Summary

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Published: June 16, 2019
doi:

Summary

Tirozin-nitrated proteinlerin proteomik profilleme 3-nitrotirozin modifikasyonunda düşük bolluk nedeniyle zorlu bir teknik olmuştur. Burada, nitropeptid zenginleştirme ve model olarak angiotensin II kullanarak profil oluşturma için yeni bir yaklaşım açıklanmaktadır. Bu yöntem diğer in vitro veya in vivo sistemlerde uzatılabilir.

Abstract

Protein nitrasyon, Tirozin kalıntılarının en önemli post-translasyonel değişikliklerinden (PTM) biridir ve ökaryotik hücrelerde reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve reaktif azot türlerinin (RNS) kimyasal eylemleri ile indüklenir. Proteinlerin nitrasyon sitelerinin kesin tanımlaması, inflamasyon, yaşlanma ve kanser gibi protein nitrasyon ile ilgili fizyolojik ve patolojik süreçleri anlamak için çok önemlidir. Nitrolanmış proteinler indüklenen koşullarda bile hücrelerde düşük bolluk olduğundan, protein nitrasyon sitelerinin profil oluşturma ve tanımlaması için hiçbir evrensel ve verimli yöntem geliştirilmiştir. Burada bir kimyasal azaltma reaksiyonu ve biotin etiketleme kullanarak nitropeptid zenginleştirme için bir protokol açıklayan, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi izledi. Bizim yöntemimizde, nitropeptid türevleri yüksek doğruluk ile tespit edilebilir. Yöntemimiz daha önce bildirilen yöntemlerle karşılaştırıldığında iki avantaj sergiler. İlk olarak, dimetil etiketleme, nicel sonuçlar oluşturmak için kullanılan nitropeptidler üzerinde primer Amin engellemek için kullanılır. İkincisi, NHS-biotin reaktif içeren bir disülfür bağ, daha fazla azaltılmış ve kütle spektrometresi üzerinde algılama sinyalini artırmak için alkylated zenginleştirme için kullanılır. Bu protokol, geçerli kağıda peptid angiotensin II modeline başarıyla uygulandı.

Introduction

Proteinleri 3-nitrotirozin oluşturmak için Tirozin kalıntılarının nitrasyon birçok biyolojik süreçleri düzenler. Tirozin ve 3-nitrotirozin arasındaki farklı kimyasal özellikler nedeniyle, nitoy proteini,1,2sinyalizasyon etkinliğini tedirgin olabilir. Bu nedenle, proteinlerin nitrasyon sitelerini verimli bir şekilde zenginleştirebilir ve tanımlayacak yöntemler geliştirmek önemlidir. 3-nitrotirozin, fosforilasyon ve asetilasyon gibi diğer PTM formlarına kıyasla proteinlerde düşük bir bolluk modifikasyonu olduğu için, endojen nitrasyon sitelerini doğrudan hücre hatlarından veya doku örneklerinden tespit etmek zordur. Bununla birlikte, nitrotpeptit parçalanma modelini karakterize etmek için kütle spektrometresi (MS) kullanma metodolojisi geliştirilmiştir (örneğin, Zhan & Desiderio3), yeni nitroproteomik yöntemlerin temelini oluşturur.

Şu anda, MS tarafından izlenen bir zenginleştirme adım nitropeptid profil4,5için en güçlü stratejisidir. Zenginleştirme yöntemleri iki sınıfa sınıflandırılabilir. Bir sınıf, özel olarak 3-nitrotirozin tanıyabilir antikorlar dayanmaktadır, diğer sınıf bir amin grubu için bir nitro grup azaltır kimyasal türetme dayanır ise4,5. Antikor tabanlı yöntem için, nitrotirozin benzeşimi sütun zenginleştirme için kullanılır, hangi elüe malzeme daha da çözülür ve yüksek çözünürlüklü MS ile analiz,6,7. Kimyasal türetme tabanlı yöntem için, peptid veya lizin N-Terminus Amin grupları asetilasyon, göreli ve mutlak niceleme (iTRAQ) veya tandem kütle etiketleri (TMT) reaktifler için isobarik Etiketler tarafından ilk adımda engellenmelidir. Sonra, bir redüksiyoner aminotyrosine nitrotirozin azaltmak için kullanılan yeni oluşturulan amin grubu değiştirerek takip, hangi biotin ligasyon içerir, sülphydril peptid dönüşüm, veya etiketleme sistemleri diğer türleri8,9, 10,11. Şimdiye kadar kurulan protokollerin çoğu, Endogenously nitrolanmış proteinler yerine in vitro Over-nitrolanmış proteinlere dayanmaktadır.

Bu çalışmada, nitrotirozin kimyasal türevisini değiştiren bir prosedür, MS algılama sırasında gelişmiş hassasiyet gösteren ve miktarlama amacı için uygun olan nitropeptid zenginleştirme ve tanımlaması için geliştirilmiştir. Bu yöntemi kullanılan biyolojik sistemlerde yapılan son çalışmamızda, miyeloid türevi bastırıcı hücrelerden (MDSCs) üretilen RNS tarafından Tyr394 de lenfosit-spesifik protein Tirozin kinaz (LCK) nitrasyon, önemli bir rol oynar tümör mikro bağışıklık bastırma12. Bu nedenle, nitropeptid tanımlama yöntemimiz karmaşık biyolojik örneklere de uygulanabilir. Burada, biz model peptid angiotensin II kullanarak protokollerimizi tarif, hangi parçalanma deseni bilinen ve yaygın nitroproteomik çalışmalar kullanılır8,9,10,11, örnek olarak.

Protocol

1. Anjiyotensin II nitrasyon Nitrolanmış peptid oluşturmak için, 390 μL PBS çözeltisi (10 mm Nah2Po4, 150 mm NaCl, pH 7,4) içinde 10 μL angiotensin II (drvyıpf) ebeveyn çözeltisi (su içinde 2 mm), 50 μM son konsantrasyonda seyreltilmiştir. 10 μL Peroksinitrit ekleyin (200 mm içinde 4,7% NaOH) Anjiyotensin II çözeltisi son konsantrasyon Peroksinitrit 5 mm yapmak.Not: Peroksinitrit dengesiz ve kolay asit formunda olduğunda çözmek için, böylece Peroksinit…

Representative Results

Bu yazıda nitropeptid profilleme için akış şeması Şekil 1′ de gösterilir. Şekil 2, 3, 4 ve 5 anjiyotensin ii kütle spektrumlarını göster, Nitro-Anjiyotensin II, DIMETIL etiketli Nitro-Anjiyotensin II ve dimetil etiketli amino Anjiyotensin II, sırasıyla. Bileşik molekül ağırlığı her rakam mono-izotop zirvesinde m/z değerleri ile yansıtılabilir, angiotensin II kimyasal modifikasyonu belirt…

Discussion

Burada protokol nitropeptid zenginleştirme ve profil açıklar. Model peptid olarak angiotensin II kullanarak, Şekil 1‘ de gösterilen prosedürü tasvir ettik. Nitro-Anjiyotensin II aldıktan sonra, peptit üzerinde primer Amin protokol içinde en önemli adımlardan biri olan daha fazla Amin konjugasyon, önlemek için engellenmelidir. Geçerli protokolde, dimetil etiketleme, primer aminleri iki nedenden dolayı engellemek için kullanılır: ilk olarak, nicel sonuçların satın alınma…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Amerikan Kanser Derneği kurumsal araştırma Grant ıRG-14-195-01 tarafından desteklenmektedir (M. Sharon Stack asıl araştırmacı; X.L. bir alt alıcı müfettişi). Bu yayın Grant Numbers KL2 TR002530 ve UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) Ulusal Sağlık Enstitüleri, translasyonel Bilimler, klinik ve translasyonel Bilimler Ödülü Ilerleyen Ulusal Merkezi ‘nden kısmi destek ile mümkün yapıldı. X. L. Indiana CTSı KL2 genç araştırmacı Ödülü sahibidir. S. F. Walther Cancer Foundation Ilerleyen temel kanser hibe tarafından desteklenmektedir. X. W. Ulusal Doğal Bilim Vakfı Çin genel programı tarafından desteklenmektedir (Grant No. 817773047).

Materials

Acclaim pepmap 100 C18 column Thermo-Fisher 164534
1 M TEAB solution Sigma-Aldrich T7408
50% hydroxylamine Thermo-Fisher 90115
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Molecular Biology Grade
formaldehyde-D2 Toronto Research Chemicals F691353
formic acid Sigma-Aldrich 695076 ACS reagent
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
isoacetamide Sigma-Aldrich I1149
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
NHS-S-S-bition Thermo-Fisher 21441
Oasis HLB column (10 mg) Waters 186000383
peroxynitrite Merck-Millipore 516620
sodium cyanoborohydrite Sigma-Aldrich 42077 PhamaGrade
sodium dithionate Sigma-Aldrich 157953 Technical Grade
Streptavidin Sepharose GE Healcare GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC Thermo

References

  1. Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
  2. Radi, R. Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects. Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).
  3. Zhan, X., Desiderio, D. M. MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin. Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).
  4. Batthyány, C., et al. Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects. Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).
  5. Feeney, M. B., Schöneich, C. Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).
  6. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).
  8. Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides. Talanta. 80, 1503-1512 (2010).
  9. Chiappetta, G., et al. Quantitative identification of protein nitration sites. Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).
  10. Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins. Current Protocols in Protein Science. , (2012).
  11. Zhang, Q., et al. A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples. Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).
  12. Feng, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).
  13. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).

Play Video

Cite This Article
Feng, S., Wen, X., Lu, X. Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II. J. Vis. Exp. (148), e59391, doi:10.3791/59391 (2019).

View Video