Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Published: June 16, 2019 doi: 10.3791/59391
Automatic Translation
1,2, 3, 2,4,5,6
1Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, 2Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 3Department of Urology, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, 4Boler-Parseghian Center for Rare and Neglected Diseases, University of Notre Dame, 5Harper Cancer Research Institute, University of Notre Dame, 6Tumor Microenvironment and Metastasis Program, Indiana University Melvin and Bren Simon Cancer Center

Summary

Tirozin-nitrated proteinlerin proteomik profilleme 3-nitrotirozin modifikasyonunda düşük bolluk nedeniyle zorlu bir teknik olmuştur. Burada, nitropeptid zenginleştirme ve model olarak angiotensin II kullanarak profil oluşturma için yeni bir yaklaşım açıklanmaktadır. Bu yöntem diğer in vitro veya in vivo sistemlerde uzatılabilir.

Abstract

Protein nitrasyon, Tirozin kalıntılarının en önemli post-translasyonel değişikliklerinden (PTM) biridir ve ökaryotik hücrelerde reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve reaktif azot türlerinin (RNS) kimyasal eylemleri ile indüklenir. Proteinlerin nitrasyon sitelerinin kesin tanımlaması, inflamasyon, yaşlanma ve kanser gibi protein nitrasyon ile ilgili fizyolojik ve patolojik süreçleri anlamak için çok önemlidir. Nitrolanmış proteinler indüklenen koşullarda bile hücrelerde düşük bolluk olduğundan, protein nitrasyon sitelerinin profil oluşturma ve tanımlaması için hiçbir evrensel ve verimli yöntem geliştirilmiştir. Burada bir kimyasal azaltma reaksiyonu ve biotin etiketleme kullanarak nitropeptid zenginleştirme için bir protokol açıklayan, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi izledi. Bizim yöntemimizde, nitropeptid türevleri yüksek doğruluk ile tespit edilebilir. Yöntemimiz daha önce bildirilen yöntemlerle karşılaştırıldığında iki avantaj sergiler. İlk olarak, dimetil etiketleme, nicel sonuçlar oluşturmak için kullanılan nitropeptidler üzerinde primer Amin engellemek için kullanılır. İkincisi, NHS-biotin reaktif içeren bir disülfür bağ, daha fazla azaltılmış ve kütle spektrometresi üzerinde algılama sinyalini artırmak için alkylated zenginleştirme için kullanılır. Bu protokol, geçerli kağıda peptid angiotensin II modeline başarıyla uygulandı.

Introduction

Proteinleri 3-nitrotirozin oluşturmak için Tirozin kalıntılarının nitrasyon birçok biyolojik süreçleri düzenler. Tirozin ve 3-nitrotirozin arasındaki farklı kimyasal özellikler nedeniyle, nitoy proteini,1,2sinyalizasyon etkinliğini tedirgin olabilir. Bu nedenle, proteinlerin nitrasyon sitelerini verimli bir şekilde zenginleştirebilir ve tanımlayacak yöntemler geliştirmek önemlidir. 3-nitrotirozin, fosforilasyon ve asetilasyon gibi diğer PTM formlarına kıyasla proteinlerde düşük bir bolluk modifikasyonu olduğu için, endojen nitrasyon sitelerini doğrudan hücre hatlarından veya doku örneklerinden tespit etmek zordur. Bununla birlikte, nitrotpeptit parçalanma modelini karakterize etmek için kütle spektrometresi (MS) kullanma metodolojisi geliştirilmiştir (örneğin, Zhan & Desiderio3), yeni nitroproteomik yöntemlerin temelini oluşturur.

Şu anda, MS tarafından izlenen bir zenginleştirme adım nitropeptid profil4,5için en güçlü stratejisidir. Zenginleştirme yöntemleri iki sınıfa sınıflandırılabilir. Bir sınıf, özel olarak 3-nitrotirozin tanıyabilir antikorlar dayanmaktadır, diğer sınıf bir amin grubu için bir nitro grup azaltır kimyasal türetme dayanır ise4,5. Antikor tabanlı yöntem için, nitrotirozin benzeşimi sütun zenginleştirme için kullanılır, hangi elüe malzeme daha da çözülür ve yüksek çözünürlüklü MS ile analiz,6,7. Kimyasal türetme tabanlı yöntem için, peptid veya lizin N-Terminus Amin grupları asetilasyon, göreli ve mutlak niceleme (iTRAQ) veya tandem kütle etiketleri (TMT) reaktifler için isobarik Etiketler tarafından ilk adımda engellenmelidir. Sonra, bir redüksiyoner aminotyrosine nitrotirozin azaltmak için kullanılan yeni oluşturulan amin grubu değiştirerek takip, hangi biotin ligasyon içerir, sülphydril peptid dönüşüm, veya etiketleme sistemleri diğer türleri8,9, 10,11. Şimdiye kadar kurulan protokollerin çoğu, Endogenously nitrolanmış proteinler yerine in vitro Over-nitrolanmış proteinlere dayanmaktadır.

Bu çalışmada, nitrotirozin kimyasal türevisini değiştiren bir prosedür, MS algılama sırasında gelişmiş hassasiyet gösteren ve miktarlama amacı için uygun olan nitropeptid zenginleştirme ve tanımlaması için geliştirilmiştir. Bu yöntemi kullanılan biyolojik sistemlerde yapılan son çalışmamızda, miyeloid türevi bastırıcı hücrelerden (MDSCs) üretilen RNS tarafından Tyr394 de lenfosit-spesifik protein Tirozin kinaz (LCK) nitrasyon, önemli bir rol oynar tümör mikro bağışıklık bastırma12. Bu nedenle, nitropeptid tanımlama yöntemimiz karmaşık biyolojik örneklere de uygulanabilir. Burada, biz model peptid angiotensin II kullanarak protokollerimizi tarif, hangi parçalanma deseni bilinen ve yaygın nitroproteomik çalışmalar kullanılır8,9,10,11, örnek olarak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Anjiyotensin II nitrasyon

  1. Nitrolanmış peptid oluşturmak için, 390 μL PBS çözeltisi (10 mm Nah2Po4, 150 mm NaCl, pH 7,4) içinde 10 μL angiotensin II (drvyıpf) ebeveyn çözeltisi (su içinde 2 mm), 50 μM son konsantrasyonda seyreltilmiştir.
  2. 10 μL Peroksinitrit ekleyin (200 mm içinde 4,7% NaOH) Anjiyotensin II çözeltisi son konsantrasyon Peroksinitrit 5 mm yapmak.
    Not: Peroksinitrit dengesiz ve kolay asit formunda olduğunda çözmek için, böylece Peroksinitrit ebeveyn çözeltisi temel çözelti tutulur ve-80 °c saklanır.
  3. 1 M HCl tarafından 7-8 için çözümün pH değerini ayarlayın. Nitrasyon reaksiyonu başlatmak için, 5 dakika boyunca 400 rpm 'de tüpü sallayın.
  4. Salting için ticari olarak kullanılabilir bir ters faz SPE sütunu ( malzeme tablosunabakın) kullanın.
    1. Temizleme için 2 çözelti, su içinde% 5 metanol ve elüsyon için suda% 80 metanol hazırlamak.
    2. Ekleme 500 μL metanol, ardından 500 μL su tarafından ardından sütun ön koşula, 1 ml pipetör üzerine ucu ile sütunun üstüne koyun, akış hızlandırmak için pipetör basın.
    3. Yük 410 μL örnek adım 1,3 sütununda, akış yoluyla atın.
    4. 500 μL ile yıkandıktan sonra% 5 metanol,% 80 metanol 300 μL kullanın, daha sonra oda sıcaklığında varsayılan ayar olarak hız-VAC ile tamamen kurutulur.
      Not: desalting reaksiyonlar için çok önemlidir, çünkü bir önceki adımda sol solvent sonraki adımlarda olumsuz bir etkiye sahip olabilir.

2. dimetil etiketleme ile primer aminlerin alkilasyonu

  1. 100 μL 100 mM triethylammonium bikarbonat (TEAB) çözeltisi içinde toz Nitro-Anjiyotensin II yeniden oluşturur.
    Not: çözümün pH değeri 7 ile 9 arasında olmalıdır ve çözüme birincil Amin eklendiğinden emin olun.
  2. Çözüme 4 μL% 4 formaldehit ekleyin, kısaca karıştırın.
    DIKKAT: formaldehit buharı toksik; bir duman kaputu deneyler yapmak.
  3. 4 μL 0,6 M NaBH3CN eklemek için çözüm, oda sıcaklığında 1 saat için 400 rpm 'de tüp sallayın.
  4. 16 μL% 1 amonyak çözeltisi ekleyerek etiketleme reaksiyonu hafifletmek, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inküye.
  5. Çözeltinin asitlenmesi için 8 μL formik asit ekleyin ve 1,4 adımda açıklandığı gibi ters faz SPE sütununu kullanarak tuzlama gerçekleştirin.

3. aminotirozin nitrotirozin azaltılması

  1. 500 μL PBS (10 mM NaH2Po4, 150 mm nacl, pH 7,4) içinde dimetil etiketli Nitro-ANJIYOTENSIN II yeniden oluşturur.
  2. Solüsyona 10 μL 1 M sodyum dithionate ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inküye yapın. Azaltma reaksiyonunun ardından, çözümün sarı rengi açık hale gelir.
    Not: tartım 174,1 mg sodyum dithionate ve son hacmi 1 mL yapmak için suda çözülür. Bu çözüm-20 °C ' de bir haftadan daha uzun süre saklanabilir.
  3. 1,4 adımda açıklandığı gibi Petrolün tuzsuzlaşması için ters faz SPE sütun kullanın.

4. biotinylation, zenginleştirme, ve algılama

  1. 500 μL PBS (10 mM NaH2Po4, 150 mm nacl, pH 7,4) içinde dimetil etiketli amino ANJIYOTENSIN II yeniden oluşturur.
  2. 5 μL 40 nM NHS-S-S-biotin ekleyin, DMSO içinde çözünür, çözüm için, oda sıcaklığında 2 h inkübasyon sonra, reaksiyonu gidermek için 1 μL% 5 hidroxylamine kullanın.
  3. Bu arada, doğrultma streptavidin agaroz boncuk ekleyerek 500 μL PBS (10 mm Nah2Po4, 150 mm NaCl, pH 7,4), santrifük olarak 580 x g 5 dakika oda sıcaklığında ve supernatant atarak. Dengelemesinden 3 kez gerçekleştirin.
  4. 100 ekleme μL streptavidin agaroz boncuk reaksiyon sistemine, oda sıcaklığında bir döner Shaker üzerinde 1 saat inkük. PBS ile 4 kez yıkayın (10 mM NaH2Po4, 150 mm nacl, pH 7,4). Her yıkama adımı için, boncuklar için PBS 500 μL ekleyin, iyi karıştırın, sonra oda sıcaklığında 5 dakika için 580 x g Santrifüjü ve supernatant atın.
  5. 400 μL 10 mm ditiyotreitol (DTT) kullanın, 45 dk için 50 °c ' de agaroz boncuklar ile inkük etmek için, oda sıcaklığında 5 dakika için 580 x g aşağı spin ve boncuk atmak, 20 μl eklemek 0,5 M idoacetamid (IAM) karanlık 20 dakika için süpernatant için.
    Not: DTT biotin ve peptid bağlantı arasındaki disülfit bağ kırmak için kullanılır, ikincisi boncuk serbest bırakılır ve IAM tarafından alkylated.
  6. 1,4 adımda gösterilen Petrolün tuzsuzlaşması için ters faz SPE sütun kullanın.
  7. 20 μL% 0,1 formik asit (FA) içinde kuru peptidler çözümlendikten sonra, her bölümün ürüne tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) analiziyle sıvı kromatografi ile bağlıdır.
    1. Değiştirilen Ang II peptitleri 60 dk gradyan elüsyonu ile ayırın (0-8 dk, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min,% 2 B) bir akış hızında 0,300 μL/dak nano-HPLC sistemi ile doğrudan yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile arabirim.
      Not: analitik sütun 75 μm ID, 150 mm uzunluğunda, C-18 reçine ile doludur. Mobil faz A oluşur 0,1% formik asit, ve mobil faz B oluştu 100% Asetonitril ve 0,1% formik asit.
    2. Veri bağımlı edinme modunda kütle spektrometresi çalıştırın, tek bir tam tarama kütle spektrumunu ayarlayın (300-1800 m/z, 60 000 çözünürlük) ve ardından 20 veri bağımlı MS/MS taramaları% 28 normalleştirilmiş Çarpışma enerjisi.
    3. Kitle spektrum verilerini açın ve kimyasal reaksiyonunun başarıyla gerçekleştirildiğini onaylamak için her adımda ürünün zirvelerini belirleyin.

5. nitropeptid miktarının belirlenmesi

  1. Adım 1,4 Nitro-Anjiyotensin II çözeltileri 3 setleri hazırlayın, her set 2 konsantrasyon Nitro-angiotensin II içeren: Set #1, 20 nmol Boru A ve 20 nmol tüp B, her 100 μL TEAB çözüm; Set #2, 10 nmol tüp C ve 20 nmol tüp D, her 100 μL TEAB çözüm; Set #3, 40 nmol tüp E ve 10 nmol tüp F, her 100 μL TEAB çözüm.
    Not: her bir setteki iki Nitro-Anjiyotensin II konsantrasyonları, sırasıyla formaldehit (ışık) ve formaldehit-D2 (ağır) ile reaksiyona girmeden dimetil etiketleme için kullanılır.
  2. Her set için, sırasıyla hafif ve ağır olarak etiketlenecek örneğe 4 μL,% 4 formaldehit ve formaldehit-D2 ekleyin. Dimetil etiketleme bitirmek için 2,5 2,3 adımlarını izleyin.
  3. Işık ve ağır etiketli örnekleri karıştırın.
  4. Azaltma, biotinylation, zenginleştirme ve algılama için 3,1 ila 4,6 arasındaki adımları izleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu yazıda nitropeptid profilleme için akış şeması Şekil 1' de gösterilir. Şekil 2, 3, 4 ve 5 anjiyotensin ii kütle spektrumlarını göster, Nitro-Anjiyotensin II, DIMETIL etiketli Nitro-Anjiyotensin II ve dimetil etiketli amino Anjiyotensin II, sırasıyla. Bileşik molekül ağırlığı her rakam mono-izotop zirvesinde m/z değerleri ile yansıtılabilir, angiotensin II kimyasal modifikasyonu belirten başarıyla her adım için elde edildi. Şekil 6 , son ürün adım 4,7 algılanır ve LC-MS/MS ile karakterize gösterir. Şekil 7 dimetil etiketleme ile nitropeptid nicel sonuçları gösterir. Bağıl miktarlarda ışık ve ağır, her grupta mono-izotop zirvesinde yoğunluğun karşılaştırılması ile belirlenir, bu da farklı gruplardan zenginleştirilmiş nitropeptidler ölçmek için bize izin verir.

Figure 1
Şekil 1 . Nitrojen-Anjiyotensin II zenginleştirmek ve tespit etmek için kimyasal türetme yönteminin iş akışı. İlk olarak, Anjiyotensin II peroxynitrite tarafından nitoy, desalting sonra, dimetil etiketleme peptid üzerinde primer Amin engellemek için kullanılır. Sonra sodyum dithionate aminotirozin için nitrotirozin azaltmak için kullanılır, hangi daha NHS-S-S-biotin ile reaksiyona. Streptavidin boncuk tarafından zenginleştirilmiş sonra, peptid DTT tarafından alkilasyon takip ve LC-MS/MS tarafından tespit kesilir. Bu rakam12, Şekil 2' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2 . Anjiyotensin II kitle spektrum. Bu rakam m/z 523,78 mono-izotop zirvesinde önlü şarj peptid (yukarı) ve Anjiyotensin II (alt) MS/MS parçalanma deseni eşleştirilmiştir gösterdi. Bu rakam12, Şekil S2değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . Nitro-Anjiyotensin II kitle spektrum. Bu rakam m/z 546,28 mono-izotop zirvesinde önlü şarj peptid (yukarı) ve nitro-Anjiyotensin II (alt) MS/MS parçalanma deseni eşleştirilmiştir gösterdi. Bu rakam12, Şekil S2değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . Dimetil etiketli Nitro-Anjiyotensin II kitle spektrum. Bu rakam m/z 560,29 mono-izotop zirvesinde önlü şarj peptid (yukarı) ve dimetil etiketli Nitro-Anjiyotensin II (alt) MS/MS parçalanma deseni eşleştiğini gösterdi. Bu rakam12, Şekil S2değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 . Dimetil etiket amino Anjiyotensin II kitle spektrum. Bu rakam m/z 545,31 mono-izotop zirvesinde önlü şarj peptid (yukarı) ve dimetil etiketli amino Anjiyotensin II (alt) MS/MS parçalanma deseni eşleştirilmiştir gösterdi. Bu rakam12, Şekil S2değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 . Final ürününün kütle spektrumunu. Bu rakam m/z 617,82 mono-izotop zirvesinde önlü şarj peptid (yukarı) ve son ürünün MS/MS parçalanma deseni (orta) ve 400 den 1000 m/z (alt) daha ayrıntılı parçalanma modeli sergilenen zoom-spektrumunda eşleştiğini gösterdi . Bu rakam12, Şekil S2değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7 . Dimetil etiketleme ile nitropeptidler ölçülme sonuçlarının kütle spektrumları. Ağır oranlarda ışık, sırasıyla 1:1 (yukarı), 1:2 (orta) ve 4:1 (alt) şeklindedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada protokol nitropeptid zenginleştirme ve profil açıklar. Model peptid olarak angiotensin II kullanarak, Şekil 1' de gösterilen prosedürü tasvir ettik. Nitro-Anjiyotensin II aldıktan sonra, peptit üzerinde primer Amin protokol içinde en önemli adımlardan biri olan daha fazla Amin konjugasyon, önlemek için engellenmelidir. Geçerli protokolde, dimetil etiketleme, primer aminleri iki nedenden dolayı engellemek için kullanılır: ilk olarak, nicel sonuçların satın alınmasını sağlar; İkinci olarak, bu reaksiyon için maliyet NHS tabanlı reaksiyon daha düşüktür ve engelleme verimliliği yüksek13. Ölçüm için ölçülen ışık ağır oranlarda beklenen oranlarına çok yakındır (Şekil 7), hatalar% 10 ' dan az hesaplanır.

Protokolün bir diğer kritik adım, hızlı ve verimli bir şekilde tepki veren sodyum dithionate tarafından aminotirozin dimetil etiketli peptid üzerinde 3-nitrotirozin azaltılması. Yeni oluşturulan amin grubu daha fazla 4-5 kıvrımları NHS-S-S-biotin fazlalığını ile etiketlenmiştir. Daha az veya daha fazla NHS-s-S-biotin sırasıyla eksik etiketleme reaksiyonu veya eksik zenginleştirme yol açacaktır. DTT tamamen disülfit Bond kırabilir ve streptavidin boncuklar zenginleştirilmiş peptit serbest, hangi IAM tarafından alkylated ve LC-MS/MS tarafından analiz.

Bu protokol, hem biyokimyasal sistemde hem de hücreler veya dokular gibi biyolojik malzemelerden nitropeptidler tanımlamak ve ölçmek için uygundur. Biotin zenginleştirme ve ıAM alkilasyonu önemli ölçüde hassasiyeti artırabilir beri, düşük bol nitpeptitler MS tarafından algılanabilir hale. Örneğin, bu protokol, duvar prostat ve akciğer karsinomu modelleri12yalıtılmış infiltre T hücrelerinin endojen nitpeptidler profil için kullanılır. Protein LCK 'in Nitro-Tyr294 ' ı tespit ettik ve bu değişikliğin MDSCs12' nin bağışıklık baskısı sürecinde kritik bir rol oynayabilir olduğunu göstermek için fonksiyonel çalışmalar gerçekleştirdik.

Tekniğinin uygulanması iki faktör ile sınırlıdır: ilk olarak, hücreler ve dokularda nitropeptidler düşük bolluk birkaç nitropeptidler tespit edilebilir belirler; İkinci olarak, tek hücreli genomik ve transcriptomik sıralama gibi son derece hassas metodolojilerle karşılaştırıldığında MS 'nin içsel düşük algılama hassasiyeti. Bu protokolün diğer patolojik koşullara uygulanması, hastalığın ilerlemesinde daha önce tanınmayan işlevlerle daha fazla protein nitrasyon PTMs tanımlamanıza yardımcı olacağını hayal ediyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Amerikan Kanser Derneği kurumsal araştırma Grant ıRG-14-195-01 tarafından desteklenmektedir (M. Sharon Stack asıl araştırmacı; X.L. bir alt alıcı müfettişi). Bu yayın Grant Numbers KL2 TR002530 ve UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) Ulusal Sağlık Enstitüleri, translasyonel Bilimler, klinik ve translasyonel Bilimler Ödülü Ilerleyen Ulusal Merkezi 'nden kısmi destek ile mümkün yapıldı. X. L. Indiana CTSı KL2 genç araştırmacı Ödülü sahibidir. S. F. Walther Cancer Foundation Ilerleyen temel kanser hibe tarafından desteklenmektedir. X. W. Ulusal Doğal Bilim Vakfı Çin genel programı tarafından desteklenmektedir (Grant No. 817773047).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acclaim pepmap 100 C18 column Thermo-Fisher 164534
1 M TEAB solution Sigma-Aldrich T7408
50% hydroxylamine Thermo-Fisher 90115
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Molecular Biology Grade
formaldehyde-D2 Toronto Research Chemicals F691353
formic acid Sigma-Aldrich 695076 ACS reagent
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
isoacetamide Sigma-Aldrich I1149
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
NHS-S-S-bition Thermo-Fisher 21441
Oasis HLB column (10 mg) Waters 186000383
peroxynitrite Merck-Millipore 516620
sodium cyanoborohydrite Sigma-Aldrich 42077 PhamaGrade
sodium dithionate Sigma-Aldrich 157953 Technical Grade
Streptavidin Sepharose GE Healcare GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC Thermo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
  2. Radi, R. Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects. Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).
  3. Zhan, X., Desiderio, D. M. MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin. Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).
  4. Batthyány, C., et al. Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects. Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).
  5. Feeney, M. B., Schöneich, C. Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).
  6. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).
  8. Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides. Talanta. 80, 1503-1512 (2010).
  9. Chiappetta, G., et al. Quantitative identification of protein nitration sites. Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).
  10. Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 14, Unit 14.13 (2012).
  11. Zhang, Q., et al. A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples. Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).
  12. Feng, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).
  13. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).

Tags

Biyokimya Sayı 148 Nitropeptid Anjiyotensin II nitrotirozin dimetil etiketleme sodyum dithionate biotin etiketleme zenginleştirme
Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, S., Wen, X., Lu, X.… More

Feng, S., Wen, X., Lu, X. Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II. J. Vis. Exp. (148), e59391, doi:10.3791/59391 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter