Summary
Hvis du vil reproducerbar tælle antallet af mRNAs i individuelle oocytter, enkelt molekyle RNA fluorescens in situ var hybridisering (RNA-fisk) optimeret til ikke-tilhænger celler. Oocytter blev indsamlet, hybridiseret med udskrift specifikke sonder og kvantificeres ved hjælp af et billede kvantificering software.
Abstract
Nuværende metoder, der rutinemæssigt anvendes til at kvantificere mRNA i oocytter og embryoner omfatter digitale reverse-transskription polymerase kædereaktion (dPCR), kvantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) og RNA sekvensering. Da disse teknikker er udført ved hjælp af en enkelt oocyt eller embryo, er lav-kopi mRNAs ikke pålideligt registreret. For at løse dette problem, kan æg eller embryoner samles sammen til analyse. men dette fører ofte til stor variation blandt prøver. I denne protokol beskriver vi brugen af fluorescens i situ hybridisering (FISH) ved hjælp af forgrenede DNA kemi. Denne teknik identificerer den rumlige mønster af mRNAs i individuelle celler. Når teknikken er kombineret med stedet at finde og spore computersoftware, kan overfloden af mRNAs i cellen også kvantificeres. Brug af denne teknik, der er nedsat variabilitet i en eksperimenterende gruppe og færre oocytter og embryoner er forpligtet til at påvise betydelige forskelle mellem eksperimentelle grupper. Kommercielt tilgængelige forgrenet DNA SM-fisk kits har været optimeret til at registrere mRNAs i sektioneret væv eller vedhængende celler på dias. Men oocyter effektivt overholder ikke dias og nogle reagenser i sættet var for hårdt, hvilket resulterer i oocyt lysering. For at forhindre denne lysis, blev flere ændringer foretaget til fisk kit. Specifikt, erstattet oocyt permeabilization og vask buffere designet til immunfluorescens af oocytter og embryoner leverandørejet bufferne. Permeabilization, vasker og inkubationer med sonder og forstærker blev udført i 6-godt plader og oocyter blev placeret på dias i slutningen af protokollen ved hjælp af montering medier. Disse ændringer var i stand til at overvinde begrænsningerne af den kommercielt tilgængeligt kit, navnlig oocyt lysering. For at præcist og reproducerbar tælle antallet af mRNAs i individuelle oocytter, blev computersoftware brugt. Sammen, repræsenterer denne protokol et alternativ til PCR og sekventering at sammenligne udtryk for specifikke udskrifter i enkelte celler.
Introduction
Reverse transkriptase Polymerasekædereaktionen (PCR) har været guldstandarden til mRNA-kvantificering. To assays, digital PCR (dPCR)1 og kvantitative, real time PCR (qPCR)2 bruges aktuelt. Af de to PCR teknikker har dPCR større følsomhed end qPCR tyder på, at det kunne bruges til at måle mRNA overflod i enkelte celler. Men i vores hænder, dPCR analyse af lav overflod mRNAs i puljer af 5 til 10 oocyter pr. hver eksperimentel prøve har produceret data med lav reproducerbarhed og høj variation3. Dette er sandsynligvis på grund af eksperimentelle fejl forbundet med RNA udvinding og reverse transkription effektivitet. RNA sekventering har også udført ved hjælp af en enkelt mus og menneskelige oocyter4,5. Denne teknik kræver cDNA forstærkning trin, der kræves for den bibliotek generation, hvilket sandsynligvis øger variation inden for en eksperimentel musikgruppe. Endvidere må lav overflod udskrifter ikke kunne påvises. Selvom sekventering priser er gået ned de sidste par år, kan det stadig være omkostningseffektivt uoverkommelige på grund af de høje udgifter til Bioinformatik analyser. Endelig, mRNA lokalisering er en dynamisk proces med rumlige ændringer bidrager til protein funktion6. Derfor, vi satte sig for at vedtage en teknik, der vil producere nøjagtige og reproducerbare kvantitative foranstaltninger og lokalisering af individuelle mRNAs i enkelt oocyter.
Forgrenede DNA koblet til fluorescens i situ hybridisering forstærker fluorescens signal snarere end forstærkende RNA/cDNA muliggør påvisning af enkelt mRNAs i enkelte celler 7,8,9. Analysen udføres gennem en række hybridisering, forstærkning (ved hjælp af forgrenede DNA) og fluorescens mærkning skridt for at forstærke fluorescens signal7. Teknikken, der begynder med bindingen af 18 - 25 base oligonukleotid sonde-par, der supplerer en specifik mRNA3,8,10. Femten til tyve sonde par er designet til hver afskrift sikring specificitet for target udskrift. MRNA-specifikke hybridisering er efterfulgt af pre-forstærker og forstærker sonder, der danner et forgrenet konfiguration. Ca, 400 etiket fluorophores binder til hver forstærker, hvilket resulterer i en 8000-fold stigning i fluorescens giver mulighed for påvisning af individuelle mRNAs (figur 1)11.
Figur 1: skematisk af SM-fisk protokol. Sekventiel hybridisering af udskrift specifikke sonde, forgrenet DNA forstærker og fluorophore til et mål mRNA er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tidligere undersøgelser ved hjælp af enkelt molekyle fluorescens i situ hybridisering (SM-fisk) lokaliseret β-actin mRNAs i individuelle neuroner12 og humant papillomvirus DNA i livmoderhalskræft celle linjer7. Computersoftware stedet at finde og programmet til sporing af identificerer enkelte punktformet fluorescerende signal og held har været anvendt til at opgøre antallet af mRNAs i hver celle3,13.
Baseret på resultaterne af mRNA påvisning i neuroner12, hypotese vi at SM-fisk ville vise sig at være et nyttigt redskab til at kvantificere udskrift niveauer i murine oocytter og embryoner herunder lav overflod mRNAs. Men teknikken er optimeret til brug med vedhængende fast celler og formaldehyd fast paraffin indlejret (FFPE) væv sektioner. Oocyter kan ikke overholde et dias, selv når de er belagt med Poly-L-lysin. Derudover er de mere skrøbelige end somatiske celler og væv sektioner resulterer i celle lysis når de udsættes for nogle af leverandørejet bufferne i kommercielt tilgængelige kits3. For at overvinde disse udfordringer, oocyter fast og manuelt overført mellem dråber af buffere. Desuden blev permeabilization og vask buffere i kits udskiftet for at reducere celle lysering. Foruddesignede sonder er købt sammen med fisk kit eller specifikke udskrifter kan bestilles. Hver proprietære sonde sæt er tilgængelige i en af tre fluorescens kanaler (C1, C2 og C3) at tillade multiplexing. I den aktuelle eksperiment var murine oocyter dual-farvede og kvantificeret ved hjælp af en C2 Nanog sonde og en C3 Pou5f1 sonde. Disse prober blev udvalgt på baggrund af de rapporterede udtryk for Nanog og Pou5f1 i oocytter og embryoner. Ved afslutningen af hybridisering trin blev oocyter placeret i dråber af anti-fade montering medier for ansøgning til histologisk dias. Konfokal billeder blev brugt til at opgøre antallet af punktformet fluorescerende signaler, som repræsenterer individuelle mRNAs. Ud over at kvantificere mRNAs, imaging viste også den geografiske fordeling af den specifikke mRNA i cellen, er som andre RNA kvantificering metoder ude af stand til at opnå. Denne teknik vist sig for at have lav variation inden for en eksperimentel musikgruppe der tillader anvendelse af mindre antal oocyter i hver eksperimentelle gruppe for at identificere væsentlige forskelle mellem eksperimentelle grupper3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animalske procedurer blev gennemgået og godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget på University of Nebraska-Lincoln og alle metoder blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og forordninger. For denne undersøgelse, outbred CD-1 mus havde ad libitum adgang til normale gnaver chow og vand; de blev opretholdt i en 12:12 mørke: lys cyklus.
1. forberedelse af krævede medier
- Base medier (OMM), tilføje 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO4og 1,7 mM CaCl2-2 H2O til 100 mL sterilt vand.
Bemærk: OMM medium kan opbevares i op til 1 måned. - For komplette medier (OMOPS), tilføje 20 mM 3-morpholinopropane-1-sulfonsyre syre (MOPPER), 1,2 mM MgSO4-7 H2O, 0,5 mM glucose, 6 mM L-lactat, 1 mM ala-Localisation, 0.1 mM taurin, 1 x ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 0,01 mM ethylendiamintetra syre ( EDTA), 10 µM alpha lipoinsyre, 10 µg/mL ufortyndet gentamicin, 21 mM 1 M NaOH, 5 mM NaHCO3, 0,2 mM pyruvat, 0,5 mM citrat, 4 mg/mL FAF BSA til en 1:10 fortynding af OMM i sterilt vand til et volumen på 100 mL. Sterilisere medium med et 0,22 µM filter.
Bemærk: OMOPS kan opbevares i op til 1 uge. - Tilføj 5% føtal bovint serum til OMOPS for bedriften medium (HM). Fyldes 2 mL HM per mus.
- For hyaluronidase opløsning tilsættes 0,1 mg/mL af hyaluronidase stammer fra kvæg testiklerne, til 1 mL HM.
- Til fiksation buffer kombinere 4% PARAFORMALDEHYD i 10 mL 1 x PBS sammen med 0,1% embryo grade polyvinylpyrrolidon (PVP)14.
- For at forberede 50 mL vaskebuffer (WB), tilsættes 0,1% nonionisk overfladeaktivt stof og 0,1% PVP til 1 x PBS14.
- Forberede 10 mL permeabilization buffer, tilføje 1% ikke - ioniske overfladeaktive til 1 x PBS14.
Bemærk: Vask og permeabilization buffere beskrevet ovenfor erstatte leverandørejet bufferne i de kommercielt tilgængelige kits.
2. indsamling af ægløsning oocytter fra hunmus
- Forberedelse:
- Stimulere hunmus på 5-8 ugens i alder af intraperitoneal (IP) injektion af 5 IU equine chorion gonadotropin (EKG) efterfulgt af 5 IU humant choriongonadotropin (hCG) 44-48 h senere15,16.
- Holde 35 mm petriskåle, der indeholder 2 mL af HM på en 37 ° C opvarmning plade. Med pipette udtages en, 100 µL dråbe HM indeholdende fortyndet hyaluronidase efterfulgt af tre, 50 µL dråber af HM uden hyaluronidase i en 60 mm petriskål. Placer plader der indeholder dråber på 37 ° C opvarmning plade før brug.
Bemærk: Hyaluronidase dråber bør foretages lige før dissektion af hvert oviduct par at forhindre fordampning og koncentration af komponenter af HM med eller uden hyaluronidase.
- Aflive mus, 16 h efter IP injektion af hCG, ved hjælp af isofluran overdosis efterfulgt af cervikal dislokation.
- Ren musen med 70% ethanol. Udsætte bughulen og visualisere den kvindelige forplantningsorganerne. Hold æggestokken med pincet og fjern uterin ledbånd og overskydende fedtvæv fra omkring æggestokkene. Skær oviduct fra livmoderen og sted æggestok-oviduct parret i den varme HM i 35 mm parabol.
- Fjerne æggestokken og enhver omkringliggende fedtvæv. Rive den hævede ampulla af oviduct ved hjælp af en ½ tomme 27-gauge kanyle. Skubbe ovidukten i stedet for at rive og cumulus celle-oocyt komplekser (p-piller) vil blive bortvist. Overføre de ovulated oocytter, som formodes at være i metafase II (MII) af meiose, til 100 μL drop indeholdende HM medier med hyaluronidase ved hjælp af en mund pipette (figur 2).
Figur 2 : Dele af munden pipette bruges til at overføre oocyter. (A) mund stykke (B) 0,22 um, 4 mm filter (C) indsugningsventil slanger (D) 1000 μL afpipetteres tip (E) 9" Pasteur pipette. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Der afpipetteres MII oocyt-cumulus celle komplekser op og ned i hyaluronidase indeholdende HM med munden pipette til dislodge cumulus celler. Overføre hver oocyt, når de er blottet for cumulus celler til en vask drop indeholdende HM kun bruger munden pipette. Gentag dette for hver vask slipværktøj. Overfør ikke fragmenteret eller gennemsigtig oocyter15.
Bemærk: Det er vigtigt at overføre oocytter fra hver dråbe i 35 mm fad med som lille HM som muligt. Dette er sandt for hver overførsel i protokollen. MII oocyter må ikke forblive i hyaluronidase indeholdende HM medium for mere end et minut.
3. SM-fisk farvning af oocyter
- Fix oocyter i en individuel godt af en 6-godt plade der indeholder 500 µL af fiksering Buffer. Nedsænkes 20 oocyter eller mindre i brønden. Ruger i 20 min. ved stuetemperatur.
Bemærk: Hver SM-fisk farvning trin sker inden for en individuel godt i en 6-godt konisk plade. Sikre, at oocyter helt nedsænket i buffere og ikke flydende på toppen af bufferen. Hvert trin skal udføres med 20 oocyter eller mindre i hver brønd. - Overfør faste oocytter til 500 μL af vaskebuffer (WB beskrevet taktfast 1,6) i 10 min. Gentag 2 gange mere.
- Inkuber oocyter i permeabilization buffer i 30 min. ved stuetemperatur.
Bemærk: Permeabilization buffer beskrevet taktfast 1.7 erstatter sømmelighed permeabilization buffer.- Samle sonde sæt og hurtigt spin dem ned i en microcentrifuge. Varm hver probe til 10 min i en 40 ° C vandbad eller varmeskab. Afkøles til stuetemperatur.
Bemærk: Dette trin skal udføres under permeabilization inkubation
- Samle sonde sæt og hurtigt spin dem ned i en microcentrifuge. Varm hver probe til 10 min i en 40 ° C vandbad eller varmeskab. Afkøles til stuetemperatur.
- Vask oocyter i 500 µL af WB i 10 min ved stuetemperatur.
- Overføre oocytter til 80 μl af Protease III Buffer (tilgængelig fra kit), der er fortyndet 1:8 i 1 X PBS, i 30 min. ved stuetemperatur.
Bemærk: 80 µL volumen tilstrækkeligt dækker bunden af en individuel godt i en 6-godt plade. - Vask oocyter i 500 µL af WB i 10 min ved stuetemperatur.
- Fortyndes de varmede sonde sæt for Nanog, Pou5f1, og DapB (en negativ kontrol gen), 1:50 i sonden fortyndingsmiddel. Inkuber oocyter i 80 μl af udskrift-specifikke sonden i 2 timer ved 40° C.
Bemærk: Hver proprietære sonde sæt er tilgængelige i en af tre fluorescens kanaler (C1, C2 og C3). Nanog og Pou5f1 sonderne blev markeret med C2 og C3, henholdsvis. - Varm proprietære, forstærker 1 (AMP 1), forstærker 2 (AMP2), forstærker 3 (AMP3) og forstærker 4-fluorescens (AMP 4-FL) ved stuetemperatur.
Bemærk: Dette trin skal udføres under 2 timers udskrift-specifikke sondens inkubationen. - Overførsel af oocytter til 500 μL af WB og inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur.
- Inkuber oocyter sekventielt i forstærkning buffere.
- Inkuber oocyter i 80 µL af AMP1 for 30 min. ved 40° C. overførsel oocytter til 500 µL af WB i 10 min ved stuetemperatur.
- Inkuber oocyter i 80 µL af AMP2 i 15 min. ved 40 ° C. Overføre oocytter til 500 µL af WB i 10 min ved stuetemperatur.
- Inkuber oocyter i 80 µL af AMP3 i 30 min. ved 40 ° C. Overføre oocytter til 500 µL af WB i 10 min ved stuetemperatur.
Bemærk: Resten af protokollen er udført i mørke, da AMP-FL indeholder fluorophore. Når du arbejder under dissekere mikroskop, reducere lyset så meget som muligt. - Tilføje oocytter til 80 μl AMP4-FL for 15 min ved 40° C.
Bemærk: AMP4-FL leveres som alternativ buffer-A (Alt-A), Alt-B eller Alt-C. Vælg den AMP4-FL buffer afhængige på hvilke emissionsnormerne bølgelængde ønskes.
- Vask oocyter i 500 µL af WB i 10 min ved stuetemperatur. Inkuber oocyter i 80 µL af DAPI i 20 min. ved stuetemperatur. Vask oocyter i 500 µL af WB for 5 min ved stuetemperatur.
- Med pipette overfoeres 12 µL af anti-fading montering medier på midten af et dias uden at tilføje bobler at reagenset. Overføre oocyter med som lille WB som muligt til montering medier og dækglas.
- Vippe coverslip i en vinkel og langsomt og forsigtigt placeres over væske på diaset. Undgå at trykke coverslip for svært at undgå forvridning af oocytter og indførelsen af bobler.
- Gemme diasene i en mørk kasse til tørre natten over ved stuetemperatur. Pels af dias i klar neglelak til at forsegle coverslip kanter.
- Brug en standard mikroskop til at finde oocyter på dias og cirkel med en permanent markør.
Bemærk: Dette trin er ikke påkrævet, men forbedrer lokalisering oocyter på diaset. For de bedste resultater, billede dias inden for 1 til 5 dage som de fluorescerende signal begynder at falme.
4. billed oparbejdelse
- Billede 3-dimensionelle oocytter, ved hjælp af z trin Konfokal mikroskopi.
Bemærk: For at nøjagtigt analysere billederne, hver z skridt bør være 1,0 µm/skive. - Gemme Konfokal billeder som en komprimeret nd2 eller individuelle. TIFF-filer for hver oocyt. Begge billedtyper er kompatibel med open source billede behandlingsprogram, Fiji.
- Hent og Installer den åbne adgang Fiji software (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- Træk nd2 filer i Fiji og vælg hyperstack. Hvis Konfokal billeder blev gemt som. TIFF-filer, skal du gå til trin 4.4.
Bemærk: Når filen nd2 er faldet i Fiji hyperstack dropdown bør vises automatisk. - Klik på fanen billede , Vælg farve, og klik på Opdel kanaler for at adskille de fluorescerende kanaler af filen nd2.
- Generere enkelte. TIFF-filer for hver z-skive af oocyt i hver fluorescerende kanal. Klik på fanen billede , Vælg stakke, og klik på Stack til billeder. Klik på fanen billede , Vælg Type, og klik på RGB-farve for at konvertere hver z skive til en enkelt RGB-farvebillede.
Bemærk: RGB-farve er kunstige og kan være valgt som ønskede for hver emission bølgelængde. - Gem hver konverterede billede som. TIFF-fil. Placer billeder fra en enkelt oocyt for hver fluorescerende kanal i en ny mappe for at undgå forvirring under syning (trin 4.3).
- Træk nd2 filer i Fiji og vælg hyperstack. Hvis Konfokal billeder blev gemt som. TIFF-filer, skal du gå til trin 4.4.
- Normalisere hver. TIFF-billede til Pou5f1 og Nanog ved hjælp af negativ kontrol billeder (DapB).
Bemærk: Normalisering udføres ved hjælp af et fotoredigeringsprogram. Sørg for at fjerne de samme niveauer af baggrunden fluorescens fra hver kontrol billede. - Åben hver normaliseret. TIFF-fil i Fiji at sy sammen alle z-skiver til hver oocyt i hver bølgelængde.
- Klik på fanen Plugins , vælge hæftning, og klik på Gitter/samling (figur 3A). Vælg Sekventielle billeder fra drop-down menuen og Klik på OK (figur 3B).
- Gennemse folkemusikkataloget og vælg den mappe, der indeholder alle de z-skive billeder til en individuel oocyt ved en bølgelængde (Se trin 4.3.4). Klik på OK.
- Flyt skyderen i bunden af den syet billede til den relevante farvekanal for bølgelængde bruges og oprette den endelige RGB-syet billede ved at klikke på billedet, vælge Type, og klik på RGB-farve.
Bemærk: Dette billede vil blive brugt til fluorescens kvantitering beskrevet taktfast 4.6 nedenfor.
- Konvertere den syet billede til 32-bit maksimale projicerede billede. Klik på billedet, skal du vælge Type, og klik på 32-bit (figur 3 c). Gem dette billede som en ny. TIFF-fil.
Figur 3 : Sammenstrikke Konfokal z-serie billeder af oocytter. (A) Screenshot viser værktøjet Plug-in gitter/samling i Fiji, der blev brugt til at fremstille sammensatte billeder af oocyt. (B) sekventielle billeder bruger fluorescens overlapning mellem sekventiel. TIFF-filer til at generere et sammensat billede. (C) det sammensatte billede blev gemt som en 32-bit. TIFF-fil. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Hent og Installer i stedet at finde og programmet til sporing af13, som er tilgængelige fra hjemmesiden for D.R. Larson, efterforsker på nationale institutter for sundhed National Cancer Institute (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson). Hent og Installer den åbne adgang virtuelle maskine til interaktive data sprog (IDL)-operativsystem, som er nødvendig for at køre i stedet at finde og Tracking Program (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf).
- Åbn den 32-bit, syet billede, som blev oprettet i trin 4.6 (figur 4A), i stedet at finde og Tracking Program. Vælg Oversæt dropdown og klik Oversæt (figur 4B), som vil beregne de antal steder fundet i billedet.
Bemærk: Hver plet tælles repræsenterer en individuel mRNA. Band pass og photon tærskel indstillinger vises i skærmbilledet (figur 4B). Standard for hver grænse indstilling blev anvendt for denne protokol. Repræsentant positive og baggrunden steder er vist (figur 4 c).
Figur 4 : Kvantificering af mRNAs ved hjælp af Spot Finder og sporing. (A) enkelte z-serie billeder blev syet sammen som beskrevet i figur 3 og gemmes som et 32-bit maksimale forventede. TIFF-fil. (B) sammensat billede blev åbnet i stedet Finder og sporing. Lokalisere blev brugt til at tælle de fluorescerende steder (rød boks). Band pass og photon tærskel er angivet med den blå boksen. (C) den blå pil peger på et positivt signal (tærskel). Den hvide pil viser en fluorescerende plet under tærsklen og derfor medregnes ikke. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter afslutningen af protokollen vil medføre enkelte billeder fra Konfokal z-serie (figur 4A og figur 5), syet billeder (fig. 4 c), og mRNA tæller (figur 4B). Når multiplexing er udført, vil der også være flettede billeder viser etiketten for to forskellige mRNAs (figur 5). MRNA tæller genereres ved hjælp af sammenflette billeder genereret af Fiji (figur 3) og punktformet fluorescens steder tælles ved hjælp af Spot at finde og Tracking Program (figur 4B).
MRNA tæller er senere analyseret ved hjælp af en standard data analyseværktøj. I denne protokol, vi mærket n = 12 oocyter med Pou5f1 og Nanog. Resultaterne for hver mRNA er gennemsnit af og standardafvigelsen på middelværdien beregnes. Data indsamlet i denne protokol, viste 775 ± 26 SEM Pou5f1 afskrifter og 113 ± 5 SEM Nanog afskrifter i MII oocyter (figur 5). Student's t-test bestemmes en statistisk signifikant forskel i mRNA tæller mellem Pou5f1 og Nanog. Vigtigere, der var ingen steder fundet i n = 5 oocytter, der er mærket med DapB sonde (dvs. negativ kontrol). Bemærk den lille standard fejl ved hjælp af kun 12 individuelle oocyter. Følsomheden af analysen understreges også af positive reproducerbar påvisning af Nanog(figur 5). Tidligere dPCR eksperimenter afsløre ikke reproducerbar Nanog angiver, at antallet af Nanog mRNAs i en individuel oocyt er under grænse påvisning ved hjælp af dPCR 3.
I pilotforsøg opdaget vi reduceret fluorescens, hvis der var en forsinkelse mellem fiksering af oocytter og indledningen af SM-fisk-protokollen. Ligeledes, hvis proprietært hybridisering buffere ikke anvendes, sonde og forstærkning forgrenede DNA ikke angiver cellen resulterer i fluorescens ringmærket omkring plasmamembran i oocyt. Dette er sandsynligvis på grund af opgørelse af grenede DNA. Ringmærket fluorescens omkring oocyt membran medfører også, hvis der er dårlig permeabilization af plasma membran. Der kræves også optimal nedbrydning af protein bundet til mRNAs. Protease bufferen findes i SM-fisk kit er i en optimal koncentration for behandling af væv sektioner og vedhængende celler. Når du bruger ikke-tilhænger celler, er det imidlertid vigtigt at empirisk identificere de bedste protease fortynding. For lidt protease buffer kan resultere i undercounting af mRNAs på grund af dårlig tilgængelighed af sonden til mRNA. På samme måde for meget protease kan resultere i forringelse af ikke kun protein bundet til mRNA men også destabilisering af mRNAs. I denne protokol, vi testede mRNA påvisning ved hjælp af en titreringskurven ufortyndet (1:1), 1:4, 1:8 og 1:12 fortyndet protease buffer i 1 x PBS (n = 2 til 3 oocyter pr. fortynding). Den gennemsnitlige fluorescerende udtryk af Pou5f1 mRNA i MII oocyter var 169 ± 42 SEM (ufortyndet), 176 ± 36 SEM (1:4), 308 ± 18 SEM (1:8), og 445 ± 24 SEM (1:12) (figur 6). Protease fortynding bruges i denne protokol var 1:8 som det viste den laveste variation.
Figur 5 : Pou5f1 og Nanog mRNA i MII oocyt. (A). repræsentative billeder af det midterste z-serie billede er vist til venstre. Pou5f1 er fundet i røde (647 nm) bølgelængde mens Nanog er opdaget i grønne (488 nm) bølgelængde. DAPI farvning af kromosomer justeret på metafase II spindel, karakteristisk for MII oocyt, er vist i hvid. Der var ingen farvning for DapB i enten 647 nm eller 488 nm emission bølgelængde. (B) antallet af Pou5f1 og Nanog mRNAs er vist som betyder SEM (n = 12 oocyter); der var ingen påvisning (Nielsen) af DapB. * Angiver P < 0,05, skalalinjen er 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Empirisk titrering af protease buffer til at optimere præcis optælling af mRNAs. Repræsentative billeder af SM-fisk af Pou5f1 i MII oocyter. DAPI farvning viser kromosomer justeret på MII spindel. Oocytter blev inkuberet med ufortyndet (1:1), 1:4, 1:8 eller 1:12 fortyndinger af Protease III buffer. Antallet af Pou5f1 mRNAs (n = 2-3 oocyter) blev talt og middelværdien SEM er vist. Skalalinjen er 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Overførsel af MII oocyter gennem fiksering, protease og hybridisering buffere i wells af en 6-godt plade. Form af hver brønd er vist. (A) celler flyde når først tilføjet til buffere (B) nedsænkningen af oocytter i buffere. (C) oocyter bilægge til bunden af en brønd under inkubationstiden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En række mindre trin under protokollen vil sikre vellykkede fluorescens og nøjagtige optællinger af mRNAs. Først skal protokollen udføres straks efter samling og fiksering af oocyter. Bemærk, at PVP er tilføjet til 4% PARAFORMALDEHYD fiksering buffer til at forhindre oocyter klistrer til hinanden. Vi fandt, at det er nødvendigt at udføre eksperimentet umiddelbart efter indsamling og fiksering af oocyter. Enhver forsinkelse resulterer i en meget lavere fluorescens signal, som ville resultere i undercounting af udskrifter. Dette skyldes til dels, at RNA nedbrydning. Ikke mere end 20 oocyter skal overføres til en brønd i 6-godt plade på én gang og hver godt bør kun bruges én gang. Inkuberingstider bør også følges præcist uden afkortning eller forlængelse af hvert trin. Undtagelsen er wash buffer trin; oocyter kan stå i wash buffer for en længere tid uden at ændre de eksperimentelle resultater. SM-fisk sonder er tilgængelige i tre fluorescens kanaler C1, C2 og C3. For multiplexing, Bland ikke sonder, der har samme kanal tag. Dette vil resultere i begge sonder fluorescerende på den samme udsender bølgelængde rendering analyse umuligt, da der vil være nogen måde at skelne mellem sonde sæt. Positiv kontrol sonder designet mod husholdning gener er tilgængelige i hver af de tre kanaler. Negativ kontrol sonder (f.eks. DapB) er også tilgængelige i forblandet sæt, der indeholder en kode for alle tre kanaler. Eksperimentet skal udføres i dæmpet belysning som oocyter er lysfølsomt efter fjernelse fra oviduct17,18. Efter tilsætning af fluorophores knyttet til AMP4, bør trinene udføres med som lille lys som muligt at forhindre blegning af fluorophore. Endelig, når du monterer oocyter på histologiske dias, omhyggeligt placere coverslip for at undgå fordrejning af oocyt og dannelsen af bobler, som kan forstyrre billeddannelse. Hvis du har svært ved at undgå celle forvrængning, bør dias afstandsstykker anvendes for at opretholde oocyt kugleform.
En væsentlig ændring af protokollen er udskiftning af permeabilization og vask buffere findes i kommercielt tilgængeligt kit. De proprietære protease og hybridisering buffere forudsat er barske miljøer for oocyter men er nødvendige for succes i protokollen. Hvis ubenyttet, er forstærkere ude af stand til at komme ind i cellen, som sandsynligvis skyldes opgørelse af grenede DNA. Flytning af oocytter fra disse barske miljøer til relativt mild permeabilization og vask buffere, designet til immunofluorescens14, viste sig at være tilstrækkelig for en vellykket gennemførelse af protokollen og samtidig forhindrede lysering af oocyter. Fordi oocyter og præimplantations embryoner ikke overholder en histologisk dias, en anden væsentlig ændring var at placere oocytter til buffere inden for et godt af en kultur parabol. Vi brugte en 6-godt embryo kultur plade. Hver brønd i pladen har tilspidset og skrå sider og en 8 mm flad i bunden (figur 7), som forbedrer oocyt opsving. Dette er især vigtigt som oocyter mister deres ildfaste egenskaber og bliver næsten gennemsigtige i hybridisering buffere.
Når du overfører oocytter fra godt til godt, er det vigtigt at sikre, at oocyter fuldt neddykket i løsningerne i hver brønd som celler vil flyde når først overføres til hver brønd (figur 7A). Når de er mekanisk nedsænket i buffer (figur 7B), vil de synke til bunden af brønden ved udgangen af inkubationen (figur 7C). Undtagelsen er AMP 1 og AMP 3; Når mekanisk nedsænket oocyter ikke helt bilægge til bunden af brønden. Du kan finde disse oocytter, skal du ændre flyet af fokus. Afpipetteres nøje og tæller antallet af celler bliver overført for at forhindre tab.
Flere enkelt molekyle fisk teknikker, der forstærker den fluorescerende signal, snarere end cDNA, herunder forgrenede DNA kemi, har været udviklet 9,19. Kommercielt tilgængelige kits har optimeret det forgrenede DNA SM-fisk metode til reproducerbar påvisning af individuelle mRNAs i væv sektioner eller vedhængende celler på en histologisk dias. Protokollen beskrevet her er blevet modificeret til brug med enkelt ikke-tilhænger celler (f.eks., oocytter og embryoner, præimplantations)3. Dette gør det muligt ikke kun specifikke og reproducerbare kvantificering, men også lokalisering af et mRNA i oocyt. Mens dette er en fordel af analysen, er der naturligvis begrænsninger. For eksempel, i modsætning til RNA-sekventering, kan ikke det identificere roman mRNAs. En yderligere begrænsning af protokollen er tilgængeligheden af udskrift-specifikke prober. Proprietære sonder er kommercielt tilgængelige fra de virksomheder, der sælger SM-fisk kits. Der er flere sonder, der er pre-made. Andre kan være designet af selskabet for enhver kommenteret mRNA ved hjælp af en objektiv algoritme10. Men hvis et mRNA er dårligt sekventeret det ville være vanskeligt at design sonder med høj specificitet. For korte udskrifter kan det også være vanskeligt at identificere nok sonde-par, der ikke krydsreagere med andre afskrifter, reducere specificiteten af analysen. Ligeledes, et mindre antal sonde sæt kan være utilstrækkelige til at producere fluorescens signal over tærsklen for registrering som positiv i stedet at finde og Tracking Program. I den samme retning, kan ikke udskrift varianter registreres med denne metode.
Trods de begrænsninger, der er beskrevet ovenfor, er der flere ansøgninger om SM-fisk. For eksempel data fra enkelt celle RNA-sekventering kunne valideres, især når celle numre er lille og svært at få (fx, oocytter og embryoner). Forstærkning af cDNA for PCR assays introducerer en eksperimentel fejl, som typisk er reduceret med en normalisering trin ved hjælp af data fra stabilt udtrykt husholdning gener. Temporal ændringer i oocyt gennem præ-implantation embryoner ændrer imidlertid også udtryk for husholdning gener. SM-fisk-protokollen forstærker fluorescens i stedet for cDNA. Derfor er der ingen krav til normalisering af udskrift-specifikke mRNA niveau at opnå reproducerbare resultater med lav variabilitet. Som følge af variabiliteten af PCR primer effektivitet kan forskelle i det absolutte antal forskellige mRNA arter ikke præcist sammenlignes inden for eller mellem celletyper. SM-fisk lokaliserer og kvantificerer mRNA. Det kan derfor bruges til at identificere, hvilke celler udtrykker mRNA i en blandet celle population. For eksempel, når oocyter vokser inden for primær eller sekundær follikler, hårsækken kan isoleres og dyrkes i calciumalginat perler20 men adskillelsen af oocyt fra somatiske celler er vanskeligt. Derfor, sekventering og PCR undersøgelser er blevet udført ved hjælp af blandet cellepopulationer. Brugen af SM-fisk kan bestemme hvis mRNAs registreres i somatiske celler eller oocyt af hårsækken. Endelig, SM-fisk har høj følsomhed og specificitet giver mulighed for påvisning af lav overflod afskrifter; for eksempel påvisning af Nanog i MII oocyter (figur 5).
Opbevaring og nedbrydning af mRNAs er vigtige lovgivningsmæssige mekanismer for protein udtryk. Post-Transcriptional regulering af oversættelse, opbevaring og nedbrydning er medieret af proteiner, der binder til mRNAs21. I øjeblikket, kan RNA-protein immunoprecipitation (RIP) rutinemæssigt udføres, når et stort antal celler er tilgængelige22. På grund af det store antal Xenopus æg, som kan indsamles fra en enkelt dyr, har RIP udført med succes i denne dyremodel. Det er imidlertid svært at få nok pattedyr oocyter og præ-implantation embryoner til at udføre RIP. Kobling af SM-fisk og immunofluorescens (immunoFISH) har 23 af væv sektioner potentiale til at visualisere proteiner forbundet med specifikke mRNAs herunder translationel maskiner24,25. Genomforskning måle genetiske varianter (f.eks. små nukleotid polymorfier, SNPs) forbundet med sundhed og sygdom26. Phenomics identificerer ændringer i cellulære svar på grund af miljøbelastning27,28. Aktuel forskning har til formål at finde den mekanisme, der forbinder ændringer i genomet med specifikke fænotyper. Brugen af immunoFISH har potentiale til at knytte SNP-afhængige ændringer i mRNA udtryk og udtryk for proteiner, der bidrager til cellulære fænotyper. Efterhånden som teknologien udvikles, er der sandsynligvis andre anvendelser af SM-fisk, som vil identificere vigtige mekanismer i flere biologiske systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at erklære
Acknowledgments
Vi takker Dr. Daniel R. Larson for hans generøse hjælp med installation og brug af i stedet at finde og programmet til sporing af 13 og teknisk støtte fra University of Nebraska Lincoln mikroskopi kerne for konfokalmikroskopi billeddannelse. Denne undersøgelse er et bidrag af University of Nebraska landbrugs forskning Division, Lincoln, Nebraska og blev støttet af UNL Hatch midler (NEB-26-206/tiltrædelse af-232435 og NEB-26-231/tiltrædelse nummer-1013511).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (±)-α-Lipoic acid | Sigma-Aldrich | T1395 | Alpha Lipoic Acid |
| Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid | MP Biomedicals, LLC | 199899 | FAF BSA |
| BD 10mL TB Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 10 mL syringe |
| BD PrecisionGlide Needle | Becton, Dickinson and Company | 305109 | 27 1/2 gauge needle |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | CaCl2-2H2O |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | Citrate |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | Glucose |
| Disodium phosphate | Na2HPO4 | ||
| Easy Grip Petri Dish | Falcon Corning | 351008 | 35 mm dish |
| Edetate Disodium | Avantor | 8994-01 | EDTA |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta biologicals | S10250 | FBS |
| Gentamicin Reagent Solution | gibco | 15710-064 | Gentamicin |
| GlutaMAX-I (100X) | gibco | 35050-061 | Glutamax |
| Gold Seal Micro Slides | Gold Seal | 3039 | 25 x 75mm slides |
| Gonadotropin, From Pregnant Mares' Serum | Sigma | G4877 | eCG |
| hCG recombinant | NHPP | AFP8456A | hCG |
| Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes | Sigma-Aldrich | H3884 | Hyaluronidase |
| Jewelers Style Forceps | Integra | 17-305X | Forceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw |
| L-(+)-Lactic Acid, free acid | MP Biomedicals, LLC | 190228 | L-Lactate |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M2773 | MgSO4-7H2O |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-Cl | NEAA |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-C | 25 x 25x 0.15 mm cover slips |
| Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe | Advanced Cell Diagnostics | 501891-C2 | Nanog Probe |
| Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe | Advanced Cell Diagnostics | 501611-C3 | Pou5f1 Probe |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Paraformaldehyde |
| PES 0.22 um Membrane -sterile | Millex-GP | SLGP033RS | 0.22 um filters |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P0930 | PVP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60128 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60218 | KH2PO4 |
| Prolong Gold antifade reagent | invitrogen | P36934 | Antifade reagent without DAPI |
| RNAscope DAPI | Advanced Cell Diagnostics | 320858 | DAPI |
| RNAscope FL AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 320852 | Amplifier 1 |
| RNAscope FL AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 320853 | Amplifier 2 |
| RNAscope FL AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 320854 | Amplifier 3 |
| RNAscope FL AMP 4 ALT A | Advanced Cell Diagnostics | 320855 | Amplifier 4 ALT A |
| RNAscope FL AMP 4 ALT B | Advanced Cell Diagnostics | 320856 | Amplifier 4 ALT B |
| RNAscope FL AMP 4 ALT C | Advanced Cell Diagnostics | 320857 | Amplifier 4 ALT C |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320851 | FISH Reagent Kit |
| RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics | 320871 | Negative Control |
| RNAscope Probe 3-plex Positive Control | Advanced Cell Diagnostics | 320881 | Positive Control |
| RNAscope Probe Diluent | Advanced Cell Diagnostics | 300041 | Probe Diluent |
| RNAscope Protease III | Advanced Cell Diagnositics | 322337 | Protease III |
| RNAscope Protease III & IV Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 322340 | FISH Protease Kit |
| RNAscope Protease IV | Advanced Cell Diagnostics | 322336 | Protease IV |
| S/S Needle with Luer Hub 30G | Component Supply Co. | NE-301PL-50 | blunt 30 gauge needle |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S6191 | NaCl |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 306576 | NaOH |
| Sodium pyruvate, >= 99% | Sigma-Aldrich | P5280 | Pyruvate |
| Solution 6 Well Dish | Agtechinc | D18 | 6 well dish |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | Taurine |
| Tissue Culture Dish | Falcon Corning | 353002 | 60 mm dish |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Triton X-100 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors. Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).
- Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos. Scientific Reports. 8 (1), 7930 (2018).
- Ruebel, M. L., et al. Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).
- Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).
- Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo. PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).
- Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
- Derti, A., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
- Larson, B., Malayter, D., Shure, M. Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging. BioTek Application Notes. , https://www.biotek.com/resources/application-notes/multiplexed-detection-of-cytokine-cancer-biomarkers-using-fluorescence-rna-in-situ-hybridization-and-cellular-imaging/ 1-5 (2016).
- Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. Single β-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability. Science. 343 (6169), 419-422 (2014).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).
- Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte. Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).
- Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice. Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).
- Hirao, Y., Yanagimachi, R. Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro. Journal of Experimental Zoology. , (1978).
- Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).
- Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).
- Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals. Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).
- Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs. Cells. 5 (1), 4 (2016).
- Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).
- Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution. Scientific Reports. 7 (1), 16459 (2017).
- Voigt, F., et al. Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).
- Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods in Enzymology. 572, Elsevier Inc. (2016).
- Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).
- Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nature Reviews Genetics. 11, 855 (2010).
- Freimer, N., Sabatti, C. The Human Phenome Project. Nature Genetics. 34, 15 (2003).
