इस्तेमाल किया, Cas12a अतिरिक्त सुविधाओं12प्रदान करता है. सबसे पहले, Cas12a एक अतिरिक्त ट्रांस-सक्रिय CRISPR आरएनए (tracrRNA) की आवश्यकता के बिना 42 से 44 न्यूक्लिओटाइड के CRISPR आरएनए (crRNA) के साथ एक जटिल रूपों। इसलिए, CRISPR/Cas12a प्रणालियों के साथ जीनोम संपादन में एक छोटी गाइड आरएनए का उपयोग किया जा सकता है, जो CRISPR/Cas9 की तुलना में है। दूसरे, Cas12a की अद्वितीय एंडोनोक्यूलेस और एंडोरिबोनेक्यूलेस गतिविधि इसके पूर्व crRNA13की परिपक्वता को सक्षम बनाती है। यह RNase गतिविधि एक एकल CRISPR CRNA सरणी पर कई crRNAs के एन्कोडिंग के लिए अनुमति देता है, जबकि Cas9 प्रत्येक तथाकथित एकल गाइड आरएनए (sgRNA) या वैकल्पिक रूप से एक अतिरिक्त endonuclease के उदाहरण अभिव्यक्ति के लिए अलग अभिव्यक्ति की आवश्यकता है ( उदाहरण के लिए, Csy4 प्रत्येक sgRNA14,15आसपास के Csy4 के लिए मान्यता रूपांकनों के साथ संयोजन में . तीसरे, Cas12a लक्ष्य साइट मान्यता लक्ष्य से 5 के अंत में एक प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (PAM) की आवश्यकता है और अपने PAM से +18/+23 स्थिति के बाद claves चिपचिपा समाप्त होता है के साथ cleaved डीएनए में जिसके परिणामस्वरूप, जबकि Cas9 एक PAM की आवश्यकता है 3 के अंत में से 3 ' अंत पर स्थित डी.एन.ए.12में कुंद अंत कटौती बनाने की स्थिति के बाद लक्ष्य और क्लीव्स . चौथे, पीएएम की आम सहमति न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम Cas12a ((टी)टीटीवी) और Cas9 (NGG) के बीच अलग है, जो Cas12a टी अमीर प्रमोटर और टर्मिनेटर अनुक्रम16को लक्षित करने के लिए एक होनहार उम्मीदवार बनाता है. अंत में, हाल ही में एक अध्ययन देशी Cas917के लिए की तुलना में Cas12a के लिए अधिक से अधिक लक्ष्य विशिष्टता की सूचना दी.

हम एस सेरेविसिया ई के जीनोम संपादन के लिए CRISPR/Cas12a प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें एक साथ स्वतंत्र जीनोमिक लोसी (मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन) का उपयोग करके एकाधिक डीएनए अभिव्यक्ति कैसेट की शुरूआत पर विशेष ध्यान दिया जाता है। एक एकल crRNA सरणी. प्रोटोकॉल के मुख्य चरण चित्र 1में दर्शाया गया है। अवधारणा के प्रमाण के रूप में CRISPR/Cas12a प्रणाली को तीन अभिव्यक्ति कैसेटों को एस सेरेविएसिया के जीनोम में लागू करने के लिए लागू किया गया था जो चित्र 2में योजनाबद्ध रूप से दर्शाए गए के रूप में $ कैरोटीन18 के उत्पादन को सक्षम करता है। जेड कैरोटीन का उत्पादन एस सेरेविसीके फीनोटाइप को प्रभावित करता है: अर्थात,कैरोटीनोइड जैव संश्लेषण के लिए आवश्यक सभी तीन विषमजीवी जीनों का सफल परिचय पर, सफेद एस सेरेविएसाइड कोशिकाएं पीले या नारंगी हो जाती हैं, प्रत्येक जीन के प्रमोटर की अभिव्यक्ति की ताकत पर निर्भर करता है. इस मार्ग के सरल दृश्य पठन-पाठन के कारण, इसे उन्नत CRISPR-आधारित प्रणालियों और जीनोम संपादन के लिए विधियों को विकसित करने के लिए शुरू किया गयाहै 19,20. इस काम में, अभिव्यक्ति कैसेट कैरोटीनॉयड जीन crtEएन्कोडिंग, crtYB और crtI एक गोल्डन गेट क्लोनिंग (GGC) दृष्टिकोण21 विषम प्रवर्तकों और समजात टर्मिनेटर के साथ का उपयोग कर निर्माण किया गया है जीनों की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए प्रयोग किया जाता है। अभिव्यक्ति कैसेट अद्वितीय 50-आधार जोड़े (बीपी) दृश्यों से घिरे हुए हैं, कनेक्टर्स कहा जाता है, कि एकीकरण पार्श्व डीएनए दृश्यों के साथ vivo विधानसभा में के लिए अनुमति देते हैं (फ्लैंकिंग क्षेत्रों) एक ही 50-बीपी दृश्यों के साथ, और बाद में एकीकरण flanking क्षेत्रों द्वारा निर्धारित स्थिति पर खमीर के जीनोमिक डीएनए में. विभिन्न प्रमोटर शक्तियों का उपयोग करके, carotenoids उत्पादन के विभिन्न स्तरों के साथ उपभेदों कोशिकाओं के रंग में भिन्नता में जिसके परिणामस्वरूप प्राप्त किए गए थे. इन उपभेदों - "ईस्ट आर्ट प्रोजेक्ट"22 से प्रेरित - Rosalind फ्रेंकलिन के एक 4-रंग उच्च संकल्प "यास तस्वीर" बनाने के लिए एक ध्वनिक तरल हैंडलर के साथ एक खोलना सेटअप में इस्तेमाल किया गया। फ्रैंकलिन (1920-1958) एक अंग्रेजी रसायनज्ञ और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफर थे जो फोटो 5123,24,25द्वारा डीएनए संरचना की खोज में उनके योगदान के लिए जाने जाते थे .

Protocol

1. Cas12a प्लाज्मिड की तैयारी

नोट: Lachnospiraceae जीवाणु ND2006 Cas12a (LbCpf1, pCSN067) codon एस सेरेविसियामें अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित युक्त प्लाज्मिड, पहले 19 का निर्माण किया गया था , एक प्लाज्मिड भंडार में जमा (तालिका देखें ) सामग्री)। यह एक एकल प्रतिलिपि episomal एस cerevisiae/ई कोलाई शटल प्लाज्मिड एक KanMX प्रतिरोध मार्कर जीन युक्त आनुवंशिक (G418) पर एस cerevisiae transformants के चयन के लिए अनुमति देने के लिए है.

  1. pCSN067 प्लाज्मिड प्राप्त करें (सामग्री की सारणीदेखें )।
  2. एक उच्च राशि प्राप्त करने के लिए pCSN067 प्लाज्मिड बढ़ाना.
    1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्लाज्मिड pCSN067 के साथ खरीदे गए रासायनिक रूप से सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं के 25 डिग्री एल रूपांतरण। परिवर्तन मिश्रण 10 और 50 बार 2x पेपटोन-खमीर (PY) में पतला। 2x PY agar प्लेटों पर 10x और 50x तनुकरण बाहर प्लेटें जिसमें एम्पिसिलिन (0.1 ग्राम/L) और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    2. 2 से 3 कालोनियों उठाओ और 2x PY के 3 एमएल में प्रत्येक कॉलोनी टीका और 180 आरपीएम पर एक मिलाते इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर हो जाना।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्लाज्मिड शुद्धि किट का उपयोग करके प्लाज्मिड को शुद्ध करें।

2. एकल CRNA सरणी अभिव्यक्ति कैसेट की तैयारी

  1. एकल crRNA सरणी तैयार करें.
    नोट: एकल CRRNA सरणी एस सेरेविसिया2से एक SNR52 आरएनए पॉलिमरेज III प्रमोटर शामिल हैं , LbCas12a के लिए एक प्रत्यक्ष दोहराने विशिष्ट और एक स्पेसर (जीनोमिक लक्ष्य अनुक्रम), एक साथ प्रत्येक लक्ष्य के लिए दोहराया19 और समाप्त होता है एस सेरेविसिया2से एक SUP4 टर्मिनेटर के साथ | एकल crRNA सरणी एक परिपत्र प्लाज्मिड उत्पन्न करने के लिए linearized प्लाज्मिड pRN1120 में विवो पुनर्संयोजन में द्वारा इकट्ठा किया जाता है, इस प्रकार क्षेत्रों plasmid PRN1120 के लिए homologous एकल crRNA के शुरू और अंत में मौजूद होना चाहिए (चित्र 2A देखें ). यह सिफारिश की है कि अग्रिम रूप से डिजाइन crRNAs की एक संख्या की कार्यक्षमता का मूल्यांकन अलग से19. यह जानकारी बाद में multixing उद्देश्य के लिए एक एकल crRNA सरणी बनाने के लिए प्रत्यक्ष दोहराने और स्पेसर दृश्यों में गठबंधन करने के लिए सबसे कार्यात्मक crRNAs का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
    1. मल्टिप्लेक्स जीनोम संपादन प्रयोगों के लिए एकल crRNA सरणी को सिंथेटिक डीएनए के रूप में ऑर्डर करें (पूरक तालिका 1में एकल crRNA सरणी का डीएनए अनुक्रम देखें)।
    2. आदेश दिया एकल crRNA सरणी बढ़ाना(उदा.,प्राइमर KC-101 और KC-102 (पूरक तालिका 2)) का उपयोग कर. पीसीआर प्रवर्धन मिश्रण तैयार करें जिसमें शामिल हैं: डीएनए पॉलिमरेज का 0.5 डिग्री सेल्सियस, डीएनए पॉलिमरेज के लिए आवश्यक 5x बफर का 10 डिग्री एल, 10 एम एम डीएनटीके का 1 डिग्री एल, 10 एम फॉरवर्ड प्राइमर का 2.5 डिग्री एल, 10 डिग्री एम रिवर्स प्राइमर का 2.5 डिग्रीएल, 5 डिग्री एल और एचपीयू की एकाग्रता में डीएनए टेम्पलेट का 2 डिग्रीएल २ हे 50 डिग्री सेल्सियस की कुल मात्रा तक।
      1. निम्नलिखित प्रोग्राम का उपयोग करते हुए थर्मोसाइकिलर में प्रतिक्रिया करें: (i) 3 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, (ii) 10 s के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, (iii) 20 s के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, (iv) 15 s के लिए 72 डिग्री सेल्सियस - दोहराने के चरणों (ii) करने के लिए (iv) 30 बार, (v) 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 5 मिनट (vi) पकड़ में 12 डिग्री सेल्सियस तक आगे विश्लेषण।
    3. 100 से 10,000 बीपी की एक सीमा में डीएनए टुकड़े के साथ एक डीएनए लोडिंग डाई और डीएनए सीढ़ी का उपयोग कर 40 मिनट के लिए 5 V/cm पर एक 0.8% agarose जेल पर नमूने चलाने के द्वारा electrophoresis द्वारा पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण करें।
    4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग करके पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें।
  2. एकल crRNA सरणी प्राप्तकर्ता प्लाज्मिड तैयार करें।
    नोट: एकल crRNA सरणी एस cerevisiae/ई. कोलाई शटल प्लाज्मिड pRN112019 से व्यक्त की है (सामग्री की तालिकादेखें). इस बहु प्रतिलिपि प्लाज्मिड nourseothricin (NTC) पर एस cerevisiae transformants के चयन की अनुमति देने के लिए एक NatMX प्रतिरोध मार्कर जीन शामिल हैं।
    1. PRN1120 प्लाज्मिड प्राप्त करें।
    2. एक उच्च राशि प्राप्त करने के लिए pRN1120 प्लाज्मिड बढ़ाना.
      1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्लाज्मिड PRN1120 के साथ खरीदे गए रासायनिक रूप से सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं के 25 डिग्री एल को बदलदें। परिवर्तन मिश्रण 2x PY में 10 और 50 बार पतला. 2x PY agar प्लेटों पर 10x और 50x तनुकरण बाहर प्लेटें जिसमें एम्पिसिलिन (0.1 ग्राम/L) और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
      2. 2 से 3 कालोनियों उठाओ और 2x PY के 3 एमएल में प्रत्येक कॉलोनी टीका और 180 आरपीएम पर एक मिलाते इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर हो जाना।
      3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्लाज्मिड शुद्धि किट का उपयोग करके प्लाज्मिड को शुद्ध करें।
    3. इकोआरआई-एचएफ और XhoI के साथ प्लाज्मिड pRN1120 linearize. इसके लिए, एक पाचन मिश्रण तैयार करें जो pRN1120 का 1 डिग्री, 10x बफर का 5 डिग्री एल (1x बफर में 50 एमएम पोटेशियम एसीटेट, 20 एमएम ट्रिस-ऐसीटेट, 10 एमएम मैग्नीशियम एसीटेट, 100 ग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन [BSA]; पीएचएफ एच 7.9), 1L ऑफ इकोआरआई-यू (20) शामिल हैं। , XhoI (20 U) का 1 $L और अल्ट्राप्यूरे H2O 50 डिग्री सेल्सियस की कुल मात्रा तक, पाचन मिश्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए और 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय करें।
    4. एक agarose जेल पर electrophoresis द्वारा linearized प्लाज्मिड का विश्लेषण (0.8%, 40 मिनट, 5 V/cm) एक डीएनए लोड हो रहा है डाई और डीएनए सीढ़ी का उपयोग कर 100 से 10,000 बीपी की एक सीमा में डीएनए टुकड़े के साथ. एक नियंत्रण के रूप में विश्लेषण में एक परिपत्र प्लाज्मिड शामिल हैं।
    5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर linearized प्लाज्मिड को शुद्ध करें।

3. प्रमोटर-ओआरएफ-टर्मिनेटर (पीओटी) दाता डीएनए निर्माण की तैयारी

  1. आदेश विभिन्न शक्ति के प्रमोटर (पी) का एक सेट, खुला पढ़ने फ्रेम (ओ) और टर्मिनेटर (टी) सिंथेटिक डीएनए के रूप में अनुक्रम इस तरह है कि प्रत्येक तत्व मानकीकृत 4-बीपी मान्यता दृश्यों कि Bsaमैं साइटों द्वारा flanked हैं गोल्डन गेट क्लोनिंग सक्षम करने के लिए ( जीजीसी) सभा26 (पूरक तालिका 3 में विस्तृत डिजाइन और अनुपूरक तालिका 4में अनुक्रम देखें)।
  2. एक प्रमोटर, खुला पढ़ने फ्रेम, टर्मिनेटर और कनेक्टर्स दृश्यों से बना पॉट अभिव्यक्ति कैसेट इकट्ठा एक 4 भाग विधानसभा के माध्यम से एक GGC प्रतिक्रिया21का उपयोग कर, एक गंतव्य वेक्टर है कि पहले से ही पूर्व निर्दिष्ट 50-बीपी कनेक्टर्स दृश्यों में शामिल है ( अनुपूरक सारणी 4 देखिए तथा संदर्भ26,27) ।
    1. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर डीएनए भागों की एकाग्रता को मापने. अल्ट्राप्यूर एच2ओ में प्रत्येक डीएनए भाग को 15 फ्मोल/जेडएल की अंतिम सांद्रता के लिए अलग करें।
    2. डीएनए के टुकड़े से बना एक प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें: प्रमोटर के 2 डिग्री एल, खुले पढ़ने के फ्रेम के 2 डिग्री एल, टर्मिनेटर के 2 डिग्री एल और 2 डिग्री एल रीढ़ की हड्डी (स्तर 1 गंतव्य सदिशों के रूप में 26में वर्णित), 5x T4 डीएनए लिगास बफर के 4 $L, 1 यू / , 20 उधL BsAI-HF का 1.5 $L तथा अल्ट्राप्यूर एच2हे 20 डिग्री सेल्सियस की कुल मात्रा तक।
    3. निम्नलिखित प्रोग्राम का उपयोग करते हुए थर्मोसाइकिलर में जीजीसी अभिक्रिया करें: (i) 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 2 मिनट, (ii) 16 डिग्री सेल्सियस के लिए 5 मिनट - दोहराने के चरणों (i) और (ii) 50 बार, (iii) 60 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, (iv) 45 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस, (v) आगे विश्लेषण तक 12 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार जीजीसी प्रतिक्रिया मिश्रण के 3 डिग्री एल के साथ खरीदे गए रासायनिक रूप से सक्षम ई. कोलाई28 कोशिकाओं के 25 डिग्री एल को बदलदें। परिवर्तन मिश्रण 2x PY में 10 और 50 बार पतला. 2x PY agar प्लेटों पर 10x और 50x तनुकरण बाहर प्लेटें जिसमें एम्पिसिलिन (0.1 ग्राम/L) और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  4. 2 से 3 कालोनियों उठाओ और 2x PY के 3 एमएल में प्रत्येक कॉलोनी टीका और 180 आरपीएम पर एक मिलाते इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर हो जाना।
  5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्लाज्मिड शुद्धि किट का उपयोग करके प्लाज्मिड को शुद्ध करें।
  6. जाँच करें कि क्या पॉट अभिव्यक्ति कैसेट पीसीआर द्वारा जीजीसी प्रतिक्रिया में सही ढंग से इकट्ठे हुए थे।
    1. प्रत्येक व्यंजक कैसेट के प्रारंभ और अंत में उपस्थित संबंधक अनुक्रम के पूरक प्राइमर डिज़ाइन करें (चित्र 2खदेखें)। इस प्रोटोकॉल में चुने गए कनेक्टर्स के लिए केसी-103 का उपयोग KC-108 (पूरक तालिका 2देखें) के लिए करें।
    2. प्रत्येक प्लाज्मिड युक्त के लिए पीसीआर प्रवर्धन मिक्स तैयार करें: 0.5 डिग्री सेल्सियस प्रूफरीडिंग डीएनए पॉलिमरेज, डीएनए पॉलिमरेज के लिए आवश्यक 5x बफर के 10 डिग्री एल, 10 एमएम डीएनटीपी के 1 डिग्री एल, 10 डिग्री एम फॉरवर्ड प्राइमर के 2.5 एल, 10 डिग्री एम रिवर्स प्राइमर के 2.5 डिग्री एल, एक ध्यान केंद्रित के साथ डीएनए टेम्पलेट के 2L 5 एनजी/जेडएल का आयन, तथा अतिपुरे H2O का कुल आयतन 50 डिग्री सेल्सियस तक।
    3. निम्नलिखित प्रोग्राम का उपयोग करते हुए थर्मोसाइकिलर में पीसीआर अभिक्रिया करें: (i) 98 डिग्री सेल्सियस, (ii) 10 s के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, (iii) 20 s के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, (iv) 2 मिनट 30 s के लिए 72 डिग्री सेल्सियस - दोहराने के चरणों (ii) से (iv) 30 बार, (v) 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 5 मिनट , (vi) आगे के विश्लेषण तक 12 डिग्री सेल्सियस पर पकड़.
      नोट: परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पादों 5' कनेक्टर, प्रमोटर, खुले पढ़ने फ्रेम, टर्मिनेटर और 3 ' कनेक्टर के 50-बीपी के 50-बीपी से मिलकर बनता है।
  7. 100 से 10,000 बीपी की एक सीमा में डीएनए टुकड़े के साथ एक डीएनए लोडिंग डाई और डीएनए सीढ़ी का उपयोग कर 40 मिनट के लिए 5 V/cm पर एक 0.8% agarose जेल पर नमूने चलाने के द्वारा electrophoresis द्वारा पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण करें।

4. एकीकरण पार्श्व डीएनए दृश्यों कनेक्टर्स दृश्यों युक्त की तैयारी

  1. जंगली प्रकार से जीनोमिक डीएनए शुद्ध S. cerevisiae CEN.PK113-7D29|
    1. खमीर निकालने पेपटोन डेक्सट्रोज (YEPD, 2% ग्लूकोज) मध्यम 30 डिग्री सेल्सियस पर और 48 घंटे के लिए 250 आरपीएम पर मिलाते हुए के 100 एमएल से भरा एक 500 एमएल शेक फ्लास्क में तनाव बढ़ाएँ।
    2. कोशिकाओं को 1 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर 2 एमएल शोरबा के अपकेंद्रण द्वारा फसल और supernatant त्याग ें.
    3. शारीरिक नमक में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (200 $L; 0.85% NaCl समाधान) RNase के साथ (10 $L, 10 mg/mL) और खमीर lytic एंजाइम (4 $L). 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन इनक्यूबेट करें।
    4. सेल lysis समाधान के 300 डिग्री सेल्सियस जोड़ें (सामग्री की मेजदेखें) और भंवर शीघ्र ही.
    5. 168 डिग्री प्रोटीन वर्षण समाधान जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें ) और भंवर जोरदार 20 s के लिए.
    6. 10 मिनट के लिए 16,000 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा प्रोटीन अंश को अलग करें। एक नई ट्यूब में सुपरनेंट के 600 डिग्री सेल्सियस को एकत्र करें और इसोप्रोपेनोल और भ्रमिल के 600 डिग्री एल के साथ शीघ्र ही मिलालें।
    7. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 16,000 x ग्राम पर नीचे कताई द्वारा डीएनए पुनर्प्राप्त करें। supernatant त्यागें और गोली रखने के लिए।
    8. इथेनॉल के 200 $L (70%) के साथ गोली धो लें. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 16,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant हटा दें। ढक्कन खोला के साथ 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब incubating द्वारा इथेनॉल का वाष्पित करें।
      नोट: यदि ट्यूब में तरल अभी भी दिखाई दे रहा है, तो चरण 4.1.8 दोहराएँ। डीएनए की कमी घुलनशीलता को रोकने के लिए 10 मिनट से अधिक समय तक गोली न सुखाें।
    9. ते बफर के 50 डिग्री एल में डीएनए भंग. शुद्ध डीएनए को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. प्रत्येक एकीकरण साइट के लिए, डिजाइन एकीकरण पार्श्व डीएनए दृश्यों (लगभग 500 बीपी) इस तरह है कि लगभग 1000 जीनोमिक डीएनए के बीपी दाता डीएनए की शुरूआत पर हटा दिया जाएगा (चित्रा 2B में योजनाबद्ध डिजाइन और अनुपूरक में दृश्यों देखें तालिका 4)
  3. पीसीआर द्वारा flanking क्षेत्रों उत्पन्न करने के लिए प्राइमर डिजाइन।
    1. बाईं बगल क्षेत्रके लिए, आगे डिजाइन और रिवर्स प्राइमर के लिए लगभग बढ़ाना 500 बीपी जीनोमिक डीएनए क्षेत्र तैनात 5' (बाएं) ब्याज की एकीकरण साइट के.
      नोट: आगे प्राइमर इरादा flanking क्षेत्र के साथ होमोलोजी के 20 बीपी भी शामिल है. रिवर्स प्राइमर इरादा flanking क्षेत्र के साथ homology के साथ 20 बीपी भी शामिल है और वांछित 50-बीपी संबंधक अनुक्रम में शामिल करने के लिए बाद में जीनोम पर Cas12a संपादन में vivo विधानसभा में सक्षम.
    2. सही flanking क्षेत्रके लिए, आगे डिजाइन और रिवर्स प्राइमर जीनोमिक डीएनए क्षेत्र के लगभग 500 बीपी बढ़ाना करने के लिए तैनात 3' (दाएं) ब्याज की एकीकरण साइट के.
      नोट: आगे प्राइमर इरादा flanking क्षेत्र के साथ homology के साथ 20 बीपी भी शामिल है और वांछित 50-बीपी संबंधक अनुक्रम में शामिल करने के लिए बाद में जीनोम पर Cas12a संपादन में vivo विधानसभा में सक्षम. रिवर्स प्राइमर इरादा flanking क्षेत्र के साथ होमोलोजी के 20 बीपी भी शामिल है.
  4. डिजाइन प्राइमर(उदा.,प्राइमर्स केसी-109 से केसी-120) के साथ बगल वाले क्षेत्रों को बढ़ाना अनुपूरक तालिका 2में संलग्न है।
    1. पीसीआर में टेम्पलेट के रूप में काम करेगा कि शुद्ध जीनोमिक डीएनए की एकाग्रता को मापने। डीएनए सांद्रता को 50 एनजी/
    2. पीसीआर प्रवर्धन जीनोमिक डीएनए से बना मिश्रण तैयार करें (1 - 50 एनजी के 4 डिग्री एल जीओमिक डीएनए कमजोर पड़ने) चरण 4.1 में शुद्ध, आगे और रिवर्स प्राइमर (10 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक), 1 $L के 1 $L dNTPs, 5x बफर के 10L डीएनए बहुलक के लिए आवश्यक, 0.5 L डीएनए बहुलक के लिए आवश्यक (1.0) , और अतिपुरे एच2हे 50 डिग्री सेल्सियस की कुल मात्रा तक।
    3. निम्नलिखित प्रोग्राम का उपयोग करते हुए एक थर्मोसाइकिलर में पीसीआर निष्पादित करें: (i) 3 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, (ii) 98 डिग्री सेल्सियस के लिए 20 s, (iii) 20 s के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, (iv) 15 s के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, दोहराने के चरणों (ii) करने के लिए (iv) 30 बार, (v) 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 5 मिनट , (vi) आगे के विश्लेषण तक 12 डिग्री सेल्सियस पर पकड़.
  5. 100 से 10,000 बीपी की एक सीमा में डीएनए टुकड़े के साथ एक डीएनए लोडिंग डाई और डीएनए सीढ़ी का उपयोग कर 40 मिनट के लिए 5 V/cm पर इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण करें।
  6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग करके सही पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें।

5. एस सेरेविएसिया में परिवर्तन

नोट: Gietz एट अल द्वारा विकसित की विधियों के आधार पर एक प्रोटोकॉल का उपयोग कर रूपांतरण प्रदर्शन करते हैं। (1995) 30 और हिल एट अल. 31 जो एस सेरेविसियाके विभिन्न उपभेदों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल नीचे वर्णित 1 रूपांतरण के लिए पर्याप्त है।

  1. रूपांतरण के लिए आवश्यक समाधान तैयार करें।
    1. निम्नलिखित स्टॉक समाधान और फिल्टर बाँझ तैयार करें: 10x TE बफर युक्त 100 m Tris-HCl (पीएच 7.5), 10 एमएम EDTA, 50 एमएल की कुल मात्रा; 1 M LIAc पर पीएच 7.5, 50 एमएल की कुल मात्रा; 50% खूंटी 4000, 100 एमएल की कुल मात्रा.
      नोट: हमेशा की जाँच करें कि खूंटी 4000 स्टॉक pH 5 पर है। इस स्टॉक को एक महीने से अधिक समय तक संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए.
    2. स्टॉक का उपयोग करके निम्नलिखित समाधान तैयार करें: 0.1 एम लीएसी, 10 एमएम ट्राइस-एचसीएल, 1 एमएम एडटा, 0.5 एमएल की कुल मात्रा युक्त LiAc-TE समाधान तैयार करें। 40% खूंटी 4000, 0.1 एम लीएसी, 10 एमएम ट्राइस-एचसीएल, 1 एमएम एडटा, 1 एमएल की कुल मात्रा युक्त खूंटी-लीएसी-टीई समाधान तैयार करें।
      नोट: यह सफल परिवर्तन के लिए महत्वपूर्ण है कि खूंटी-LiAc-TE और LIAc-TE समाधान ताजा तैयार कर रहे हैं.
  2. पहले परिवर्तन दौर (तनाव पूर्व व्यक्त Cas12a) की तैयारी.
    नोट: सभी परिवर्तन चरणों में, 5 से अधिक पीएच के साथ पानी का उपयोग करें। यह परिवर्तन के सभी चरणों में deminralized पानी का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.
    1. तनाव CEN बढ़ रही द्वारा एक पूर्व संस्कृति तैयार करें. एक 100 एमएल शेक फ्लास्क में PK113-7D जिसमें YEPD (2% ग्लूकोज) मध्यम के 20 एमएल होते हैं और 250 आरपीएम पर मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करते हैं।
    2. पूर्व संस्कृति के OD600 उपाय(ओडी पीसी). पूर्व-संस्कृति की मात्रा और परिवर्तन (रूपांतरण संस्कृति) में उपयोग किए जाने वाले पूर्व-एक्स्प्रेसिंग Cas12a की तैयारी के लिए आवश्यक नए माध्यम की मात्रा के बीच कमजोर पड़ने के कारक (डीएफ) की गणना करें। गणना में परिवर्तन संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व मान (ओडीटीसी) 5.2.3 (ती )में वर्णित ऊष्मायन चरण के बाद 1.0 हो .
      Equation 1
      जहां टीआई और जेड ऊष्मायन समय और दोहरीकरण समय क्रमशः कर रहे हैं।
      1. तनुता कारक पर आधारित रूपांतरण संस्कृति (टटृ ) के संरोपण के लिए आवश्यक पूर्व-संस्कृति (टम) की मात्रा की गणना कीजिए।
        Equation 2
    3. पिछले चरण में निर्धारित पूर्व-संस्कृति की मात्रा के साथ YEPD (2% ग्लूकोज ) (Vtc) के 20 एमएल के टीका द्वारा परिवर्तन संस्कृति तैयार करें (Vi)। 250 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    4. 1.0 के एक OD600 तक पहुँच गया है जब तक परिवर्तन संस्कृति के OD600 उपाय.
    5. 20 एमएल शोरबा के अपकेंद्रण द्वारा कोशिकाओं को 2,500 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए फसल दें। सुपरनेंट को त्यागें और कक्ष के तापमान deminralized पानी के 20 एमएल में कोशिकाओं को धो लें। अपकेंद्रण चरण दोहराएँ और कोशिका गोली रखें.
    6. LiAc-TE समाधान के 100 डिग्री सेल्सियस में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और एक microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरण.
    7. एकल-स्ट्रेंडवाहक डीएनए (10 मिलीग्राम/एमएल सामन शुक्राणु डीएनए) के 5 डिग्री एल जोड़ें और पाइपटिंग द्वारा मिश्रण करें।
    8. पिपेट 1 $g प्लाज्मिड pCSN067 माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए।
      नोट: डीएनए मिश्रण की कुल मात्रा से अधिक नहीं होना चाहिए 100 $L एक कम परिवर्तन दक्षता को रोकने के लिए.
    9. PEG-LiAc-TE समाधान के 600 $L जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मिश्रण. एक टेबल टॉप हीट ब्लॉक में 450 आरपीएम पर मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    10. DMSO के 70 $L जोड़ें (100%) परिवर्तन मिश्रण करने के लिए और pipeting द्वारा मिश्रण. पानी के स्नान में 15 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर परिवर्तन मिश्रण incubating द्वारा गर्मी के झटके प्रदर्शन.
    11. मिश्रण को 15 एमएल गोल नीचे ट्यूब में स्थानांतरित करके कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें और ट्यूब में YEPD (2% ग्लूकोज) के 10 एमएल जोड़ें। 250 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट करें।
    12. 5 मिनट के लिए 2,500 x ग्राम पर रूपांतरण मिश्रण को केंद्रमेंत करें। सुपरनेंट को त्यागें और शेष समाधान के लगभग 200 डिग्री एल में कोशिका गोली को पुन: निलंबित करें।
    13. बाहर प्लेट परिवर्तन मिश्रण के 150 $L और YEPD में एक 20x कमजोर पड़ने (2% ग्लूकोज) YEPD पर परिवर्तन मिश्रण की (2% ग्लूकोज) agar प्लेटें 0.2 g/L G418 के साथ पूरक. प्लेटों को 48 - 72 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    14. एक एकल कॉलोनियां प्राप्त करने के लिए एक YEPD (2% ग्लूकोज) agar प्लेट 0.2 g/L G418 के साथ पूरक पर एक एकल transformant और फिर से लकीर उठाओ.
  3. दूसरा रूपांतरण दौर (CRISPR/Cas12a के साथ मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन निष्पादित करें)।
    1. तनाव पूर्व-expressing Cas12a बढ़ रही द्वारा एक पूर्व संस्कृति तैयार, पहले परिवर्तन दौर में बनाया (चरण 5.2), एक 100 एमएल हिला फ्लास्क में YEPD के 20 एमएल युक्त (2% ग्लूकोज) मध्यम 0.2 g/L G418 के साथ पूरक. 250 आरपीएम मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट करें।
      नोट: एकाधिक रूपांतरणों के लिए, पूर्व संस्कृति की मात्रा अनुकूलित करें।
    2. पहले रूपांतरण दौर के लिए 5.2.2 से 5.2.7 चरणों का पालन करें.
      नोट: कई परिवर्तनों के लिए, आवश्यक समाधान और तनाव पूर्व-expressing Cas12a की संस्कृति की मात्रा अनुकूलन.
    3. पिपेट 1 एकल crRNA सरणी के ग्राम, crRNA सरणी के लिए रैखिक प्राप्तकर्ता प्लाज्मिड के 1 डिग्री ग्राम, दाता डीएनए के 1 डिग्री ग्राम और प्रत्येक flanking क्षेत्र के 1 डिग्री ग्राम (कदम 4.3) microcentrifuge ट्यूब में.
      नोट: डीएनए मिश्रण की कुल मात्रा से अधिक नहीं होना चाहिए 100 $L एक कम परिवर्तन दक्षता को रोकने के लिए.
    4. परिवर्तन के लिए निम्नलिखित नियंत्रण तैयार करें: नकारात्मक नियंत्रण (अल्ट्राप्यूर एच2ओ); परिवर्तन दक्षता के निर्धारण के लिए सकारात्मक नियंत्रण (1 $g परिपत्र pRN1120; एक नियंत्रण की पुष्टि अगर दाता डीएनए की शुरूआत CRISPR संपादन के माध्यम से आयोजित किया जाता है (1 परिपत्र pRN1120 के 1 $g, सभी दाता डीएनए अभिव्यक्ति कैसेट के 1 $g और flanking क्षेत्रों के 1 $g लेकिन कोई एक crRNA सरणी); नियंत्रण की पुष्टि अगर दाता डीएनए लक्ष्य के बाहर एकीकृत किया जा सकता है (1 रैखिकीकृत pRN1120 के ग्राम, दाता डीएनए अभिव्यक्ति कैसेट के 1 $g और एकल crRNA सरणी के 1 डिग्री ग्राम लेकिन कोई flanking क्षेत्रों); pRN1120 के पूर्ण रैखिकीकरण की पुष्टि करने वाला नियंत्रण (1 $g रैखिकीकृत pRN1120)।
    5. पहले रूपांतरण दौर के लिए 5.2.9 से 5.2.12 चरणों का पालन करें।
    6. परिवर्तन मिश्रण के 150 डिग्री सेल्सियस और YEPD में 20x कमजोर पड़ने (2% ग्लूकोज) YEPD पर परिवर्तन मिश्रण के बाहर प्लेट (2% ग्लूकोज) agar 0.2 g/L G418 और 0.2 g/L NTC के साथ पूरक. YEPD पर नियंत्रण बाहर प्लेट (2% ग्लूकोज) agar उपयुक्त चयन के साथ पूरक (G418 और / प्लेटों को 48 - 72 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    7. एक ही रंग की कालोनियों को प्राप्त करने के लिए एक एकल रंग transformant उठाओ और एक YEPD (2% ग्लूकोज) आगर प्लेट पर फिर से लकीर.

6. जीनोम संपादन दक्षता का मूल्यांकन

  1. परिवर्तन प्लेटों पर रंगीन कालोनियों और सफेद कालोनियों की संख्या की गणना.
  2. सारणी 1में दर्शाए गए के रूप में, रंगीन कालोनियों की कुल संख्या (सफेद और रंगीन दोनों) से विभाजित करके जीनोम संपादन दक्षता की गणना कीजिए।

7. इरादा loci में दाता डीएनए के एकीकरण की पुष्टि

  1. एक YEPD पर एक परिवर्तन प्लेट से एक रंगीन एकल कॉलोनी फिर से तोड़ (2% ग्लूकोज) G418 और NTC चयन के बिना agar प्लेट और 30 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट.
  2. एक एकल कॉलोनी उठाओ और YEPD (2% ग्लूकोज) माध्यम के 100 एमएल से भरा एक 500 एमएल हिला फ्लास्क टीका। 30 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट और 250 आरपीएम पर मिलाते हुए।
  3. धारा 4.1 में वर्णित जीनोमिक डीएनए को अलग करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, कॉलोनी पीसीआर के लिए खमीर की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल का उपयोग पहले Looke एट अलद्वारा प्रस्तावित . 32. इस स्थिति में, तरल माध्यम में वृद्धि (धारा 7-2) को छोड़ दिया जा सकता है।
  4. एकीकृत अभिव्यक्ति कैसेट प्रति दो टुकड़े के प्रवर्धन द्वारा सही एकीकरण सत्यापित करें.
    1. डिज़ाइन प्राइमर जो रूपांतरित पार्श्व क्षेत्रों और ब्याज के जीन के बाहर जीनोमिक डीएनए के लिए anneal (पूरक तालिका 2, KC-121 से KC-132) में उदाहरण देखें. केसी-132 के लिए प्राइमर KC-121 का उपयोग करते समय, पीसीआर प्रोग्राम में अनीलिंग तापमान को 62 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    2. ब्याज के क्षेत्र को बढ़ाना जैसा कि धारा 4.4.2 में वर्णित है। पीसीआर कार्यक्रम अनुकूलित, विशेष रूप से पीसीआर में विस्तार कदम के समय को समायोजित करने के लिए टेम्पलेट और डीएनए polymerase के लिए निर्माता की सिफारिशों की लंबाई के अनुसार.
  5. एक agaros जेल पर electrophoresis द्वारा पीसीआर उत्पादों के आकार की जाँच करें (0.8%, 40 मिनट, 5 V/cm) एक डीएनए लोड हो रहा है डाई और डीएनए सीढ़ी का उपयोग कर डीएनए टुकड़े के साथ 100 से 10,000 बीपी की एक सीमा में.

8. एक ध्वनिक तरल हैंडलर का उपयोग खमीर पिक्सेल कला का निर्माण

  1. खमीर पिक्सेल कला के लिए एक तस्वीर टेम्पलेट तैयार करें.
    1. मूल RGB चित्र का आकार बदलें (220 $ 280 पिक्सेल, प्रतिनिधि परिणाम देखें), उदा. ImageJ का उपयोग कर एक अंतिम 64 $ 96 पिक्सेल (चौड़ाई ऊंचाई) ग्रे पैमाने पर छवि इरादा रंग (प्रतिनिधि परिणाम) में कल्पना बनाने के लिए.
    2. इस सूत्र का उपयोग करके RGB चित्र को धूसर-स्केल में कनवर्ट करें:
      Equation 3
      जहां मैंजीआर, मैंr, मैंजी, मैंख ग्रे, लाल, हरे और नीले तीव्रता, क्रमशः कर रहे हैं।
    3. पिक्सल को वर्गीकृत करने के लिए, निम्नलिखित नियमों को लागू करने के लिए एक ImageJ प्लगइन विकसित करें: (क) यदि मैंजीआर है - 64, इस पिक्सेल के लिए गहरे नारंगी खमीर (तनाव 1, अनुपूरक तालिका3) का उपयोग करें। (ख) यदि 64 और lt; मैंइस पिक्सेल के लिए नारंगी खमीर (तनाव 2, अनुपूरक तालिका3) का उपयोग करें। (ग) यदि 128 और lt; मैंइस पिक्सेल के लिए पीले खमीर (तनाव 3, अनुपूरक तालिका3) का उपयोग करें। (घ) यदि मैंजी.आर.gt; 192, सफेद खमीर (सीईएन) का उपयोग करें। इस पिक्सेल के लिए PK113-7D)।
  2. स्पॉट खमीर कोशिकाओं खमीर पिक्सेल कला बनाने के लिए.
    1. टीका 500 एमएल हिला फ्लास्क युक्त 100 एमएल YEPD (2% ग्लूकोज) मध्यम तीन अलग अलग रंग का carotenoid उत्पादन एस cerevisiae तनाव और जंगली प्रकार CEN के साथ. PK113-7D. 250 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट संस्कृतियों।
    2. रात भर की संस्कृति का 0.5 एमएल बाँझ गैर-आयनिक घनत्व प्रवणता माध्यम से भरे हुए ट्यूब में स्थानांतरित करें (सामग्री की सारणीदेखें)। संक्षेप में भंवर द्वारा मिक्स.
    3. एक योग्य जलाशय, 2 x 3 अच्छी तरह से सेल निलंबन स्थानांतरण. एक microplate के लिए एक योग्य जलाशय स्रोत प्लेट से एक ध्वनिक तरल हैंडलर साधन का उपयोग कर खोलना प्रदर्शन (सामग्री की तालिकादेखें) YEPD के 50 एमएल युक्त (2% ग्लूकोज) agar. चढ़ाना को सरल बनाने के लिए, प्लेट पर कुओं को परिभाषित, उदा. एक 6144 अच्छी तरह से थाली (64 ] 96) के रूप में एक microplate का उपयोग करें.
    4. गंतव्य microplate पर तरल पदार्थ अंशांकन सेटिंग 6RES$AQ$GPSA2 के साथ एक .csv फ़ाइल का उपयोग कर 2x 3 अच्छी तरह से जलाशय स्रोत प्लेट से प्रत्येक एस cerevisiae तनाव के 25 एनएल स्पॉट। इन 25 एनएल बूंदों में से प्रत्येक को 64 x 96 ग्रिड में पिक्सेल के रूप में परिभाषित करें जिसका अच्छी स्थिति (ए01, बी01, ब्01 आदि) में अनुवाद किया गया है।
    5. माइक्रोप्लेट को 48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। उपभेदों के रंग को तेज करने के लिए कम से कम 72 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर आगर प्लेट की दुकान.

Representative Results

CRISRP/Cas12a का उपयोग कर मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन के लिए प्रोटोकॉल तीन carotenoid उत्पादन एस cerevisiae उपभेदों का निर्माण करके प्रदर्शन किया गया था crtE, crtYB और crtI जीन विषम प्रवर्तकों का उपयोग कर उच्च, मध्यम और निम्न शक्ति: तनाव 1, 2 और, 3 क्रमशः (पूरकसारणी 3)। इन उपभेदों के निर्माण के लिए तीन दाता डीएनए अभिव्यक्ति कैसेट और छह पार्श्व क्षेत्रों के उत्पादन की आवश्यकता है जो जीनोमिक डीएनए में तीन अलग-अलग लोकी को लक्षित करने के लिए प्रति तनाव है (चित्र 2खमें दिखाया गया है )। जैसा कि यहां वर्णित है, प्रमोटर, ओपन रीडिंग फ्रेम, टर्मिनेटर और दो आसन्न 50-बीपी कनेक्टर्स अनुक्रम एक अभिव्यक्ति कैसेट में एक गोल्डन गेट क्लोनिंग प्रतिक्रिया के माध्यम से इकट्ठे हुए थे और विधानसभा पीसीआर द्वारा सत्यापित किया गया था (चित्र 3ए)। एकल crRNA सरणी एक सिंथेटिक डीएनए टुकड़ा के रूप में आदेश दिया गया था और पीसीआर द्वारा परिलक्षित किया गया था (चित्र 3बी) . एकल crRNA सरणी के लिए प्राप्तकर्ता प्लाज्मिड (प्लास्मिड PRN1120) पारिस्थितिकीRI-HF और XhoI के साथ linearized किया गया था और linearization electrophoresis द्वारा पुष्टि की गई थी (चित्र 3सी). प्रारंभ किए गए दाता डीएनए अभिव्यक्ति कैसेट और पार्श्व क्षेत्रों के डिजाइन और न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम ों को अनुपूरक सारणी 3 और अनुपूरक सारणी 4में दर्शाया गया है। एकल CRRNA सरणी अभिव्यक्ति कैसेट का अनुक्रम अनुपूरक तालिका 1में प्रदान किया गया है। एकल crRNA सरणी में शामिल स्पेसर्स की कार्यक्षमता का पहले से ही व्यक्तिगत CRRNAs19के साथ एकल प्लेक्स जीनोम संपादन द्वारा परीक्षण किया गया था.

Cas12a का उपयोग जीनोम संपादन की दक्षता सबसे पहले परिवर्तन के बाद प्राप्त रंगीन कालोनियों की संख्या के आधार पर मूल्यांकन किया गया था (तालिका 1, चित्र 4) . तीन निर्मित उपभेदों के संपादन दक्षता 50% से 94% के लिए विभिन्न. विशेष रूप से, तनाव उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल अभिव्यक्ति कैसेट की शुरूआत 1 सबसेकम संपादन दक्षता प्रदर्शित, संभवतः दाता डीएनए की प्रकृति के कारण (यानी, इन अभिव्यक्ति कैसेट crtE, crtYB और crtI एन्कोड एन्कोड तीन उच्च शक्ति प्रमोटरों से). दूसरे, जीनोमिक डीएनए पर इरादा लोकी पर तीन दाता डीएनए अभिव्यक्ति कैसेट के सही एकीकरण पीसीआर द्वारा पुष्टि की गई थी (चित्र 5)। प्राइमर को इस तरह से डिजाइन किया गया था कि पीसीआर उत्पादों को प्राप्त किया गया था जब इरादा टिड्डी पर दाता डीएनए का सही एकीकरण हुआ था। प्रत्येक परिवर्तन प्रयोग के लिए, आठ कालोनियों रूपांतरण प्लेट से उठाया गया और परीक्षण किया गया (ध्यान दें कि केवल तीन चित्र 5में प्रस्तुत कर रहे हैं) . सामान्य तौर पर, दाता डीएनए के अनुसार परीक्षण की गई 8 कालोनियों में से, INT1 टिड्डी पर crtE दाता डीएनए का सही एकीकरण, INT3 टिड्डी पर crtYB और INT3 टिड्डी पर crtI में पुष्टि की गई थी और 90% transformants के. इन परिणामों को एक एकल crRNA सरणी के साथ संयोजन में CRISPR/Cas12a प्रणाली का प्रदर्शन एस cerevisiae जीनोम के कुशल बहुसंकेतन संपादन एक साथ कई loci पर सक्षम बनाता है.

इसके अतिरिक्त, हम तीन carotenoid उत्पादन उपभेदों है कि एक गैर रंग जंगली प्रकार तनाव के साथ एक साथ निर्माण किया गया का उपयोग कर "यास्ट पिक्सेल कला" के निर्माण का प्रदर्शन. Rosalind फ्रेंकलिन के एक काले और सफेद चित्र से शुरू (चित्र 6ए), एक 4-रंग चित्र (चित्र 6बी) और खोलना सूची बनाया गया था जो तब एक agar microplate पर चार अलग खमीर उपभेदों हाजिर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था एक ध्वनिक तरल हैंडलर, Rosalind फ्रेंकलिन के एक उच्च संकल्प "यास्ट पेंटिंग" में जिसके परिणामस्वरूप (चित्र 6सी, डी, ई).

Figure 1
चित्र 1 : CRISPR/Cas12a मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन के लिए प्रोटोकॉल का कार्यप्रवाह S. cerevisiaeमें | वर्कफ़्लो प्रस्तुत विधि के महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं। विवरण के लिए प्रोटोकॉल देखें. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : CRISPR/Cas12a मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन की योजना एक ही crRNA सरणी का उपयोग कर. (ए) एकल crRNA सरणी उनके परिपक्व रूप में तीन crRNAs इकाइयों से बना है, एक 20-बीपी प्रत्यक्ष दोहराने के लिए विशिष्ट LbCas12a (ग्रे वर्गों) के साथ एक 23-बीपी गाइड अनुक्रम (रंग हीरे). CRRNA सरणी की अभिव्यक्ति SNR52 प्रमोटर और SUP4 टर्मिनेटर द्वारा सक्षम है. एक linearized pRN1120 और एक crRNA सरणी अभिव्यक्ति कैसेट pRN1120 के साथ होमोलॉजी युक्त के साथ एस cerevisiae का परिवर्तन (डायगोनल धारियों) के लिए एक परिपत्र प्लाज्मिड में एक परिपत्र प्लाज्मिड में कोशिकाओं में पूर्व-एक्सप्रेसिंग की अनुमति देता है LbCas12a. एकल crRNA सरणी बाद में Cas12a द्वारा संसाधित है. (बी) Cas12a इरादा INT1, INT2 और INT3 जीनोमिक लक्ष्य साइटों के लिए निर्देशित किया जाता है और डबल फंसे टूट बनाता है. परिवर्तन मिश्रण में, दाता डीएनए flanking क्षेत्रों और carotenoid जीन अभिव्यक्ति कैसेट से मिलकर शामिल थे. दाता डीएनए विधानसभाओं INT1 के आसपास जीनोमिक डीएनए में डीएनए के एक खंड को लक्षित किया गया (crtE), INT2 (crtYB) और INT3 (crtI) loci में vivo पुनर्संयोजन में 50-बीपी समजात संबंधक अनुक्रम की उपस्थिति के कारण, 5, ए, बी, सी, डी या ई. P1-P3, विभिन्न प्रमोटरों के रूप में संकेत दिया; T1-T3, विभिन्न टर्मिनेटर. यह आंकड़ा Verwaal एट अल से संशोधित किया गया है 201819. आनुवंशिक निर्माण सिंथेटिक जीवविज्ञान ओपन लैंग्वेज (SBOL) दृश्य प्रतीकों40का उपयोग कर दिखाया | कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : पीसीआर जीनोम संपादन प्रयोगों की पुष्टि. (क) इकट्ठे हुए दाता डीएनए कैसेट की गोल्डन गेट क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं का सत्यापन। प्राप्त परिणाम अपेक्षित लंबाई के साथ समझौते में हैं. (B) एकल crRNA सरणी के पीसीआर. (ग) प्लाज्मिड PRN1120 का रैखिकीकरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन दृष्टिकोण का उपयोग कर एस cerevisiae परिवर्तनों की प्लेट्स. (क) तीन मजबूत प्रवर्तकों (अंधेरे नारंगी उपनिवेशों) से क्रेट , क्रेटीबीऔर क्रेटी को व्यक्त करना । (ख) तीन मध्यम शक्ति प्रवर्तकों (नारंगी उपनिवेशों) से क्रेट 2 व्यक्त crtYBऔर crtI . (ग) तीन निम्न शक्ति प्रवर्तकों (पीले उपनिवेशों) से क्रेट 3 व्यक्त crtE, crtYB और crtI . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : पीसीआर जीनोमिक डीएनए के भीतर इरादा loci पर दाता डीएनए अभिव्यक्ति कैसेट के एकीकरण की पुष्टि. (क) तनाव 1 की तीन कालोनियों का सत्यापन। (ख) तनाव 2 की तीन कालोनियों का सत्यापन। (ग) तनाव 3 की तीन कालोनियों का सत्यापन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 : Rosalind फ्रेंकलिन के खमीर पिक्सेल कला. (ए) एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था कि Rosalind फ्रेंकलिन के 220 डिग्री 280 पिक्सल के काले और सफेद आरजीबी तस्वीर. (ख) Rosalind फ्रेंकलिन के काले और सफेद तस्वीर के कंप्यूटर रूपांतरण एक 4-रंग 64 - 96 पिक्सेल सूची में. (ग) 64 के साथ खमीर पिक्सेल कला की फोटो - 96 खमीर कालोनियों में एक बढ़ी हुई अनुभाग के साथ. (घ) दो पूर्ण विकसित प्लेटों के साथ एक ध्वनिक द्रव हैंडलर की फोटो। (ई) 64 र् 96 खमीर कालोनियों के साथ एक पूर्ण विकसित माइक्रोप्लेट का फोटो। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तनाव 1 तनाव 2 तनाव 3
रंगीन कालोनियों 16 279 220
सफेद कालोनियों 16 18 18
कुल कालोनियों 32 297 238
दक्षता 50% 94% 92%

तालिका 1: मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन दृष्टिकोण की संपादन दक्षता।

CRRNA सरणी अनुक्रमएक, बी, सी, डी, ई, एफ
कैटगटगागकागटगटगगगगगटगगटगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगटगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगगग टीसीटीजीएएए
गटागटगटगटगटगगगगगगटककककककताताकागवगवगवगवगकलकगटगटगटटगगटकगटगगटक
TGATTACATTACGTTAGTACTACTACATTAGTagTagTGCCCTCTTGGCGCGGTATAGGCA
TTTTCACACCCAATGTGTGTTTCAAAAAGATTTTCAAACGGTGTGAGATGGTGC
ATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCCGCAGTAGAGATATATAATACTACTAGTTAGAT
CTGGTGGGAGAAGCTTATGAAATCTACTAGTTAGTAGTAGTACTAC
जीसीसीसीजीजीसीजीजीएएटीसीटीसीटीकागगटटीजीसीसीसीटीसीटीटीटीटीटीटीटीटीटीटी
TtTTTTTTTTTTGTGTGTGGGGCCGTACCCCTTTGTTGTGTGTGAGG
GTTATCCGAGCTTGGCGTAATCATGTCTGTGTG
a. होमियोलॉजी से pRN1120 (बोल्ड).
b. SNR52 प्रमोटर (इटेलिक्स).
c. जीनोमिक लक्ष्य अनुक्रम (अंडरलाइन्ड)।
घ. गाइड प्रत्यक्ष LbCas12a (इटेलिक्स, बोल्ड) के लिए विशिष्ट दोहराता है।
e. SUP4 टर्मिनेटर (इटेलिक्स).
च. होमियोलॉजी से pRN1120 (बोल्ड).

अनुपूरक तालिका 1: LbCas12a के लिए एकल crRNA सरणी प्लाज्मिड pRN1120 के साथ होमोलोजी युक्त.

नाम अनुक्रमA विवरणb बिंदु में प्रयुक्त
के.सी.-101 कैटगटगागसीटीकैटसी एकल CRRNA सरणी के प्रवर्धन के लिए FW प्राइमर 2.1.4
के.सी.-102 CACACAAACAGATGAC एकल crRNA सरणी के प्रवर्धन के लिए आर.वी. 2.1.4
के.सी.-103 AAGCGACTCATCGCTTGC संबंधक के साथ दाता डीएनए के प्रवर्धन के लिए FW प्राइमर 5 3.6.1
के.सी.-104 AAAGCAAGGAGAGAC संबंधक ए के साथ दाता डीएनए के प्रवर्धन के लिए आर.वी. 3.6.1
के.सी.-105 CGGATGATGATTACACAACCG संबंधक बी के साथ दाता डीएनए के प्रवर्धन के लिए FW प्राइमर 3.6.1
के.सी.-106 CAACAGGCGGATATAC संबंधक सी के साथ दाता डीएनए के प्रवर्धन के लिए आर.वी. 3.6.1
के.सी.-107 AACGTTGTCCAGGTGTATCC संबंधक डी के साथ दाता डीएनए के प्रवर्धन के लिए FW प्राइमर 3.6.1
के.सी.-108 AGGTACAAGCACACCG संबंधक ई के साथ दाता डीएनए के प्रवर्धन के लिए आर.वी. 3.6.1
के.सी.-109 CACTATAGCAATCTGCTATG संबंधक 5 के साथ INT1 5' के प्रवर्धन के लिए FW प्राइमर 4.4
के.सी.-110 AAACGCCTGTGGGTGTGGGTTACTAC
TGGATGCAAAGCGATGGAA
जी.टी.सी.सी.टी.टी.टी.सी.टी.सी.सी.सी.सी.टी.
एटीटीसीसी		 कनेक्टर 5 के साथ INT1 5' के प्रवर्धन के लिए RV प्राइमर 4.4
के.सी.-111 TTGCCCATCGACGTACAAG
TACTCCTGTCTCTCCCTCTTTT
TGCTTTAAGCGTTGAGTTC
टीटीजी		 कनेक्टर ए के साथ INT1 3' के प्रवर्धन के लिए FW प्राइमर 4.4
के.सी.-112 टीजीटीसीएएक्टजीजीसी.सी.टी.सी. कनेक्टर ए के साथ INT1 3' के प्रवर्धन के लिए RV प्राइमर 4.4
के.सी.-113 AGAAGATCTCCTCAATCTC संबंधक बी के साथ INT2 5' के प्रवर्धन के लिए FW प्राइमर 4.4
के.सी.-114 TGCTAAGATGTGTTCGTTT
TGGGGCAGTCGGTTGTGTACAT
CGATCCGCCCTATCAAGGATAC
टीजीजीटीटीजी		 कनेक्टर बी के साथ INT2 5' के प्रवर्धन के लिए RV प्राइमर 4.4
के.सी.-115 ACGCTCCCGCTCTCCA
GACCACAGATATCCCCT
सीसीटीव्हीटीजींगच्याजागा
जी.टी.जी.		 कनेक्टर सी के साथ INT2 3' के प्रवर्धन के लिए FW प्राइमर 4.4
के.सी.-116 टीसीसीटीसीटीसीटीजीएसीजीजीजी कनेक्टर सी के साथ INT2 3' के प्रवर्धन के लिए RV प्राइमर 4.4
के.सी.-117 जीजीटीसीटीजीटीजीजीसीएजीकाटीटीजी कनेक्टर डी के साथ INT3 5' के प्रवर्धन के लिए FW प्राइमर 4.4
के.सी.-118 जीसीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजीजी
ACACACGTGANGAAACCTG
GACAACGTTटीसीएएजीजीजी
AAGAACG		 कनेक्टर डी के साथ INT3 5' के प्रवर्धन के लिए RV प्राइमर 4.4
के.सी.-119 AAATAACAACACCCTT
सीसीसीएटीजीसीटीसीजीजीजीजीजीजीटीजीसीटीटीटीटी
जी.टी.सी.टी.गटगागगगगगगगगक
जीटीएसी		 कनेक्टर ई के साथ INT3 3' के प्रवर्धन के लिए FW प्राइमर 4.4
के.सी.-120 GAGCTTACTATATCATTC कनेक्टर ई के साथ INT3 3' के प्रवर्धन के लिए RV प्राइमर 4.4
के.सी.-121 GTTACTAACTGGAACTGTCCG FW प्राइमर con5-crtE-conA के एकीकरण के सत्यापन के लिए INT1 5' 7.4.1
के.सी.-122 CACTGCTAACTACGTACTTC FW प्राइमर con5-crtE-conA के एकीकरण के सत्यापन के लिए INT1 3' 7.4.1
के.सी.-123 CACTGGAACTGAGCTGAG FW प्राइमर CONB-crtYB-conC के एकीकरण के सत्यापन के लिए INT2 5' 7.4.1
के.सी.-124 जी.टी.सी.सी.सी.टी.जी.टी.जी.टी.टी.सी. FW प्राइमर CONB-crtYB-conC के एकीकरण के सत्यापन के लिए INT2 3' 7.4.1
के.सी.-125 सीटीसीटीकागगागकागटीसी FW प्राइमर COND-crtI-conE के एकीकरण के सत्यापन के लिए INT3 5' 7.4.1
के.सी.-126 GATCGGTCAATTAGGTGAAG FW प्राइमर COND-crtI-conE के एकीकरण के सत्यापन के लिए INT3 3' 7.4.1
के.सी.-127 CCTTGTCCAAGTAGGTGTCC RV प्राइमर con5-crtE-conA के एकीकरण के सत्यापन के लिए INT1 5' 7.4.1
के.सी.-128 GCTGTCATGATGTGATGATAAC RV प्राइमर con5-crtE-conA के एकीकरण के सत्यापन के लिए INT1 3' 7.4.1
के.सी.-129 सीटीजीसीएएटीजीटीजीसीएएटीजीसी RV प्राइमर के एकीकरण के सत्यापन के लिए CONB-crtYB-conC करने के लिए INT2 5' 7.4.1
के.सी.-130 CCAACGTGCCTTAAGTG RV प्राइमर के एकीकरण के सत्यापन के लिए CONB-crtYB-conC करने के लिए INT2 3' 7.4.1
के.सी.-131 CCTTACCCTGAGCAG 'INT3 5' को conD-crtI-conE के एकीकरण के सत्यापन के लिए RV प्राइमर 7.4.1
के.सी.-132 CTGGTTTCCTTAAGACTG 'INT3 3' को conD-crtI-conE के एकीकरण के सत्यापन के लिए आर.वी. 7.4.1
ए बोल्ड दृश्यों संबंधक दृश्यों को निरूपित करते हैं।
b. फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर को क्रमशः FW और RV के रूप में नामित किया गया है.

अनुपूरक तालिका 2: प्राइमर अनुक्रम।

Supplementary Table 3
अनुपूरक तालिका 3: निर्मित उपभेदों का डिजाइन।

Supplementary Table 4
अनुपूरक तालिका 4: दाता डीएनए अभिव्यक्ति कैसेट और flaking क्षेत्रों के अनुक्रम. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

प्रदान किए गए प्रोटोकॉल में एक crRNA सरणी और दाता डीएनए के संयोजन में Lachnospiraceae जीवाणु ND2006 से Cas12a का उपयोग कर एस cerevisiae के मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन का वर्णन करता है। एकल crRNA सरणी और दाता डीएनए के डिजाइन विस्तार से समझाया गया है. सुस्थापित CRISPR/Cas9 प्रणाली के विपरीत, CRISPR/Cas12a एक एकल crRNA सरणी13,33से व्यक्त कई CRRNAs प्रसंस्करण की अद्वितीय अतिरिक्त क्षमता है. इस सुविधा के कारण, कई लक्ष्यों का एक साथ संपादन स्थापित करने के लिए आसान है और एक ही परिवर्तन में प्राप्त किया जा सकता है. इस एकल crRNA सरणी दृष्टिकोण से पहले ज़ेत्शे एट अलद्वारा प्रदर्शन किया गया था . 34 जो एक साथ AsCas12a का उपयोग कर स्तनधारी कोशिकाओं में चार जीन को संपादित, और Swiat एट अलद्वारा . 35 जो एक खमीर जीनोम में चार डीएनए टुकड़े FnCas12a का उपयोग शुरू की. हमारे ज्ञान के लिए, एक Cas12a प्रणाली का उपयोग कर एक साथ जीनोमिक संशोधनों की एक उच्च संख्या की सूचना नहीं दी गई है और Cas12a के लिए एक सरणी प्रति लक्ष्यों की अधिकतम सीमा अभी तक निर्धारित किया जाना है. इसके अलावा , कास12क के संयोजन में एकल सीआरआरएनए सरणियों काउपयोग करने वाले शोध में अनेक जीवों की विस्तृत श्रृंखला में बहुसंकेत प्रतिलेखनीय विनियमन 33 ,36,37शामिल हैं .

प्रस्तुत प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण चरण हैं। ध्यान से सभी डीएनए दृश्यों कि Cas12a जीनोम संपादन प्रयोग में शामिल हैं डिजाइन, विशेष रूप से मामले में जब उपन्यास डीएनए दृश्यों शुरू कर रहे हैं. एक crRNA के नए स्पेसर दृश्यों भाग की कार्यक्षमता का निर्धारण, उदाहरण के लिए एक एकल plex जीनोम संपादन प्रयोग द्वारा के रूप में Verwaal एट अलद्वारा वर्णित. 19 उन्हें एक एकल crRNA सरणी में संयोजन से पहले. खमीर का एक अच्छा परिवर्तन दक्षता प्राप्त करने के लिए Cas12a संपादन प्रयोग में इस्तेमाल परिवर्तन बफर समाधान की तैयारी के लिए सिफारिशों का पालन करें.

तकनीक के कुछ वैकल्पिक संशोधन कर रहे हैं. यह एक कम डीएनए राशि का उपयोग भी एक संतोषजनक परिवर्तन दक्षता में परिणाम की उम्मीद है, हालांकि परिवर्तन में प्रत्येक दाता डीएनए, linearized pRN1120 या एकल crRNA सरणी अभिव्यक्ति कैसेट का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. कम डीएनए मात्रा का उपयोग किया जा सकता है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए एक परीक्षण रूपांतरण निष्पादित करें। S. cerevisiae का रूपांतरण इस प्रोटोकॉल में वर्णित एक से एक अलग विधि का उपयोग कर के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए Gietz एट अल द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल. (2007) 38. गाइड आरएनए प्राप्तकर्ता प्लाज्मिड PRN1120 विभिन्न Cas12a वेरिएंट के एक crRNA और एकल crRNA सरणी की अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त है (उदाहरणके लिए , Acidaminococcus spp से. BV3L6 या फ्रांसिसेला novicida U112) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Cas919के साथ संयोजन में sgRNA की अभिव्यक्ति के लिए . दाता डीएनए carotenoid जीन अभिव्यक्ति कैसेट और क्षेत्र ों कि वर्णित INT1, INT2 और जीनोमिक डीएनए में INT3 साइटों के लिए दाता डीएनए लक्ष्य flanking तक सीमित होने की जरूरत नहीं है. ब्याज का कोई भी डीएनए, एक मल्टीप्लेक्स तरीके से, इस प्रोटोकॉल में वर्णित डिजाइन सिद्धांतों द्वारा मेजबान के जीनोमिक डीएनए में पेश किया जा सकता है, या वैकल्पिक रूप से दाता डीएनए एक मेजबान जीनोम से डीएनए को नष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एकल CRRNA सरणी की मॉड्यूलर संरचना स्पेसर और प्रत्यक्ष दोहराने दृश्यों के आसान समायोजन की सुविधा. स्पेसर दृश्यों के संशोधन इच्छित एकीकरण टिड्डी जो एक जीनोमिक लक्ष्य साइट की पहचान के लिए उपकरणों में से एक द्वारा डिजाइन किया जा सकता है के परिवर्तन के लिए अनुमति देता है, उदाहरण के लिए GuideScan सॉफ्टवेयर 1.039. कनेक्टर्स दृश्यों होते हैं कि बड़े flanking दृश्यों का उपयोग करने के बजाय, पीसीआर में इस्तेमाल प्राइमर में इन 50-बीपी flanking क्षेत्र दृश्यों को शामिल करके दाता डीएनए दृश्यों में शामिल किया जा सकता है। इस मामले में, नौ दाता डीएनए टुकड़े के बजाय कुल सिर्फ तीन में एक सफल मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन प्रयोग के लिए आवश्यक हैं.

सारांश में, यह प्रोटोकॉल S. cerevisiae में एक एकल crRNA सरणी दृष्टिकोण के साथ संयोजन में Cas12a का उपयोग कर मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन करने के लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान करता है। प्रोटोकॉल मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन द्वारा 9 दाता डीएनए टुकड़े और तीन gRNAs के लिए एकल crRNA सरणी कोडिंग का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था. हम तीन तनाव डिजाइन यहाँ की सूचना के लिए 50% और 94% के बीच उच्च समग्र संपादन आवृत्तियों दिखा. समापन, Cas12a की अनूठी विशेषता के लिए एक सेल में अलग-अलग crRNAs में एक एकल crRNA सरणी प्रक्रिया की क्षमता है, जो Cas12a मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन सक्षम करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण बनाता है और प्रतिलिपि विनियमन मॉड्यूल विकसित करने के लिए कई लक्ष्यीकरण अभिव्यक्ति कैसेट एक ही बार में. अंत में, तीन उपभेदों एक अलग स्तर पर कैरोटीनोइड और पीले और नारंगी के बीच रंगों में रंग का उत्पादन प्राप्त किया गया. उन उपभेदों और एक जंगली प्रकार तनाव के साथ, हम कैसे एक ध्वनिक तरल हैंडलर सीधे खमीर पिक्सेल कला बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है दिखाया - Rosalind फ्रेंकलिन के सम्मान में यह जो डीएनए संरचना की खोज में योगदान दिया 65 साल पहले उसे प्रसिद्ध तस्वीर 5123 द्वारा /c1].

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का टकराव है। लेखकों प्रस्तुत तरीकों से संबंधित आईपी दायर किया है.

Acknowledgments

इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से अनुदान समझौते संख्या 686070 (डीडी-डीसीएएफ) और 764591 (SynCrop) के तहत और परियोजना संख्या 737.016.005 के साथ जीवन के अनुसंधान कार्यक्रम बिल्डिंग ब्लॉक से धन प्राप्त हुआ। नीदरलैंड आर्गेनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (एनडब्ल्यूओ)। T.E.G. रॉयल सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान UF160357) और BrisSynBio, एक BBSRC/EPSRC सिंथेटिक जीव विज्ञान अनुसंधान केंद्र (अनुदान BB/ खमीर पिक्सेल कला बनाने के लिए खमीर खोलना प्रयोगों के लिए उनके योगदान के लिए हम ज़ी डि और Jeffrey वैन Wizk धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals specific for the protocol
1 Kb Plus DNA Ladder Thermo Fisher Scientific 10787018 Electrophoresis
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518 Selection of E. coli transformants
BsaI-HF (20 U/µl) New England BioLabs R353L Golden Gate Cloning
Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) QIAGEN 854016 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
CutSmart Buffer New England BioLabs B7204S Linearization of pRN1120
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes Sigma Aldrich D1626 Transfromation of
S. cerevisiae (carrier DNA)
dNTPs Invitrogen 10297018 PCRs
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S Linearization of pRN1120
Ethanol absolute for analysis Merck 100983 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Ethylenediamine-tetraacetic acid Sigma Aldrich ED Transformation of
S. cerevisiae
G418 disulfate salt Sigma Aldrich A1720 Selection of S. cerevisiae transformants
Histodenz Sigma Aldrich D2158  Yeast pixel art
Isopropanol Merck 100993 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Lithium acetate dihydrate Sigma Aldrich L6883 Transformation of
S. cerevisiae
Nancy-520 DNA Gel Stain Sigma Aldrich 1494 Electrophoresis
NEB10 competent E. coli cells New England BioLabs C3019H Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6
Nourseothricin Jena Bioscience AB102 Selection of S. cerevisiae transformants
Phusion buffer New England BioLabs M0530L PCRs
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0530L PCRs
Polyethylene glycol 4000 Merck 7490 Transformation of
S. cerevisiae
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) QIAGEN 854016 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Purple loading dye New England BioLabs B7024S Electrophoresis
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Purification of plasmids
RNase coctail enzyme mix Thermo Fisher Scientific AM2286 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
T4 DNA ligase buffer Invitrogen 46300-018 Golden Gate Cloning
T4 DNA Ligase (1 U/µl) Invitrogen 1705218 Golden Gate Cloning
UltraPure Agarose Invitrogen 16500500 Electrophoresis
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit Promega A9282 Purification of PCR products and linearized pRN1120
Xhol New England BioLabs R0146S Linearization of pRN1120
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL) Zymo Research E1006 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)
Zymolyase storage buffer Zymo Research E1004-B Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)
Chemicals of general use
2*Peptone-Yeast extract (PY) agar Plate growth of E. coli
2*PY medium Cultivation of E. coli
Demineralized water Transformation of
S. cerevisiae
ELFO buffer Electrophoresis
MQ Multiple steps
Physiological salt solution Transformation of
S. cerevisiae
TE buffer Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium Cultivation of S. cerevisiae
YEPD (2% glucose) agar Plate growth of
S. cerevisiae
Consumables
Eppendorf tubes
Falcon tubes (50 mL)
Microplate 96 wells
Petri dishes
Pipette tips 0.5 - 10 µL
Pipette tips 10 - 200 µL
Pipette tips 100 - 1000 µL
Shake flasks (500 mL)
Sterile filters
Equipment
Centrifuge (Falcon tubes)
Echo 525 acoustic liquid handler
Incubator
NanoDrop
Set for eletrophoresis
Spectrophotometer
Table centrifuge (Eppendorfs tubes)
Thermocycler
Plasmids
pCSN067 Addgene ID 101748 https://www.addgene.org/
pRN1120 Addgene ID 101750 https://www.addgene.org/
Strains
S. cerevisiae strain
CEN.PK113-7D		 EUROSCARF collection http://www.euroscarf.de

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knott, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361 (6405), 866-869 (2018).
  2. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  3. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  4. Lian, J., HamediRad, M., Hu, S., Zhao, H. Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system. Nature Communications. 8 (1), 1688 (2017).
  5. Li, Z. -H., Liu, M., Lyu, X. -M., Wang, F. -Q., Wei, D. -Z. CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).
  6. Shao, Y., Lu, N., Qin, Z., Xue, X. CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2706-2708 (2018).
  7. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  8. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  9. Abudayyeh, O. O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), (2016).
  10. Makarova, K. S., et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 13 (11), 722-736 (2015).
  11. Mohanraju, P., et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science. 353 (6299), (2016).
  12. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  13. Fonfara, I., Richter, H., Bratovič, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).
  14. Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601 (2018).
  15. Ferreira, R., et al. Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 7 (1), 10-15 (2018).
  16. Swarts, D. C., Martin, J. Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure–function comparisons and implications for genome editing. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481 (2018).
  17. Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a. Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).
  18. Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
  19. Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).
  20. Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories. Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).
  21. Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS One. 3 (11), 3647 (2008).
  22. Yeast Art project. , Available from: http://www.yeastart.org (2018).
  23. Franklin, R. E., Gosling, R. G. Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature. 171, 740-741 (1953).
  24. Watson, J. D., Crick, F. H. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature. 171, 737-738 (1953).
  25. Wilkins, M. H. F., Stokes, A. R., Wilson, H. R. Molecular structure of deoxypentose nucleic acids. Nature. 171, 738-740 (1953).
  26. Young, E. M., et al. Iterative algorithm-guided design of massive strain libraries, applied to itaconic acid production in yeast. Metabolic Engineering. 48, 33-43 (2018).
  27. Roubos, J. A., Pel, H. J., Meijrink, B. Cloning Method. , WO2013144257 (2013).
  28. Mandel, M., Higa, A. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. Journal of Molecular Biology. 53 (1), 159-162 (1970).
  29. Van Dijken, J. P., et al. An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains. Enzyme and Microbial Technology. 26 (9-10), 706-714 (2000).
  30. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11 (4), 355-360 (1995).
  31. Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E., Donald, G. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Acids Research. 19 (20), 5791 (1991).
  32. Looke, M., Kristjuhan, K., Kristjuhan, A. Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications. Biotechniques. 50 (5), 325-328 (2011).
  33. Tak, Y. E., et al. Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors. Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).
  34. Zetsche, B., et al. Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array. Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).
  35. Swiat, M. A., et al. FnCpf1: a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12585-12598 (2017).
  36. Li, L., et al. CRISPR-Cpf1-Assisted Multiplex Genome Editing and Transcriptional Repression in Streptomyces. Applied Environmental Microbiology. 84 (18), 00827-00918 (2018).
  37. Zhang, X., et al. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell Discovery. 3, 17018 (2017).
  38. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).
  39. Perez, A. R., et al. GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design. Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).
  40. Cox, R. S., et al. Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0. Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 147 CRISPR/Cas12a CRISPR/Cpf1 CRISPR/Cas9 मल्टीप्लेक्स जीनोम संपादन Saccharomyces cerevisiae,खमीर पिक्सेल कला
CRISPR/Cas12a मल्टीप्लेक्स जीनोम <em>संपादन Saccharomyces cerevisiae</em> और खमीर पिक्सेल कला का निर्माण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ciurkot, K., Vonk, B., Gorochowski,… More

Ciurkot, K., Vonk, B., Gorochowski, T. E., Roubos, J. A., Verwaal, R. CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art. J. Vis. Exp. (147), e59350, doi:10.3791/59350 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter