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Biochemistry

Nitropeptide प्रोफ़ेशनल और पहचान एंजियोटेन्सिन द्वितीय द्वारा सचित्र

doi: 10.3791/59391 Published: June 16, 2019

Summary

टायरोसिन-नाइट्रेटेड प्रोटीन की प्रोटीओमिक प्रोफाइलिंग 3-नाइटोटिरोसिन संशोधन की कम बहुतायत के कारण एक चुनौतीपूर्ण तकनीक रही है। यहाँ हम मॉडल के रूप में Angiotensin द्वितीय का उपयोग करके nitropeptide संवर्धन और रूपरेखा के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण का वर्णन. इस विधि इन विट्रो में अन्य के लिए या विवो सिस्टम में बढ़ाया जा सकता है.

Abstract

प्रोटीन नाइट्रेशन टायरोसिन अवशेषों पर सबसे महत्वपूर्ण पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) में से एक है और इसे यूकैरियोटिक कोशिकाओं में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजातियों (आरएनएस) के रासायनिक कार्यों से प्रेरित किया जा सकता है। प्रोटीन पर नाइट्रेशन साइटों की सटीक पहचान प्रोटीन नाइट्रैन से संबंधित शारीरिक और रोग जनक प्रक्रियाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे सूजन, उम्र बढ़ने, और कैंसर। चूंकि नाइट्रेट प्रोटीन प्रेरित परिस्थितियों में भी कोशिकाओं में कम बहुतायत के होते हैं, इसलिए प्रोटीन नाइट्रनेशन साइटों की रूपरेखा और पहचान के लिए कोई सार्वभौमिक और कुशल तरीके विकसित नहीं किए गए हैं। यहाँ हम एक रासायनिक कमी प्रतिक्रिया और बायोटिन लेबलिंग का उपयोग करके nitropeptide संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री के बाद. हमारी विधि में, nitropeptide डेरिवेटिव उच्च सटीकता के साथ पहचाना जा सकता है. हमारी विधि पहले रिपोर्ट की गई विधियों की तुलना में दो लाभ दर्शाती है। सबसे पहले, डाइमेथिल लेबलिंग का उपयोग निट्रोप्टिड पर प्राथमिक अमीन को ब्लॉक करने के लिए किया जाता है, जिसका उपयोग मात्रात्मक परिणाम उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। दूसरा, एनएचएस-बायोटिन अभिकर्मक युक्त एक डिसुलाइड बांड का उपयोग संवर्धन के लिए किया जाता है, जिसे और कम किया जा सकता है और एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर पर पता लगाने के संकेत को बढ़ाने के लिए ऐल्किलेट किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक वर्तमान कागज में मॉडल पेप्टाइड एंजियोटेन्सिन द्वितीय के लिए लागू किया गया है.

Introduction

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प्रोटीन में टायरोसिन अवशेषों का नाइट्राशन 3-नाइटोटिरोसिन बनाने के लिए कई जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है। टायरोसिन और 3-नाइटोटिरोसिन के बीच विभिन्न रासायनिक गुणों के कारण, नाइट्रेटेड प्रोटीन में एक नाइट्रेट्ड संकेतन गतिविधि1,2हो सकती है। इसलिए, यह तरीकों कि समृद्ध और प्रोटीन पर नाइट्करण साइटों कुशलता से पहचान कर सकते हैं विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है. के रूप में 3-nitrotyrosine पीटीएम के अन्य रूपों की तुलना में प्रोटीन पर एक कम बहुतायत संशोधन है, इस तरह के फॉस्फोरिलेशन और एसिटाइलेशन के रूप में, यह सेल लाइनों या ऊतक के नमूने से सीधे अंतर्जात नाइट्रेशन साइटों की पहचान करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. फिर भी, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) का उपयोग करने के लिए नाइट्रोपेप्टाइड केविखंडन पैटर्न की विशेषता का उपयोग करने की पद्धति विकसित किया गया है (उदाहरण के लिए, झान और Desiderio 3), जो नाइट्रोप्रोटोमिक्स के नए तरीकों के लिए नींव देता है.

वर्तमान में, एमएस द्वारा पीछा एक संवर्धन कदम nitroptide रूपरेखा4,5के लिए सबसे शक्तिशाली रणनीति है. संवर्धन विधियों को दो वर्गों में वर्गीकृत किया जा सकता है। एक वर्ग एंटीबॉडी पर आधारित है जो विशेष रूप से 3-नीट्रोटोइरोसिन को पहचान सकता है, जबकि दूसरा वर्ग रासायनिक व्युत्पत्ति पर आधारित होता है जो नाइट्रो समूह को एक खान समूह4,5में कम कर देता है। एंटीबॉडी आधारित विधि के लिए, nitrotyrosine आत्मीयता स्तंभ संवर्धन के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसमें से eluted सामग्री आगे हल किया जाता है और उच्च संकल्प एमएस6,7द्वारा विश्लेषण किया. रासायनिक व्युत्पत्ति-आधारित विधि के लिए, पेप्टाइड या lysine के एन-टर्मिनस पर amine समूहों या तो एसिटाइलेशन द्वारा पहले कदम में अवरुद्ध किया जाना चाहिए, सापेक्ष और निरपेक्ष परिमाणीकरण के लिए आइसोबारिक टैग (iTRAQ), या अग्रानुम जन टैग (TMT) अभिकर्मकों. इसके बाद, एक reducer का उपयोग न्यूफॉर्म किए गए अमीन समूह को संशोधित करने के बाद नीट्रोटिरोसिन को कम करने के लिए किया जाता है, जिसमें बायोटिन लिगेशन, सल्फाइड्रिल पेप्टाइड रूपांतरण, या अन्य प्रकार की टैगिंग सिस्टम8,9, 10,11. अब तक स्थापित अधिकांश प्रोटोकॉल अंतर्जात रूप से नाइट्रेट प्रोटीन के बजाय विट्रो ओवर-नाइट्रेटेड प्रोटीन पर आधारित हैं।

वर्तमान अध्ययन में, निट्रोटिरोसिन के रासायनिक व्युत्पत्ति की एक संशोधित प्रक्रिया निट्रोपेप्टाइड संवर्धन और पहचान के लिए विकसित की गई है, जो एमएस का पता लगाने के दौरान बढ़ी हुई संवेदनशीलता को दर्शाता है और परिमाणीकरण उद्देश्य के लिए उपयुक्त है। हमारे हाल के अध्ययन जैविक प्रणालियों में इस विधि को रोजगार की पहचान की है कि lymphocyte-विशिष्ट प्रोटीन tyrosine kinase के नाइट्राशन (LCK) Tyr394 में माइलॉयड व्युत्पन्न दमन कोशिकाओं से उत्पादित आरएनएस द्वारा (MDSCs) में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट12का इम्यूनोसुप्रेशन | इसलिए, nitropetide पहचान की हमारी विधि जटिल जैविक नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से. यहाँ, हम मॉडल पेप्टाइड एंजियोटेन्सिन द्वितीय का उपयोग करके हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिनमें से विखंडन पैटर्न जाना जाता है और एक उदाहरण के रूप में नाइट्रोप्रोटोमिक अध्ययन8,9,10,11में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।

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Protocol

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1. एंजियोटेन्सिन द्वितीय की निरितेशन

  1. नाइट्रेटेड पेप्टाइड उत्पन्न करने के लिए, एंजियोटेन्सिन II (DRVYIHPF) मूल समाधान (2 एमएम पानी में) के 10 डिग्री एल को 390 एमएल पीबीएस समाधान (10 एमएम नाएच2पीओ4, 150 एमएम NaCl, पीएच 7.4) को 50 डिग्री सेल्सियस की अंतिम सांद्रता में पतला करें।
  2. peroxynitrite के 10 डिग्री एल जोड़ें (200 m में 4.7% NaOH) angiotensin द्वितीय समाधान करने के लिए peroxynitrite के अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए 5 m.
    नोट: Peroxynitrite अस्थिर और हल करने के लिए आसान है जब यह एसिड के रूप में है, तो peroxynitrite के माता पिता के समाधान बुनियादी समाधान में रखा जाता है और -80 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत किया जाता है।
  3. 1 M HCl द्वारा 7-8 करने के लिए समाधान के pH मान समायोजित करें। नाइट्रैशन प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए, 5 मिनट के लिए 400 आरपीएम पर ट्यूब हिला।
  4. desalting के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिवर्स चरण SPE स्तंभ का उपयोग करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    1. desalting के लिए 2 समाधान तैयार, धोने के लिए पानी में 5% मेथनॉल और elution के लिए पानी में 80% मेथनॉल.
    2. कॉलम की पूर्व शर्त के लिए 500 डिग्री सेल्सियस पानी के बाद मेथनॉल का 500 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, कॉलम के शीर्ष पर टिप के साथ 1 एमएल पाइपेटर रखें, प्रवाह में तेजी लाने के लिए पाइपेटर दबाएं।
    3. स्तंभ पर चरण 1.3 में नमूने का 410 $L लोड करें, प्रवाह को छोड़ दें.
    4. 5% मेथनॉल के 500 डिग्री सेल्सियस के साथ धोने के बाद, नीट्रोपोप्टाइड को पूरा करने के लिए 80% मेथनॉल के 300 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें, जो तब कमरे के तापमान पर डिफ़ॉल्ट सेटिंग में गति-वैक द्वारा पूरी तरह से सूख जाता है।
      नोट: Desalting प्रतिक्रियाओं के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, के बाद से विलायक पिछले चरण में छोड़ दिया अगले कदम पर एक नकारात्मक प्रभाव हो सकता है.

2. डाइमेथिल लेबलिंग द्वारा प्राथमिक ऐमीन का ऐल्किलन

  1. 100 एमएम ट्राइएथिलमोनियम बाइकार्बोनेट (टीईएबी) समाधान के 100 डिग्री एल में पाउडर नाइट्रो-एंजियोटेन्सिन II का पुनर्गठन करें।
    नोट: समाधान का pH मान 7 और 9 के बीच होना चाहिए, और सुनिश्चित करें कि कोई प्राथमिक amine समाधान में जोड़ा गया है।
  2. समाधान के लिए 4% formaldehyde के 4 डिग्री एल जोड़ें, संक्षेप में मिश्रण.
    चेतावनी: Formaldehyde वाष्प विषाक्त कर रहे हैं; एक धूआं हुड में प्रयोगों प्रदर्शन करते हैं।
  3. समाधान के लिए 0.6 M NaBH3CN के 4 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए 400 आरपीएम पर ट्यूब हिला।
  4. 1% अमोनिया समाधान के 16 डिग्री सेल्सियस जोड़कर लेबलिंग प्रतिक्रिया को कतार में लगादें, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. समाधान को अम्लित करने के लिए 8 डिग्री सेल्सियस फोरमिक अम्ल जोड़ें और चरण 1-4 में वर्णित रिवर्स फेज SPE स्तंभ का उपयोग करके विलवणीकरण करें।

3. एमिनोटोइरोसिन में नीट्रोटोइरोसिन की कमी

  1. पीबीएस के 500 डिग्री एल में डाइमेथिल लेबल नाइट्रो-एंजियोटेन्सिन II का पुनर्गठन (10 एमएम नाएच2पीओ4, 150 एमएम नैकल, पीएच 7.4)।
  2. 1 एम सोडियम डाइथियोनेट के 10 डिग्री एल को विलयन में जोड़ें और 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। कमी प्रतिक्रिया के बाद, समाधान का पीला रंग स्पष्ट हो जाता है।
    Note: वजन 174.1 मिलीग्राम सोडियम डाइथियोनेट और अंतिम आयतन बनाने के लिए इसे पानी में घोलकर 1 एमएल है। यह समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है अब एक सप्ताह से.
  3. चरण 1.4 में वर्णित के रूप में desalting के लिए रिवर्स चरण SPE स्तंभ का उपयोग करें।

4. Biotinylation, संवर्धन, और पता लगाने

  1. पीबीएस (10 एमएम नाह2पीओ4, 150 एमएम NaCl, पीएच 7.4) के 500 डिग्री एल में डाइमेथिल लेबल एमिनो एंजियोटेन्सिन II का पुनर्गठन करें।
  2. 40 एन एम एनएचएस-एस-बायोटिन के 5 डिग्री एल जोड़ें, DMSO में भंग, समाधान के लिए, कमरे के तापमान पर 2 एच ऊष्मायन के बाद, प्रतिक्रिया को शम्पन करने के लिए 5% हाइड्रॉक्सीलामाइन का 1 $L का उपयोग करें।
  3. इस बीच, पीबीएस (10 एमएम नाएच2पीओ4, 150 एमएम NaCl, पीएच 7.4), 580 x g पर 5 न्यूनतम तापमान पर सेंट्रीफ्यूजिंग और सुपरनेंट को डिस्कार्ड करके समतुल्य स्ट्रेप्टाविडिन एग्रोस मोती जोड़कर। समानता 3 बार प्रदर्शन करते हैं।
  4. प्रतिक्रिया प्रणाली के लिए 100 $L streptavidin agarose मोती जोड़ें, कमरे के तापमान पर एक रोटरी शेकर पर 1 एच इनक्यूबेट। पीबीएस (10 एमएम नाह2पीओ4, 150 एमएम नैकल, पीएच 7.4) के साथ 4 बार धोएं। प्रत्येक धोने के चरण के लिए, मोती के लिए पीबीएस के 500 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण है, तो कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 580 x ग्राम पर अपकेंद्रण और supernatant त्याग दें।
  5. 10 एमएम डाइथियोथ्रेटोल (डीटीटी) के 400 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें, 45 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर agarose मोती के साथ इनक्यूबेट करने के लिए, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 580 x ग्राम पर नीचे स्पिन और मोती को त्यागें, 0.5 एम idoacetami (IAM) के 20 लाख जोड़ें अंधेरे में 20 मिनट के लिए supernatant के लिए।
    नोट: DTT biotin और पेप्टाइड की कड़ी के बीच disulfide बंधन को तोड़ने के लिए प्रयोग किया जाता है, बाद मोती से जारी है और आगे IAM द्वारा alkylated.
  6. चरण 1.4 में दिखाए गए desalting के लिए रिवर्स चरण SPE स्तंभ का उपयोग करें।
  7. में सूखी पेप्टाइड्स को हल करने के बाद 20 $L के 0.1% formic एसिड (एफए), प्रत्येक अनुभाग के उत्पाद के साथ तरल क्रोमैटोग्राफी के लिए अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस /
    1. संशोधित आंग द्वितीय पेप्टाइड्स को एक 60 मिनट ढाल elution (0-8 मिनट, द्वारा अलग करें 2% बी; 8-10 मिनट, 5% बी; 10-35 मिनट, 18% बी; 35-50 मिनट, 28% बी; 50-52 मिनट, 80% बी; 52-58 मिनट, 80% बी; 58-59 मिनट, 2% बी; 59-60 मिनट, 2% बी) एक प्रवाह दर पर एच.0.30 मिनट/ सीधे उच्च संकल्प बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के साथ इंटरफेस है.
      नोट: विश्लेषणात्मक कॉलम में है 75 डिग्री मीटर आईडी, 150 मिमी लंबाई, सी-18 राल के साथ पैक. मोबाइल फेज ए में 0.1% फॉरेमिक एसिड शामिल था, और मोबाइल फेज बी में 100% एसीटोनिट्रिल और 0.1% फोरमिक एसिड शामिल था।
    2. डेटा-निर्भर अधिग्रहण मोड में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर संचालित, एक एकल पूर्ण स्कैन बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम सेट (300-1800 m/z, 60 000 संकल्प) 20 डेटा पर निर्भर एमएस /
    3. खुला बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम डेटा और रासायनिक प्रतिक्रिया सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया है की पुष्टि करने के लिए प्रत्येक चरण में उत्पाद की चोटियों की पहचान.

5. निट्रोपेप्टाइड का परिमाणीकरण

  1. चरण 1.4 से नाइट्रो-एंजियोटेन्सिन द्वितीय समाधान के 3 सेट तैयार करें, प्रत्येक सेट जिसमें नाइट्रो-एंजियोटेन्सिन II की 2 सांद्रता होती है: #1 सेट करें, ट्यूब ए में 20 एनमोल और ट्यूब बी में 20 एनमोल, प्रत्येक में 100l TEAB समाधान; #2, ट्यूब ब् में 10 nmol और ट्यूब डी में 20 nmol सेट, प्रत्येक में 100 l TEAB समाधान; #3, ट्यूब ई में 40 nmol और ट्यूब एफ में 10 nmol सेट, 100 l TEAB समाधान में प्रत्येक.
    नोट: प्रत्येक सेट में नाइट्रो-एंजियोटेन्सिन द्वितीय के दो सांद्रता डाइमेथिल लेबलिंग के लिए उपयोग किया जाता है, formaldehyde (प्रकाश) और formaldehyde-D2 (भारी), क्रमशः के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए.
  2. प्रत्येक सेट के लिए, क्रमशः प्रकाश और भारी के रूप में लेबल किए जाने वाले नमूने में 4% फार्मेल्डिहाइड और फॉर्मेल्डिहाइड-डी2 का 4 डिग्री एल जोड़ें। dimethyl लेबलिंग समाप्त करने के लिए 2.3 से 2.5 चरणों का पालन करें।
  3. प्रकाश और भारी लेबल नमूने मिक्स.
  4. कमी, biotinylation, संवर्धन, और पता लगाने के लिए 3.1 से 4.6 के लिए चरणों का पालन करें.

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Representative Results

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इस पांडुलिपि में निट्रोपेप्टाइड प्रोफाइलिंग का प्रवाह चित्र 1में दर्शाया गया है। चित्रा 2, 3, 4 और 5 एंजियोटेन्सिन द्वितीय, नाइट्रो-एंजियोटेन्सिन द्वितीय, डाइमेथिल लेबल नाइट्रो-एंजियोटेन्सिन द्वितीय और डाइमेथिल लेबल एमिनो एंजियोटेन्सिन द्वितीय के द्रव्यमान स्पेक्ट्रम को क्रमशः दिखाते हैं। यौगिक का आण्विक भार प्रत्येक अंक में मोनो-आइसोटोप शिखर के m/z मानों द्वारा परिलक्षित किया जा सकता है, जो प्रत्येक चरण के लिए एंजियोटेन्सिन II पर रासायनिक संशोधन को सफलतापूर्वक प्राप्त किया गया था। चित्र 6 चरण 4-7 में अंतिम उत्पाद को दर्शाता है और एलसी-एमएस/एमएस एस द्वारा अभिरूपित किया गया है। चित्र 7 डाइमेथिल लेबलिंग द्वारा निट्रोपाइड के मात्रात्मक परिणामों को दर्शाता है। प्रकाश और भारी की सापेक्ष मात्रा प्रत्येक समूह में मोनो आइसोटोप चोटी की तीव्रता की तुलना द्वारा निर्धारित की गई थी, जो हमें विभिन्न समूहों से समृद्ध nitropeptides मात्रा निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है.

Figure 1
चित्र 1 . नाइट्रो- एंजियोटेन्सिन II को समृद्ध और पहचानने के लिए रासायनिक व्युत्पत्ति विधि का कार्यप्रवाह। सबसे पहले, एंजियोटेन्सिन द्वितीय peroxynitrite द्वारा नाइट्रेट किया जाता है, desalting के बाद, dimethyl लेबलिंग पेप्टाइड पर प्राथमिक amine ब्लॉक करने के लिए प्रयोग किया जाता है. फिर सोडियम डाइथियोनेट का उपयोग एमिनोटिरोसिन में निट्रोटिरोसिन को कम करने के लिए किया जाता है, जो आगे एनएचएस-एस-एस-बायोटिन के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की जाती है। streptavidin मोती द्वारा समृद्ध करने के बाद, पेप्टाइड DTT द्वारा काटा जाता है alkylation द्वारा पीछा किया और LC-MS/MS द्वारा पता लगाया. यह आंकड़ा12, चित्र 2से संशोधित किया गया है । कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 . एंजियोटेन्सिन द्वितीय का द्रव्यमान स्पेक्ट्रम। यह आंकड़ा दिखाता है कि m/z 523.78 पर मोनो-आइसोटोप चोटी duple चार्ज पेप्टाइड (ऊपर) और ANgiotensin द्वितीय (नीचे) के एमएस / यह आंकड़ा12से संशोधित किया गया है , चित्र S2. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . नाइट्रो-एंजियोटेन्सिन द्वितीय का द्रव्यमान स्पेक्ट्रम। यह आंकड़ा दिखाता है कि m/z 546.28 पर मोनो-आइसोटोप चोटी duple चार्ज पेप्टाइड (ऊपर) और नाइट्रो-एंजियोटेन्सिन द्वितीय (नीचे) के एमएस / यह आंकड़ा12से संशोधित किया गया है , चित्र S2. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 . डाइमेथिल के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम नाइट्रो-एंजियोटेन्सिन द्वितीय लेबल। इस आंकड़े से पता चला कि m/z 560.29 पर मोनो-आइसोटोप चोटी duple चार्ज पेप्टाइड (ऊपर) और dimethyl लेबल नाइट्रो-एंजियोटेन्सिन द्वितीय (नीचे) के एमएस / यह आंकड़ा12से संशोधित किया गया है , चित्र S2. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 . डाइमेथिल के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम एमिनो एंजियोटेन्सिन द्वितीय लेबल. इस आंकड़े से पता चला कि m/z 545.31 पर मोनो-आइसोटोप चोटी duple चार्ज पेप्टाइड (ऊपर) और dimethyl लेबल एमिनो Angiotensin द्वितीय (नीचे) के एमएस / यह आंकड़ा12से संशोधित किया गया है , चित्र S2. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 . अंतिम उत्पाद का द्रव्यमान स्पेक्ट्रम। इस आंकड़े से पता चला कि m/z 617.82 पर मोनो-आइसोटोप चोटी डुप्लीकेड पेप्टाइड (अप) और अंतिम उत्पाद (मध्य) के एमएस/एमएस विखंडन पैटर्न और ज़ूम-इन स्पेक्ट्रम 400 से 1000 मीटर/z में अधिक विस्तृत विखंडन पैटर्न (नीचे) का मिलान किया गया . यह आंकड़ा12से संशोधित किया गया है , चित्र S2. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7 . डाइमेथिल लेबलिंग द्वारा निट्रोप्टिड के परिमाणीकरण परिणामों का द्रव्यमान स्पेक्ट्रम। हल्के से भारी अनुपात क्रमशः 1:1 (ऊपर), 1:2 (मध्य) और 4:1 (नीचे) हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

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यहाँ प्रोटोकॉल nitropeptide संवर्धन और रूपरेखा का वर्णन करता है. एंजियोटेन्सिन II को मॉडल पेप्टाइड के रूप में उपयोग करके, हमने चित्र 1में दर्शाई गई प्रक्रिया को सचित्र बनाया है। नाइट्रो-एंजियोटेन्सिन द्वितीय प्राप्त करने के बाद, पेप्टाइड पर प्राथमिक amine आगे amine संयोजन से बचने के लिए अवरुद्ध किया जाना चाहिए, जो प्रोटोकॉल के भीतर सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है. वर्तमान प्रोटोकॉल में, dimethyl लेबलिंग दो कारणों के लिए प्राथमिक amines ब्लॉक करने के लिए प्रयोग किया जाता है: पहले, यह मात्रात्मक परिणामों के अधिग्रहण में सक्षम बनाता है; दूसरा, इस प्रतिक्रिया के लिए लागत एनएचएस आधारित प्रतिक्रिया से कम है और अवरुद्ध दक्षता उच्च13है। परिमाणीकरण के लिए, मापित प्रकाश से भारी अनुपात अपेक्षित अनुपातों के बहुत निकट होते हैं (चित्र 7), त्रुटियों की गणना 10% से कम की जाती है।

प्रोटोकॉल का एक अन्य महत्वपूर्ण कदम सोडियम डाइथियोनेट द्वारा एमियोटोइरोसिन को डाइमेथिल लेबल पेप्टाइड पर 3-नीट्रोटोइरोसिन की कमी है, जो तेजी से और कुशलता से प्रतिक्रिया करता है। नए उत्पन्न एमिन समूह को आगे एनएचएस-एस-एस-बायोटिन से अधिक 4-5 गुना के साथ लेबल किया गया है। कम या अधिक एनएचएस-एस-बायोटिन से क्रमशः अपूर्ण लेबलिंग प्रतिक्रिया या अपूर्ण संवर्धन होगा। DTT पूरी तरह से disulfide बांड तोड़ सकते हैं और streptavidin मोती से समृद्ध पेप्टाइड जारी, जो IAM द्वारा alkylated और LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं.

यह प्रोटोकॉल जैव रासायनिक प्रणाली और कोशिकाओं या ऊतकों जैसे जैविक पदार्थों दोनों में निट्रोपेप्टाइड की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयुक्त है। चूंकि बायोटिन संवर्धन और आईएएम ऐल्किलेशन संवेदनशीलता को काफी बढ़ा सकते हैं, इसलिए कम मात्रा में प्रचुर मात्रा में निट्रोपेप्टाइड एमएस द्वारा डिटेक्टेबल हो जाते हैं। उदाहरण के लिए, हमने इस प्रोटोकॉल का उपयोग मरिन प्रोस्टेट और फेफड़ों के कार्सिनोमा मॉडल12से अलग घुसपैठ टी कोशिकाओं के अंतर्जात निट्रोपेप्टाइड्स को प्रोफाइल करने के लिए किया। हमने प्रोटीन एलसीके के नाइट्रो-टायर294 की पहचान की और कार्यात्मक अध्ययन किए जिससे पता चलता है कि यह संशोधन एमडीएससी12द्वारा इम्यूनोसुप्रेशन की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है।

हमारी तकनीक के आवेदन दो कारकों द्वारा सीमित है: पहले, कोशिकाओं और ऊतकों में nitropeptides की कम बहुतायत तय है कि कुछ nitropeptides की पहचान की जा सकती है; दूसरा, एमएस के अंतर्निहित कम पता लगाने संवेदनशीलता इस तरह के एकल सेल जीनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक अनुक्रमण के रूप में अत्यधिक संवेदनशील तरीकों के साथ तुलना में। हम कल्पना है कि अन्य रोग की स्थिति के लिए इस प्रोटोकॉल के आवेदन में मदद मिलेगी रोग प्रगति में पहले से अपरिचित कार्यों के साथ अधिक प्रोटीन नाइट्ट्रन PTMs परिभाषित.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम अमेरिकन कैंसर सोसायटी संस्थागत अनुसंधान अनुदान IRG-14-195-01 द्वारा समर्थित किया गया था (एम शेरोन स्टैक प्रधान अन्वेषक है; X.L. एक उप-प्राप्तकर्ता अन्वेषक है). इस प्रकाशन अनुदान संख्या KL2 TR002530 और UL1 TR002529 (ए शेखर, पीआई) से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, उन्नत अनुवाद विज्ञान, नैदानिक और अनुवाद विज्ञान पुरस्कार से आंशिक समर्थन के साथ संभव बनाया गया था. एक्स एल इंडियाना CTSI KL2 युवा अन्वेषक पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है. एस एफ वाल्टर कैंसर फाउंडेशन द्वारा समर्थित है बुनियादी कैंसर अनुदान Advanceing. X. डब्ल्यू चीन जनरल प्रोग्राम के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है (अनुदान नहीं 817773047).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acclaim pepmap 100 C18 column Thermo-Fisher 164534
1 M TEAB solution Sigma-Aldrich T7408
50% hydroxylamine Thermo-Fisher 90115
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Molecular Biology Grade
formaldehyde-D2 Toronto Research Chemicals F691353
formic acid Sigma-Aldrich 695076 ACS reagent
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
isoacetamide Sigma-Aldrich I1149
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
NHS-S-S-bition Thermo-Fisher 21441
Oasis HLB column (10 mg) Waters 186000383
peroxynitrite Merck-Millipore 516620
sodium cyanoborohydrite Sigma-Aldrich 42077 PhamaGrade
sodium dithionate Sigma-Aldrich 157953 Technical Grade
Streptavidin Sepharose GE Healcare GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC Thermo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Nitropeptide प्रोफ़ेशनल और पहचान एंजियोटेन्सिन द्वितीय द्वारा सचित्र
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Feng, S., Wen, X., Lu, X. Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II. J. Vis. Exp. (148), e59391, doi:10.3791/59391 (2019).More

Feng, S., Wen, X., Lu, X. Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II. J. Vis. Exp. (148), e59391, doi:10.3791/59391 (2019).

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