Summary
इस प्रोटोकॉल कैसे छवि जीने के लिए प्रस्तुत करता है और अलग संयंत्र प्रजातियों में से गोली मार शीर्ष meristems लेजर स्कैनिंग संनाभि माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर विश्लेषण ।
Abstract
गोली मार के रूप में एक संरक्षित स्टेम सेल जलाशय के रूप में कार्य करता है और यह लगभग सभी अबोवभूमि ऊतक postembryonic विकास के दौरान बनाता है । sams की गतिविधि और आकारिकी महत्वपूर्ण कृषि लक्षण, जैसे शूट वास्तुकला, आकार और प्रजनन अंगों की संख्या, और सबसे महत्वपूर्ण बात, अनाज उपज निर्धारित करते हैं । यहां, हम लेजर स्कैनिंग संनाभि माइक्रोस्कोप के माध्यम से विभिन्न प्रजातियों से रहने वाले sams की सतह आकारिकी और आंतरिक सेलुलर संरचना दोनों का विश्लेषण करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । नमूना तैयार करने से उच्च संकल्प तीन आयामी (3 डी) छवियों के अधिग्रहण के लिए पूरी प्रक्रिया के भीतर 20 मिनट के रूप में कम के रूप में पूरा किया जा सकता है । हम दर्शाते है कि इस प्रोटोकॉल का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक कुशल है न केवल पुष्पक्रम SAMs मॉडल प्रजातियों पर भी विभिंन फसलों से वनस्पति meristems, एक सरल लेकिन शक्तिशाली उपकरण प्रदान करने के लिए अध्ययन के संगठन और विकास के विभिंन प्रजातियों के पौधों में meristems ।
Introduction
संयंत्र विभज्योतक अविभेदित स्टेम कोशिकाओं का एक पूल शामिल है और लगातार संयंत्र अंग विकास और विकास1। postembryonic विकास के दौरान, लगभग सभी एक संयंत्र के aboveground ऊतकों गोली मार के ऊपर विभज्योतक (सैम) से प्राप्त कर रहे हैं । फसलों में, गतिविधि और सैम और इसके व्युत्पंन पुष्प meristems के आकार के कसकर ऐसे शूट वास्तुकला, फल उत्पादन, और बीज उपज के रूप में कई कृषि लक्षण के साथ जुड़े रहे हैं । उदाहरण के लिए, टमाटर में, एक बढ़े हुए सैम गोली और पुष्पक्रम बंटी में वृद्धि का कारण बनता है, और इस प्रकार अतिरिक्त फूल और फल अंगों पैदा करने में परिणाम2। मक्का में, सैम के आकार में वृद्धि एक उच्च बीज संख्या और कुल उपज3,4की ओर जाता है । सोयाबीन में, विभज्योतक अनिर्धारता भी बारीकी से शूट वास्तुकला और उपज5के साथ जुड़ा हुआ है ।
आकृति विज्ञान और sams के एनाटॉमी कई विभिंन विधियों द्वारा विशेषता हो सकता है, ऊतकीय sectioning सहित/धुंधला और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM)6, दोनों जिनमें से बहुत विभज्योतक अनुसंधान के माध्यम से उंनत किया है प्रदान या तो सेक्शनल दृश्य या SAMs का त्रि-आयामी (3D) पृष्ठ दृश्य । हालांकि, दोनों तरीकों समय लगता है, डेटा अधिग्रहण करने के लिए नमूना तैयार करने से कई प्रयोगात्मक कदम शामिल है, और इन विधियों मुख्य रूप से तय नमूनों पर निर्भर करते हैं । लेजर स्कैनिंग संनाभि माइक्रोस्कोपी तकनीक में हाल के अग्रिमों इन सीमाओं को दूर किया है और हमें एक शक्तिशाली उपकरण के साथ सेलुलर संरचना और संयंत्र के ऊतकों और अंगों के विकास की प्रक्रिया की जांच करने के लिए प्रदान7,8. भौतिक ऊतक sectioning के बजाय ऑप्टिकल के माध्यम से, संनाभि माइक्रोस्कोपी जेड की एक श्रृंखला के संग्रह की अनुमति देता है ढेर छवियों और बाद में छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के माध्यम से नमूना के 3 डी पुनर्निर्माण ।
यहां, हम दोनों के अंदर और विभिंन प्रजातियों के पौधों से रहने sams की सतह संरचनाओं की जांच के लिए एक कुशल प्रक्रिया का वर्णन लेजर स्कैनिंग संनाभि माइक्रोस्कोपी, जो संभवतः शोधकर्ताओं ने सभी प्रायोगिक पूरा करने के लिए अनुमति देता है 20 मिनट के रूप में कम के रूप में प्रक्रिया । अरेबिडाप्सिस फूलना sams9,10,11,12,13,14, की लाइव संनाभि इमेजिंग के लिए अन्य प्रकाशित विधियों से अलग 15 और arabidopsis फूल12,13, यहां हम दर्शाते है कि इस प्रोटोकॉल का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक कुशल है न केवल पुष्पक्रम meristems मॉडल प्रजातियों पर भी वनस्पति शूट टमाटर और सोयाबीन के रूप में विभिन्न फसलों से, शीर्ष meristems. इस विधि ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट मार्कर पर भरोसा नहीं है, और संभवतः कई विभिंन प्रजातियों और किस्मों से शूट meristems का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, हम भी देखने और एक 3 डी दृश्य में अलग SAMs का विश्लेषण करने के लिए सरल छवि प्रसंस्करण कदम परिचय । एक साथ लिया, इस सरल विधि शोधकर्ताओं बेहतर दोनों मॉडल जीवों और फसलों से meristems की संरचना और विकास की प्रक्रिया को समझने की सुविधा होगी ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. मीडिया और इमेजिंग व्यंजन तैयारी
- एमएस प्लेटें: जोड़ें 0.5 x मुराशिगे & skoog एमएस मध्यम, 1% विआयनीकृत पानी में आगर और फिर ५.८ को पीएच समायोजित पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड समाधान का उपयोग (वैकल्पिक: लंबी अवधि के संयंत्र बढ़ के लिए 1% सुक्रोज जोड़ें) । ऑटोक्लेव और प्लेटें डालो ।
- इमेजिंग व्यंजन: प्लास्टिक पेट्री व्यंजन भरें (6 सेमी चौड़ा, १.५ सेमी गहराई) १.५% पिघला हुआ agarose के साथ 0.5-0.8 सेमी करने के लिए ।
2. पादप वृद्धि
-
अरेबोडाप्सिस वृद्धि
- दो दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के तहत एमएस प्लेटों और प्लेस प्लेटों पर बीज निष्फल । फिर, दो सप्ताह के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर, एक छोटे दिन के लिए एमएस प्लेटें (8 ज लाइट/
- मिट्टी के लिए पौध प्रत्यारोपण और एक छोटे से दिन में उन्हें विकसित (8 ज लाइट/16 एच अंधेरे) चार सप्ताह के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर.
- पौधों को निरंतर प्रकाश में स्थानांतरित करें, 22 ° c पर वनस्पति से प्रजनन चरण में संक्रमण को प्रेरित करने के लिए और पुष्पक्रम SAMs इमेजिंग के लिए ।
- टमाटर और सोयाबीन की ग्रोथ
- वे अंकुरित होने तक 28 डिग्री सेल्सियस के तहत गीले फिल्टर पेपर के साथ कवर बीज सेते ।
- मिट्टी के लिए अंकुर प्रत्यारोपण और एक सप्ताह के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर एक लंबे दिन (16 एच लाइट/8 एच डार्क) में उन्हें विकसित करने के लिए या अधिक वनस्पति SAMs इमेजिंग के लिए.
3. शूट एपेक्स का विच्छेदन
- पुष्पक्रम-दागने शीर्ष का विच्छेदन
- एक रेडर ब्लेड के साथ बोटेड Arabidopsis पौधों से 1-2 सेमी मुख्य स्टेम के साथ एक साथ पुष्पक्रम गोली मार सुप्रीम कट । मुख्य स्टेम के बेसल भाग को पकड़ो और बाहर गहने forceps के साथ peduncles विदारक द्वारा मुख्य स्टेम से संभव के रूप में कई पुराने फूल अंगों को हटा दें ।
चेतावनी: एक रेगर ब्लेड का उपयोग करते समय उंगलियों को काटने से बचें । एक उचित sharps कंटेनर के लिए इस्तेमाल किया रेवर ब्लेड के निपटान । - स्टीरियोमिकरोस्कोप के क्षेत्र में गहने संदंश या उंगलियों के साथ शूट एपेक्स के संलग्न स्टेम पकड़ो, लगभग पूरे सैम eyepieces से देखा जा सकता है जब तक बाकी फूलों को हटाने जारी है । मुख्य स्टेम के जंक्शन पर स्पष्ट रूप से पेडुकल्स निकालें ।
- एक रेडर ब्लेड के साथ बोटेड Arabidopsis पौधों से 1-2 सेमी मुख्य स्टेम के साथ एक साथ पुष्पक्रम गोली मार सुप्रीम कट । मुख्य स्टेम के बेसल भाग को पकड़ो और बाहर गहने forceps के साथ peduncles विदारक द्वारा मुख्य स्टेम से संभव के रूप में कई पुराने फूल अंगों को हटा दें ।
- वनस्पति शूट एपेक्स का विच्छेदन
- या तो टमाटर या सोयाबीन से वनस्पति SAMs देखने के लिए, बाहर cotyledons, पत्तियों, और पौधों से जड़ों काटना ।
- stereomicroscope के तहत पौधों की hypocotyls पकड़ो और आगे पत्ती primordia गहने संदंश का उपयोग कर वनस्पति SAMs को कवर बाहर काटना ।
4. धुंधला करना
- SAMs में कोशिकाओं को सीधे कल्पना करने के लिए, सेल दीवारों दाग करने के लिए हौसले से तैयार propidium आयोडाइड (पीआई) समाधान का उपयोग करें । बाँझ, विआयनित पानी में PI पाउडर भंग, 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर की एकाग्रता पर 1mL PI धुंधला समाधान बनाने के लिए और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर microcentrifuge ट्यूब में PI समाधान की दुकान ।
- एक साफ और खाली पेट्री डिश में पिपेट ५० μL PI समाधान और 2 मिनट के लिए डाई में पूरे विच्छेदक गोली मार शीर्ष डुबकी । दाग दागने के लिए दो बार बाँझ, विआयनित पानी में धो लें । धुंधला करने की प्रक्रिया के दौरान, एक समान धुंधला प्राप्त करने के लिए पूरे पुष्पक्रम सैम या वनस्पति सैम समाधान PI में विसर्जित कर दिया ।
5. छवि संग्रह
नोट: इस विधि के लिए, सभी sams एक ईमानदार संनाभि माइक्रोस्कोप का उपयोग कर और एक 20x पानी की सूई लेंस के साथ imaged रहे हैं । के रूप में अंय9,12,13,15प्रोटोकॉल में वर्णित है, यह भी एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि sams के लिए व्यवहार्य है । इसके अलावा, लाइव इमेजिंग संनाभि सूक्ष्मदर्शी के विभिंन ब्रांडों का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, एक ही नमूना तैयारी के कदम के साथ । इस अध्ययन में, इमेजिंग कदम एक उदाहरण के रूप में विस्तार से वर्णित हैं ।
- पियर्स एक इमेजिंग डिश के केंद्र में एक छेद संदंश का उपयोग कर और दाग गोली मार शीर्ष मध्यम में ईमानदार छड़ी ।
- पूरी तरह से नमूना विसर्जित करने के लिए बाँझ, विआयनीकृत पानी के साथ इमेजिंग डिश भरें । स्टीरियो माइक्रोस्कोप से देखने, ऊपर और नीचे पिपेट हवा meristem चारों ओर फंस बुलबुले को हटाने के लिए । फिर, यह सुनिश्चित करने के लिए कि सैम सीधे ऊपर से पूरी तरह से दिखाई दे रहा है, आगर में तने के कोण को समायोजित करें ।
- संनाभि सूक्ष्मदर्शी के प्रतिदर्श स्तर पर इमेजिंग डिश को रखें । कम पानी की सूई लेंस और पानी में लेंस डुबकी की नोक जाने के लिए माइक्रोस्कोप नमूना चरण बढ़ा ।
- संनाभि माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर खोलें और eyepieces में brightfield में सैम का पता लगाने । XY नियंत्रक का समायोजन के माध्यम से सही उद्देश्य लेंस के नीचे सैम नमूना ले जाएं, तो सावधानी से जेड नियंत्रक समायोजन के माध्यम से eyepieces से सैम पर ध्यान केंद्रित ।
- संनाभि माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में अधिग्रहण समारोह संचालित ( सामग्री की मेजदेखें), कंप्यूटर स्क्रीन से नमूना देखने के लिए लाइव मोड शुरू, और लेजर स्कैनिंग प्रयोग के लिए सभी मापदंडों की स्थापना की ।
- पैरामीटर समायोजित करते समय, यह परिभाषित करने के लिए कि सिग्नल संतृप्त है या नहीं, श्रेणी संकेतक फ़ंक्शन का उपयोग करें ।
- वैकल्पिक रूप से, चयनित संनाभि फ़ाइल से सभी पैरामीटर सेटिंग्स पुनः लोड करने के लिए पुन: उपयोग फ़ंक्शन लागू करें ।
नोट: सुझाया इमेजिंग पैरामीटर: लेजर लाइन (उत्तेजन): ५१५ एनएम या ५६१ एनएम; उत्सर्जन 570-650 एनएम; पिनहोल: 1 हवादार इकाई (AU); लाभ: 600-750, मोड स्कैन: फ़्रेम; फ़्रेम का आकार: या तो ५१२ X ५१२ या १०२४ X १०२४; स्कैनिंग स्पीड: से 7 अधिकतम करने के लिए; स्कैनिंग दिशा: द्वि-दिशा; औसत संख्या: 2-4; औसत विधि: माध्य; बिट गहराई: 16 बिट; स्कैनिंग अंतराल: 0.5-1 μM. इसके अलावा, विभिंन संयंत्र नमूनों की प्रकृति और विशिष्ट इमेजिंग जरूरतों के आधार पर इन सभी मापदंडों का अनुकूलन ।
6. छवि प्रसंस्करण
- ऑप्टिकल लांबिक और अनुप्रस्थ अनुभाग दृश्यों visualizing के लिए, इमेजिंग प्राप्ति के लिए एक ही व्यावसायिक सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें । मूल संनाभि फ़ाइल खोलें, ऑर्थो मेनू क्लिक करें, ऑर्थो चुनें । फिर x स्थिति, y स्थिति और छवि की z स्थिति का चयन करें, और tiff फ़ाइलों के रूप में छवियों को सहेजें ।
- वैकल्पिक रूप से 3 डी दूरी समारोह का चयन दो बिंदुओं कि संनाभि छवियों के ढेर से चुना गया है के बीच शारीरिक दूरी को परिभाषित करने के लिए ।
- वैकल्पिक रूप से, लांबिक और अनुप्रस्थ अनुभाग दृश्यों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए फिजी/छवि J, ओपन रिसोर्स इमेज प्रोसेसिंग पैकेज का उपयोग करें ।
- मूल संनाभि फ़ाइल को फिजी के साथ खोलें, छवि मेनू क्लिक करें, स्टैक चुनें और फिर लंबकोणीय दृश्यचुनें.
- XY, YZ, और मध्य स्थिति में Xz विमानों का चयन करें और Tiff स्वरूप छवियों के रूप में सहेजें ।
- एक 3 डी पारदर्शी प्रक्षेपण visualizing के लिए, एक ही सॉफ्टवेयर का उपयोग करें ।
- मूल संनाभि फ़ाइल खोलें, 3d मेनूपर क्लिक करें, और एक 3d प्रोजेक्शन दृश्य जेनरेट करने के लिए पारदर्शी चुनें.
- वैकल्पिक रूप से 3 डी मेनूक्लिक करें, प्रकटनका चयन, और फिर 3 डी की पारदर्शिता के लिए दहलीज, रैंप और अधिकतम सहित प्रक्षेपण के तीन मापदंडों को समायोजित करने के लिए पारदर्शिता का चयन करें छवि.
- 3d मेनूपर क्लिक करें, प्रकटन चुनें और 3d छवि की चमक समायोजित करने के लिए लाइट चुनें.
- अनुमानित छवियां निर्यात करें और उंहें Tiff फ़ाइलों के रूप में सहेजें ।
- एक 3 डी अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण visualizing के लिए, एक ही सॉफ्टवेयर के साथ संनाभि फ़ाइलों को खोलने के लिए, और 3 डी मेनूपर क्लिक करें.
- 3d मेनू का चयन करें और अधिकतमचुनें.
- वैकल्पिक रूप से, एक 3 डी अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण कल्पना करने के लिए फिजी/
- मूल संनाभि फ़ाइल फिजी के साथ खोलें, छवि मेनू पर क्लिक करें और स्टैकचुनें ।
- 3d प्रोजेक्ट का चयन करें और Tiff स्वरूप छवियों के रूप में सहेजें ।
- 3 डी छवियों को देखने की गहराई कोडन visualizing के लिए, एक ही सॉफ्टवेयर का उपयोग करें ।
- 3d मेनू क्लिक करें और प्रकटनचुनें ।
- विशेष का चयन करें और गहराई कोडिंगका चयन करें ।
- वैकल्पिक रूप से, का उपयोग करें फिजी/छवि जंमू गहराई कोडिंग दृश्य कल्पना करने के लिए ।
- संनाभि फ़ाइलों को खोलें, छवि मेनूपर क्लिक करें, हाइपरस्टैकचुनें.
- लौकिक रंग कोड का चयन करें और Tiff स्वरूप छवियों के रूप में सहेजें ।
नोट: गहराई कोडन z-stack भी प्लगइन जेड कोड के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है फिजी के लिए ढेर ।
- के रूप में दिखाया (मूवी 1 और मूवी 2) 3 डी रोटेशन दृश्य visualizing के लिए, एक ही सॉफ्टवेयर का उपयोग करें ( सामग्री की मेजदेखें) ।
- संनाभि फ़ाइलें खोलें, 3d मेनूपर क्लिक करें और श्रृंखलाचुनें.
- श्रृंखला रैंडरका चयन करें, और चार विकल्पों में से एक का चयन करें सहित चारों ओर बारी x, y, प्रारंभ और अंतके आसपास बारी, और स्थिति सूची।
- रेंडर श्रृंखला AVI फ़ाइलों के रूप में सहेजें ।
- वैकल्पिक रूप से, 3 डी रोटेशन दृश्य को विज़ुअलाइज़ करने के लिए फिजी/
- मूल संनाभि फ़ाइल को फिजी के साथ खोलें, छवि मेनूक्लिक करें, और स्टैकचुनें ।
- 3d प्रोजेक्ट का चयन करें और AVI स्वरूप वीडियो के रूप में सहेजें ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
हमारे प्रोटोकॉल की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए और विभिन्न प्रजातियों से meristems के आकारिकी का पता लगाने के लिए, हम arabidopsis से पुष्पक्रम meristems पर संनाभि लाइव इमेजिंग प्रयोगों और वनस्पति meristems से प्रदर्शन किया है टमाटर और सोयाबीन दोनों । इस अध्ययन में, अरेमिडाप्सिस इकोटाइप लैंडस्बर्ग इरेटा, टमाटर कल्टर माइक्रो-टॉम और सोयाबीन कल्टर विलियम्स ८२ को उदाहरण के तौर पर इस्तेमाल किया गया है ।
arabidopsis सैम के बीच के माध्यम से लांबिक अनुभाग से देखा, यह स्पष्ट है कि PI लगभग सभी कोशिकाओं से कई सेल परतों पर क्षैतिज दीवारों दाग करने में सक्षम था (चित्रा 1a) । पुष्पक्रम सैम के कोष के माध्यम से एक अनुप्रस्थ अनुभाग से दिखाया गया है, XY विमान से कोशिकाओं को भी स्पष्ट रूप से imaged (चित्र 1b) । 3 डी प्रक्षेपण दृश्य में, पुष्पक्रम विभज्योतक एक गुंबद की तरह संरचना रूपों और विकासशील फूल primordia, जहां कोशिकाओं को भी दाग और imaged से घिरा हुआ है (चित्रा 1 सी-डी) (मूवी 1) ।
टमाटर सैम के बीच के माध्यम से लांबिक अनुभाग से देखा गया, यह स्पष्ट है कि pi एकाधिक सेल परतों पर कोशिकाओं से क्षैतिज दीवारों दाग में सक्षम था, हालांकि गहरी आंतरिक क्षेत्र से pi संकेत थोड़ा कम है । वनस्पति सैम की गहरी परतों के माध्यम से एक अनुप्रस्थ अनुभाग से, XY विमानों से कोशिकाओं को भी स्पष्ट रूप से imaged रहे हैं, और वनस्पति विभज्योतक और पत्ती primordia के बीच गठित सीमा भी imaged है (चित्रा 2b) । 3 डी परियोजना को देखने और आकार और टमाटर से वनस्पति विभज्योतक के संगठन के एक व्यापक दृश्य प्रदान कर सकते है (चित्र 2c डी) (2 मूवी) ।
सोयाबीन सैम के बीच के माध्यम से लांबिक देखने में, हम गुंबद वनस्पति विभज्योतक की तरह देख सकते है और उसके नए पत्ते primordia व्युत्पंन (चित्रा 3a) । 3 डी प्रक्षेपण दृश्य में, दोनों सोयाबीन वनस्पति विभज्योतक और टमाटर वनस्पति विभज्योतक संरचना की तरह गुंबद के रूप में, तथापि, सोयाबीन वनस्पति विभज्योतक के आकार टमाटर विभज्योतक की है कि से अलग है, और संगठन और पैटर्न के इन दोनों समों के आस-पास का पत्ता आदिम (चित्र 3B-C) विशिष्ट होता है ।
चित्रा 1: लाइव इमेजिंग और Arabidopsisके पुष्पक्रम सैम का विश्लेषण । ए और बी. ऑप्टिकल ओरोगोनल (Orth) और अनुप्रस्थ (ट्रांस) एक ही सैम, PI (प्रोपिडियम आयोडाइड) दाग (बैंगनी) के मध्य विमान के खंड विचार । C. एक ही सैम, PI दाग (ग्रे) के एक 3 डी प्रक्षेपण । d. गहराई शीर्ष सतह परत और लाल गहरी परत का प्रतिनिधित्व करने का संकेत नीले रंग के साथ, 3 डी प्रक्षेपण की कोडन । सेल की दीवारों पर पीआई से दाग लगे थे । स्केल पट्टियां: 20 μm (A, B); ५० μm (सी, डी) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: लाइव इमेजिंग और टमाटर के वनस्पति सैम का विश्लेषण । ए और बी. ऑप्टिकल लांबिक (Orth) और अनुप्रस्थ (ट्रांस) एक ही सैम के मध्य विमान के अनुभाग विचार । C. एक ही सैम के 3 डी प्रक्षेपण । d. गहराई शीर्ष सतह परत और लाल गहरी परत का प्रतिनिधित्व करने का संकेत नीले रंग के साथ, 3 डी प्रक्षेपण की कोडन । सेल की दीवारों पर पीआई से दाग लगे थे । स्केल पट्टियां: 20 μm (A, B); ५० μm (सी, डी) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: लाइव इमेजिंग और सोयाबीन के वनस्पति सैम का विश्लेषण । A. एक ऑप्टिकल लांबिक (orth) वनस्पति सैम के मध्य विमान के अनुभाग देखें । B. एक ही सैम के एक 3d प्रक्षेपण । C. गहराई शीर्ष सतह परत और लाल गहरी परत का प्रतिनिधित्व करने का संकेत नीले रंग के साथ, 3 डी प्रक्षेपण की कोडन । सेल की दीवारों पर पीआई से दाग लगे थे । स्केल पट्टियां: 20 μm (A); ५० μm (बी, सी) । तीर: पत्ता primordium । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
1 वीडियो: 1 चित्रामें arabidopsis पुष्पक्रम मेरिस्टेम के 3 डी रोटेशन । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
2 वीडियो: 2 चित्रामें टमाटर वनस्पति विभज्योतक के 3 डी रोटेशन । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहां, हम एक सरल इमेजिंग विधि है कि छोटे संशोधन के साथ विभिंन संयंत्रों से गोली मार के लिए, एक नया एवेंयू खोलने के लिए दोनों वनस्पति और मॉडल पौधों में प्रजनन चरणों में meristems विनियमन का उद्घाटन के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है वर्णन और फसलों. SEM और ऊतकीय धुंधला तरीकों के विपरीत, इस प्रोटोकॉल मदद कर सकते है दोनों सतह को देखने और sams के आंतरिक सेलुलर संरचनाओं प्रकट, श्रम के लिए आवश्यकता के बिना गहन नमूना निर्धारण और/ इस प्रोटोकॉल भी प्रतिदीप्ति SAMs में आधारित पत्रकारों के लिए स्थापित इमेजिंग विधि के लिए संगत है, संभवतः एक अच्छा सेलुलर संकल्प जो हमें कुंजी जीन और एसएएम 16 में प्रोटीन की अभिव्यक्ति पैटर्न के एक 3 डी दृश्य प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है प्रदान ,17,18,19. इसके अलावा, जुड़े छवि प्रसंस्करण प्रक्रिया यहां वर्णित बहुत शोधकर्ताओं का विश्लेषण और 3 डी में विभिंन प्रजातियों से SAMs तुलना में मदद करने में सक्षम हो जाएगा, दोनों विकासवादी विकास जीव विज्ञान अध्ययन और कृषि अनुसंधान आगे बढ़ ।
इस सरल प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं । सबसे पहले, नमूना तैयारी और विच्छेदन । एक संयंत्र सैम आमतौर पर मौलिक और युवा अंगों को शूट टिप पर विकसित करने के द्वारा छिपा हुआ है, और यह सीधे एक संनाभि माइक्रोस्कोप के तहत imaged नहीं किया जा सकता है । वनस्पति सैम छवि के लिए, यह सभी पत्ते और पुराने पत्ता primordia कि सैम के शीर्ष पर कवर ठीक गहने forceps का उपयोग कर हटाने के लिए आवश्यक है । पुष्पक्रम सैम छवि के लिए, यह ध्यान से सभी युवा फूलों को दूर करने के लिए सैम बेनकाब आवश्यक है, यह भी ठीक गहने forceps का उपयोग कर ।
दूसरा, पीपीआई समाधान का उपयोग करते हुए लाइव सेल धुंधला । इस प्रोटोकॉल में, हम हौसले से तैयार PI समाधान (1 मिलीग्राम/एमएल) का उपयोग करने के लिए सीधे लाइव SAMs, जो तेजी से, कुशल और प्रदर्शन करने के लिए आसान है कल्पना करने के लिए सेल दीवारों दाग । हालांकि PI समाधान कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है, एक हौसले से तैयार समाधान आमतौर पर गोली मार के लिए सबसे अच्छा धुंधला परिणाम देता है meristems । हालांकि PI मुख्य रूप से जीवित कोशिकाओं की झिल्ली को पार नहीं करता है और यह दाग कोशिकाओं को स्पष्ट सेलुलर रूपरेखा के साथ बरकरार है, यह आसानी से क्षतिग्रस्त/मृत कोशिकाओं घुसना कर सकते है और दृढ़ता से उन क्षतिग्रस्त क्षेत्रों में नाभिक और अंय आंतरिक झिल्ली प्रणाली दाग, संभावित संनाभि छवियों की गुणवत्ता को प्रभावित. इस प्रकार, यह धुंधला और लाइव इमेजिंग के लिए सैम नमूने तैयार करते समय किसी भी शारीरिक नुकसान से बचने के लिए आवश्यक हो जाएगा । दूसरी ओर, एक उच्च एकाग्रता पर PI संयंत्र कोशिकाओं के लिए एक विषाक्त प्रभाव से पता चलता है, और इस प्रकार, FM4-64 रहने वाले सैम कोशिकाओं9दाग को PI के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, FM4-64 लेबल प्लाज्मा झिल्ली, जो संभावित endocytosis के माध्यम से सेल इंटीरियर में लिया जा सकता है, यह उच्च सेलुलर संकल्प के साथ नमूनों दाग को चुनौती दे रही है ।
तीसरा, इमेजिंग अधिग्रहण । 1). उच्च संख्यात्मक apertures (एनए), पानी की सूई लेंस SAMs की लाइव इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है । पानी हवा से अपवर्तन का एक उच्च सूचकांक है और उद्देश्य लेंस के उच्च एनए SAMs की गहरी कोशिका परतों के माध्यम से बिखरे हुए संकेत फोटॉनों को इकट्ठा करने में मदद करता है । 2). लेजर शक्ति की सेटिंग्स (वाट या सतह प्रति वाट) अलग संनाभि सूक्ष्मदर्शी के बीच उच्च चर जा सकता है । उच्च लेजर शक्ति बेहतर सिग्नल संग्रह की अनुमति दे सकती है लेकिन नमूनों पर अधिक फोटोब्लीचिंग/ संकल्प, विरंजन और इमेजिंग समय के बीच व्यापार नापसंद कर रहे हैं । सामांय में, एक बड़ा फ्रेम आकार का चयन बेहतर XY संकल्प लेकिन अधिक इमेजिंग समय की ओर जाता है, और एक छोटे स्कैनिंग अंतराल का चयन एक बेहतर जेड संकल्प की ओर जाता है, लेकिन यह भी अधिक इमेजिंग समय । अब इमेजिंग समय संभावित अधिक photodamage का कारण बनता है/
इस विधि के साथ, कई बार यह गहरी ऊतक परतों में सेलुलर विवरण का निरीक्षण करने के लिए आसान नहीं हो सकता है, संभावना संनाभि पता लगाने और आंतरिक ऊतकों में अक्षम PI धुंधला की सीमा के कारण । हमारे अनुभवों के आधार पर, PI समाधान और/या धुंधला समय की एकाग्रता में वृद्धि एक बेहतर दाग प्राप्त करने में मदद कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, धुंधला प्रक्रिया करने के लिए संशोधन किए जा सकते हैं । उदाहरण के लिए, संशोधित छद्म Schiff propidium आयोडाइड (एमपीएस-पीआई) विधि स्थिर ऊतकों20के लिए अच्छी तरह से काम करता है । और यह अभी भी भविष्य में रहने वाले ऊतकों के लिए बेहतर धुंधला के साथ वैकल्पिक रंगों को खोजने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, यह भी परीक्षण है कि क्या विधि यहां वर्णित आम तौर पर सभी अंय फूल पौधों से SAMs के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है दिलचस्प है, तथ्य यह है कि कुछ संयंत्र प्रजातियों विशेष सेलुलर सामग्री या विभिंन कोशिका दीवार है पर विचार रचनाएं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखकों को स्वीकार लेजर संनाभि माइक्रोस्कोप और तकनीकी सहायता के लिए, और लेखक एंडी schaber से मदद की सराहना करते है के लिए purdue bindley bioscience केंद्र इमेजिंग सुविधा में प्रवेश के लिए purdue bindley इमेजिंग सुविधा । इस गतिविधि को इंडियाना कृषि और ग्रामीण विकास का समर्थन करने के लिए AgSEED चौराहे धन के हिस्से के रूप में इन्होने विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Use as making MS plates |
| Plastic petri dishes60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Use as imaging dishes |
| Propagation Mix | Sungro Horticulture | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| Razor blade | PERSONNA | 62-0179 | For cutting shoot apex from plants |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Image acquisition software |
References
- Meyerowitz, E. M. Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell. 88 (3), 299-308 (1997).
- Xu, C., et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).
- Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus. Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).
- Je, B. I., et al. Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits. Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).
- Ping, J., et al. Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean. Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).
- Vaughan, J. G., Jones, F. R.
- Sijacic, P., Liu, Z. Novel insights from live-imaging in shoot meristem development. Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).
- Tax, F. E., Durbak, A. Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems. Plant Cell. 18 (6), 1331 (2006).
- Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
- Heisler, M. G., Ohno, C.
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem. Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).
- Prunet, N. Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers. Journal of Visualized Experiments. (122), e55156 (2017).
- Prunet, N., et al. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. 419, 114-120 (2016).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131, 4225-4237 (2004).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 773 (2017).
- Zhou, Y., et al. HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers. Science. 361 (6401), 502-506 (2018).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases. Development. 142 (6), 1043 (2015).
- Li, W., et al. LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation. Science Signaling. 6 (270), ra23 (2013).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
