Hög genomströmning dragkraft mikroskopi med PDMS avslöjar dosberoende effekter omvandla tillväxtfaktor-β på epitelial-till-mesenkymala övergång
Summary
Vi presenterar en hög genomströmning dragkraft assay fabricerade med silikon gummi (PDMS). Denna nya analys är lämplig för att studera fysiska förändringar i cell kontraktilitet under olika biologiska och biomedicinska processer och sjukdomar. Vi visar den här metodens nytta genom att mäta en TGF-β beroende ökning i kontraktilitet under epitelial-till-mesenkymala övergången.
Abstract
Cellulär kontraktilitet är viktigt i olika aspekter av biologi, drivande processer som sträcker sig från motilitet och uppdelning, till vävnadkontraktion och mekanisk stabilitet, och utgör en central del av flercelliga djurliv. I anhängare celler, acto-myosin kontraktion ses i dragkrafter som celler utövar på deras substrat. Dysreglering av cellulära kontraktilitet visas i en myriad av patologier, vilket gör kontraktilitet ett lovande mål i olika diagnostiska metoder med hjälp av biofysik som ett mått. Dessutom kan nya terapeutiska strategier baseras på korrigering av skenbara fel i cell kontraktilitet. Dessa tillämpningar kräver dock en direkt kvantifiering av dessa styrkor.
Vi har utvecklat silikon elastomer-baserade Traction Force mikroskopi (TFM) i en parallelliserad multi-well format. Vår användning av ett silikon gummi, speciellt Polydimetylsiloxan (PDMS), snarare än den vanligen använda hydrogel polyakrylamid (PAA) gör det möjligt för oss att göra robusta och inerta substrat med obestämd hylla-liv kräver inga särskilda förvaringsförhållanden. Till skillnad från pelare-PDMS baserade metoder som har en Modulus i GPa-sortimentet, de PDMS som används här är mycket kompatibel, allt från ca 0,4 kPa till 100 kPa. Vi skapar en högpresterande plattform för TFM genom att partitionera dessa stora monolitiska substrat rumsligt i biokemiskt oberoende brunnar, vilket skapar en multi-well plattform för Traction Force screening som är kompatibel med befintliga multi-well system.
I detta manuskript använder vi detta multi-well dragkraft system för att undersöka epitelial till mesenkymala övergång (EMT); Vi inducerar EMT i NMuMG-celler genom att exponera dem för TGF-β och för att kvantifiera de biofysiska förändringarna under EMT. Vi mäter kontraktilitet som en funktion av koncentrationen och varaktigheten av TGF-β exponering. Våra fynd här visar nyttan av parallelliserade TFM i samband med sjukdomsbiofysik.
Introduction
Acto-myosin kontraktilitet är en viktig del av aktiv cellmekanik, vilket påverkar cellernas beteenden från motilitet och proliferation till stamcells differentiering. I vävnader, kontraktilitet driver aktivitet från Polar separation i embryogenes, till luftvägarna sammandragning och hjärtaktivitet. Kritiskt, för att generera spänningar, celler måste först följa deras extracellulära miljö. På så sätt genererar denna kontraktilitet dragkraft krafter på sin omgivning. Traction Force mikroskopi (TFM) har dykt upp i en mängd olika former som ett sätt att kvantifiera dessa styrkor från olika celler under olika förhållanden.
Området TFM har sett en exceptionell bredd av innovation och tillämpning, och resultaten har banat väg för nya perspektiv i biologi, som införlivar mekanik och fysiska krafter. Från och med skrynkling silikon substrat1, forskare har tillämpat olika tekniker för att mäta celler dragkraft. Dessa metoder har kontinuerligt förbättrats och har nu nått en nivå av upplösning på order av flera mikrometer2. Dock har ett huvudproblem uppstått, vilket är svårigheten att skapa substrat av lämpligt låg moduli med hjälp av tillgängliga silikoner. För att kringgå detta problem antogs polyakrylamid som en ersättning på grund av hur lätt det var att skapa substrat på order av 1-20 kPa3. Vi har nyligen genomfört mycket kompatibla silikoner i TFM4, vilket gör att vi kan tillverka samma sortiment av moduli som polyakrylamid, men med fördelarna med inert och robust silikon.
TFM-metoder har möjliggjort värdefulla Mechano-biologiska upptäckter, men en ihållande brist är deras komplexitet, ofta begränsar deras användning till forskare inom teknik eller fysikaliska vetenskaper discipliner. Detta beror till stor del på de detaljerade kalibreringar och utmanande beräkningar som krävs för att kvantifiera kontraktilitet. En annan viktig utmaning är att TFM-metoder är i stort sett låg kapacitet och därför dåligt lämpade för att studera många olika villkor eller populationer samtidigt5. Detta har visat en flaskhals, vilket har hämmat överföringen av TFM från en specialist biofysik inställning till bredare biologiska och farmakologiska tillämpningar.
Vi har nyligen utvecklat en multi-well format TFM plattan, som gör det möjligt för forskare att parallellisera sina TFM mätningar för snabbare kvantifiering av kontraktilitet mätvärden, samtidigt undersöka effekterna av olika föreningar och även använda mindre reagens4 . Denna metod har bred nytta i olika Mekanobiologi studier, från att utvärdera effekterna av föreningar på cellulär aktivitet, att kvantifiera kontraktila förändringar i differentiering eller sjukdom.
Ett område av biomedicinsk forskning som kommer att dra stor nytta av TFM är studiet av hur fysiska signaler påverkar de maligna fenotyperna av cancerceller. Metastaser, ansvarig för 90% av cancerrelaterade dödsfall, kännetecknas av cancerceller lämnar sin ursprungliga tumör plats och kolonisera en sekundär plats. För celler att migrera genom vävnad och passera in och ut ur det vaskulära systemet, de måste radikalt ändra sina former för att pressa igenom dessa fysiska barriärer samtidigt generera betydande krafter för att dra sig längs extracellulära matris eller flytta mellan andra Celler. Dessa krafter överförs till underlaget genom fokala vidhäftning interaktioner2,3, och kan kvantifieras med hjälp av TFM. Medan cancer är biokemiskt exceptionellt varierande, med en expanderande repertoar av kända mutationer och protein förändringar, några vanliga fysiska förändringar har observerats; i en mängd olika cancerformer, inklusive bröst-, prostata-och lungcancer, metastatiska celler har visat sig utöva 2-3 gånger drag krafterna hos icke-metastaserande celler6,7,8. Dessa resultat tyder på att det kan finnas ett starkt samband mellan metastaserande progression och de dragkraft som utövas av celler; emellertid, de detaljerade tidsberoende förändringarna i kontraktilitet är svåra att undersöka.
Den epiteliala-till-mesenkymala övergången (EMT) är en process där celler minskar anhängare-och tätt-korsning medierad cell-cell adhesion, blir mer flyttande och invasiva. Förutom fysiologiska funktioner som inkluderar sårläkning och utvecklingsprocesser, är EMT också en process som utnyttjas under metastaser, vilket gör det till ett användbart modellsystem för att studera denna process. Med hjälp av TGF-β, kan vi inducera EMT i murina bröst epitelceller (NMuMG)9 att direkt kvantifiera de fysiska förändringarna under denna omvandling, och karakterisera tid och dos-beroende effekter av TGF-β på EMT och cell kontraktilitet. I denna artikel, vi visar nyttan av detta tillvägagångssätt genom att mäta förändringar i kontraktilitet under en inducerad EMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att denna metod ska lyckas är det viktigt att ha ett jämnt belagt prov med en konstant tjocklek på cirka 100 μm. Modulus bör noga väljas för att undersöka den fysiska betydelsen av det biologiska systemet av intresse. När fabricera ett toppskikt, koncentrationen av relaterat fluorescerande partiklar bör optimeras för noggrann analys av förskjutning och dragkraft stress. Analysera isolerade enskilda celler kräver en tätare förvaltnings skikt än att mäta konfluenta monolayers. Dessutom bör ytan av un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar tom Kodger, Michael Landry, och Christopher J. Barrett för hjälp med Bead syntes. A.J.E. erkänner naturvetenskap och teknik Forskningsrådet beviljar RGPIN/05843-2014 och EQPEQ/472339-2015, kanadensiska institut för hälsoforskning Grant nr 143327, Canadian Cancer Society Grant nr 703930, och kanadensiska Stiftelsen för innovation Projekt #32749. R. Ulrica erkänner National Institutes of Health Grant No. R21HL123522 och R01HL136209. H.Y. stöddes av fonds de Recherche Santé Québec, och fonds de Recherche Nature et Technologies Québec. Författarna tackar Johanan Idicula för hjälp med video och manuskript och Zixin han för hjälp med att förbereda videon.
Materials
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP | |
References
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. Traction forces in locomoting cells. Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells. Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).
- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
