Summary

Perfilado e identificación de nitropéptidos ilustrados por Angiotensin A II

Published: June 16, 2019
doi:

Summary

El perfilado proteómico de las proteínas nitratodeadas por tirosina ha sido una técnica desafiante debido a la baja abundancia de la modificación de 3-nitrotirosina. Aquí describimos un enfoque novedoso para el enriquecimiento y perfilado de nitropéptidos mediante el uso de Angiotensin II como modelo. Este método se puede extender para otros sistemas in vitro o in vivo.

Abstract

La nitración proteica es una de las modificaciones post-traduccionales más importantes (PTM) en residuos de tirosina y puede ser inducida por acciones químicas de especies reactivas de oxígeno (ROS) y especies reactivas de nitrógeno (RNS) en células eucariotas. La identificación precisa de los sitios de nitración en las proteínas es crucial para comprender los procesos fisiológicos y patológicos relacionados con la nitración de proteínas, como la inflamación, el envejecimiento y el cáncer. Dado que las proteínas nitradas son de baja abundancia en células incluso en condiciones inducidas, no se han desarrollado métodos universales y eficientes para la elaboración de perfiles e identificación de sitios de nitración proteica. Aquí describimos un protocolo para el enriquecimiento de nitropéptidos mediante el uso de una reacción de reducción química y etiquetado de biotina, seguido de espectrometría de masas de alta resolución. En nuestro método, los derivados de nitropéptidos se pueden identificar con alta precisión. Nuestro método exhibe dos ventajas en comparación con los métodos reportados anteriormente. En primer lugar, el etiquetado de dimetil se utiliza para bloquear la amina primaria en nitropéptidos, que se puede utilizar para generar resultados cuantitativos. En segundo lugar, se utiliza un enlace de disulfuro que contiene reactivo de biotina NHS para el enriquecimiento, que se puede reducir y alquilar aún más para mejorar la señal de detección en un espectrómetro de masas. Este protocolo se ha aplicado con éxito al péptido modelo Angiotensin II en el documento actual.

Introduction

La nitración de residuos de tirosina en proteínas para formar 3-nitrotirosina regula muchos procesos biológicos. Debido a las diferentes propiedades químicas entre tirosina y 3-nitrotirosina, una proteína nitrada puede haber perturbado la actividad de señalización1,2. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos que puedan enriquecer e identificar los sitios de nitración en las proteínas de manera eficiente. Como la 3-nitrotirosina es una modificación de baja abundancia en las proteínas en comparación con otras formas de PTM, como la fosforilación y la acetilación, es difícil identificar los sitios de nitración endógenas directamente a partir de líneas celulares o muestras de tejido. Sin embargo, se ha desarrollado la metodología de uso de espectrometría de masas (Em) para caracterizar el patrón de fragmentación del nitrotpéptido (por ejemplo, Zhan & Desiderio3), que sienta las bases para nuevos métodos de nitroproteómica.

Actualmente, un paso de enriquecimiento seguido por la EMes la estrategia más poderosa para el perfilado de nitropéptidos 4,5. Los métodos de enriquecimiento se pueden clasificar en dos clases. Una clase se basa en anticuerpos que pueden reconocer 3-nitrotirosina específicamente, mientras que la otra clase se basa en la derivación química que reduce un grupo de nitro a un grupo de aminas4,5. Para el método basado en anticuerpos, la columna de afinidad de nitrotyrosina se utiliza para el enriquecimiento, a partir del cual el material eludado se resuelve y analiza más adelante por la alta resolución MS6,7. Para el método basado en derivación química, los grupos de amina en el N-terminus del péptido o lisina deben ser bloqueados en el primer paso ya sea por acetilación, etiquetas isobáricas para la cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ), o reactivos de etiquetas de masa en tándem (TMT). A continuación, se utiliza un reductor para reducir la nitrotirosina a la aminotyrosina seguido de la modificación del grupo de aminas recién formado, que incluye ligadura de biotina, conversión de péptido sulfícula u otros tipos de sistemas de etiquetado8,9, 10,11. La mayoría de los protocolos establecidos hasta ahora se basan en proteínas con sobrenitrato in vitro, en lugar de proteínas nitratos endógenas.

En el presente estudio, se desarrolla un procedimiento modificado de derivación química de nitrotirosina para el enriquecimiento e identificación de nitropéptidos, que muestra una mayor sensibilidad durante la detección de LA MS y es adecuado para fines de cuantificación. Nuestro estudio reciente que emplea este método en sistemas biológicos identificó que la nitración de la tetirosina quinasa de proteína específica de linfocitos (LCK) en Tyr394 por RNS producido a partir de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) juega un papel importante en el inmunosupresión del microambiente tumoral12. Por lo tanto, nuestro método de identificación de nitropéptidos también se puede aplicar a muestras biológicas complejas. Aquí, describimos nuestro protocolo utilizando el péptido modelo Angiotensin II, del cual el patrón de fragmentación es conocido y ampliamente utilizado en estudios nitroproteómicos8,9,10,11, como ejemplo.

Protocol

1. Nitration of Angiotensin II Para generar solución primaria de péptido nitrado, diluir 10 ml de solución padre de angiotensina II (DRVYIHPF) (2 mM en agua) en una solución de PBS de 390 ml (10 mM NaH2PO4,150 mM naCl, pH 7.4) a la concentración final de 50 oM. Añadir 10 l de peroxinitrita (200 mM en 4,7% NaOH) a la solución de Angiotensina II para realizar la concentración final de peroxinitrita de 5 mM.NOTA: La peroxinitrita es inestable y fácil de resolver cuando …

Representative Results

El diagrama de flujo para la elaboración de perfiles de nitropéptidos en este manuscrito se muestra en la Figura1. Las figuras 2, 3, 4 y 5 muestran los espectros de masa de Angiotensina II, nitro-angiotensina II, dimetil etiquetado nitro-angiotensina II y dimetil etiquetado como amino angiotensina II, respectivamente. El peso molecular del compuesto puede reflejarse en los valores m/z del pico mono-isótopo en…

Discussion

El protocolo aquí describe el enriquecimiento y perfilado de nitropéptidos. Utilizando Angiotensin II como péptido modelo, ilustramos el procedimiento que se muestra en la Figura1. Después de obtener la nitro-angiotensina II, la amina primaria en el péptido debe bloquearse para evitar la conjugación de amina adicional, que es uno de los pasos más críticos dentro del protocolo. En el protocolo actual, el etiquetado de dimetil según se utiliza para bloquear las aminas primarias por do…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la American Cancer Society Institutional Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon Stack es Investigador Principal; X.L. es un investigador subreceptor). Esta publicación fue posible gracias al apoyo parcial de Grant Numbers KL2 TR002530 y UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) de los Institutos Nacionales de Salud, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. X. L. es galardonado con el Premio Indiana CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. cuenta con el apoyo de las subvenciones Walther Cancer Foundation Advancing Basic Cancer. X. W. cuenta con el apoyo del Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 817773047).

Materials

Acclaim pepmap 100 C18 column Thermo-Fisher 164534
1 M TEAB solution Sigma-Aldrich T7408
50% hydroxylamine Thermo-Fisher 90115
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Molecular Biology Grade
formaldehyde-D2 Toronto Research Chemicals F691353
formic acid Sigma-Aldrich 695076 ACS reagent
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
isoacetamide Sigma-Aldrich I1149
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
NHS-S-S-bition Thermo-Fisher 21441
Oasis HLB column (10 mg) Waters 186000383
peroxynitrite Merck-Millipore 516620
sodium cyanoborohydrite Sigma-Aldrich 42077 PhamaGrade
sodium dithionate Sigma-Aldrich 157953 Technical Grade
Streptavidin Sepharose GE Healcare GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC Thermo

References

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Cite This Article
Feng, S., Wen, X., Lu, X. Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II. J. Vis. Exp. (148), e59391, doi:10.3791/59391 (2019).

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