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Genetics

एक अणु स्वस्थानी संकरण (एस-फिश) में फ्लोरोसेंट का उपयोग करना और मुरीन ओओसाइट्स में mRNAs का स्थानीयकरण करना ।

Published: April 24, 2019 doi: 10.3791/59414
Automatic Translation
1, 1
1Department of Animal Science, University of Nebraska-Lincoln

Summary

व्यक्तिगत अंडकोशिका में एमआरएनए की संख्या की गणना करने के लिए, स्वस्थानी संकरण (आरएनए-मछली) में एकल अणु आरएनए प्रतिदीप्ति गैर-आसंन कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया था । Oocytes एकत्र थे, प्रतिलिपि विशिष्ट जांच के साथ संकरण, और एक छवि परिमाणीकरण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मात्रा निर्धारित ।

Abstract

वर्तमान तरीकों में नियमित रूप से oocytes और भ्रूण में mrna मात्रा करने के लिए इस्तेमाल किया डिजिटल रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (dpcr), मात्रात्मक, वास्तविक समय आरटी पीसीआर (आरटी-qpcr) और आरएनए अनुक्रमण शामिल हैं । जब इन तकनीकों एक एकल अंडक या भ्रूण का उपयोग किया जाता है, कम कॉपी mrnas मज़बूती से पता नहीं कर रहे हैं । इस समस्या से उबरने के लिए, oocytes या भ्रूण विश्लेषण के लिए एक साथ एकत्र किया जा सकता है; हालांकि, यह अक्सर नमूनों के बीच उच्च परिवर्तनशीलता की ओर जाता है । इस प्रोटोकॉल में हम शाखायुक्त डीएनए रसायन का उपयोग करते हुए स्वस्थानी संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति के उपयोग का वर्णन करते हैं । यह तकनीक व्यक्तिगत कोशिकाओं में एमआरएनए के स्थानिक पैटर्न को पहचानती है । जब तकनीक हाजिर खोज और ट्रैकिंग कंप्यूटर सॉफ्टवेयर के साथ युग्मित है, सेल में mRNAs की बहुतायत भी मात्रा निर्धारित किया जा सकता है । इस तकनीक का प्रयोग, वहां एक प्रयोगात्मक समूह के भीतर परिवर्तनशीलता कम है और कम oocytes और भ्रूण के लिए प्रयोगात्मक समूहों के बीच महत्वपूर्ण मतभेदों का पता लगाने की आवश्यकता है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शाखित-डीएनए एसएम-फिश किटों को अनुकूलित किया गया है ताकि वे sectioned ऊतकों या स्लाइड पर आसंन कोशिकाओं में mRNAs का पता लगा सकें । हालांकि, oocytes प्रभावी ढंग से स्लाइड्स और किट में कुछ अभिकर्मकों का पालन नहीं कर रहे थे बहुत कठोर oocytes lysis में जिसके परिणामस्वरूप । इस लघटन को रोकने के लिए फिश किट में कई संशोधन किए गए । विशेष रूप से, अंडक पारभविलन और धोने अंडक और भ्रूण की इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए डिजाइन बफ़र्स मालिकाना बफ़र्स की जगह । पारभासी, washes, और जांच और एम्पलीफायर के साथ इन्क्यूबिशन्स 6-कूप प्लेटों में प्रदर्शन किया और oocytes बढ़ते मीडिया का उपयोग प्रोटोकॉल के अंत में स्लाइड पर रखा गया था. इन संशोधनों को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट की सीमाओं को दूर करने में सक्षम थे, विशेष रूप से, अंडक lysis । करने के लिए सही और प्रतिलिपि बनाने के लिए व्यक्तिगत oocytes में mRNAs की संख्या गिनती, कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया गया था । एक साथ, यह प्रोटोकॉल पीसीआर और अनुक्रमण के लिए एक विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है एकल कक्षों में विशिष्ट टेप की अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए ।

Introduction

रिवर्स-ट्रांसक्रिप्टेस पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) एमआरएनए क्वांटेशन के लिए गोल्ड स्टैंडर्ड रहा है । दो assays हैं, डिजिटल पीसीआर (डीपीपीसीआर)1 और मात्रात्मक, रीयल टाइम पीसीआर (qpcr)2 वर्तमान में उपयोग किया जाता है । दो पीसीआर तकनीकों में से, डीपीसीआर का यह सुझाव है कि यह एकल कोशिकाओं में एमआरएनए बहुतायत को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है qPCR की तुलना में अधिक संवेदनशीलता है । हालांकि, हमारे हाथ में, प्रत्येक प्रायोगिक नमूना प्रति 5 से 10 oocytes के पूल में कम बहुतायत mRNAs के dPCR विश्लेषण कम reproducibility और उच्च रूपांतर3के साथ डेटा का उत्पादन किया है । यह आरएनए निष्कर्षण और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन दक्षता से संबंधित प्रयोगात्मक त्रुटि के कारण होने की संभावना है । आरएनए अनुक्रमण भी एक माउस और मानव oocytes4,5का उपयोग किया गया है । इस तकनीक की आवश्यकता है cDNA प्रवर्धन कदम पुस्तकालय पीढ़ी है जो एक प्रयोगात्मक समूह के भीतर परिवर्तनशीलता बढ़ जाने की संभावना के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, कम बहुतायत टेप detectable नहीं हो सकता है । हालांकि अनुक्रमण कीमतों में पिछले कुछ वर्षों के नीचे चला गया है, यह अभी भी bioसूचनाविज्ञान विश्लेषण की उच्च लागत के कारण अत्यधिक लागत हो सकती है । अंत में, mRNA स्थानीयकरण प्रोटीन समारोह6के लिए योगदान स्थानिक परिवर्तन के साथ एक गतिशील प्रक्रिया है । इसलिए, हम एक तकनीक है कि सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मात्रात्मक उपायों और एकल oocytes में व्यक्तिगत mRNAs के स्थानीयकरण का उत्पादन होगा अपनाने के लिए निर्धारित किया है ।

शाखित डीएनए,स्वस्थाने संकरण में प्रतिदीप्ति के साथ मिलकर प्रतिदीप्ति संकेत के बजाय आरएनए/ परख संकरण की एक श्रृंखला के माध्यम से किया जाता है, प्रवर्धन (branched डीएनए का उपयोग करके), और प्रतिदीप्ति लेबलिंग चरणों के लिए प्रतिदीप्ति संकेत बढ़ाना7। यह तकनीक 18 से 25 आधार वाले ओलिनोन्यूक्लियोटाइड जांच युग्मों की बाइंडिंग से शुरू होती है जो एक विशिष्ट एमआरएनए3,8,10के पूरक होते हैं । पंद्रह से बीस जांच जोड़े लक्ष्य प्रतिलिपि के लिए विशिष्टता सुनिश्चित करने के प्रत्येक प्रतिलिपि के लिए डिजाइन किए हैं । Mrna-विशिष्ट संकरण पूर्व प्रवर्धक और प्रवर्धक जांच कि एक branched विन्यास फार्म का पालन किया जाता है । लगभग, ४०० लेबल fluorophores प्रत्येक एम्पलीफायर से बाइंड, प्रतिदीप्ति में एक ८००० गुना वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप व्यक्ति mRNAs का पता लगाने की अनुमति (चित्रा 1)11.

Figure 1
चित्रा 1: SM-मछली प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध । ट्रांसक्रिप्ट विशिष्ट प्रोब, शाखायुक्त डीएनए प्रवर्धक तथा फ्लुओरफोर को लक्ष्य एमआरएनए के अनुक्रमिक संकरण के रूप में दर्शाया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

पिछले अध्ययनों में स्वस्थानी संकरण में एकल अणु प्रतिदीप्ति (SM-FISH) स्थानीयकृत β-actin mrnas में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स12 और मानव पेपिलोमा वायरस डीएनए में सर्वाइकल कैंसर सेल लाइनों का उपयोग7. कंप्यूटर सॉफ्टवेयर स्पॉट ढूँढना और ट्रैकिंग प्रोग्राम व्यक्तिगत कबरा फ्लोरोसेंट संकेत की पहचान करता है और प्रत्येक सेल3,13में mrnas की संख्या को निर्धारित करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है ।

12ंयूरॉंस में mrna का पता लगाने के परिणामों के आधार पर, हम hypothesized कि एस. एम. मछली एक उपयोगी murine oocytes और कम बहुतायत mrna सहित भ्रूण में मात्रा प्रतिलेख के लिए उपकरण साबित होता है । हालांकि, तकनीक आसंन स्थिर कोशिकाओं और formaldehyde के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित है पैराफिन एंबेडेड (FFPE) ऊतक वर्गों । Oocytes एक स्लाइड का पालन नहीं कर सकते, तब भी जब वे पाली-एल-lysine के साथ लेपित हैं । इसके अलावा, वे कायिक कोशिकाओं और ऊतक वर्गों की तुलना में अधिक नाजुक होते हैं, जब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट3में मालिकाना बफ़र्स के कुछ के अधीन सेल lysis में जिसके परिणामस्वरूप । इन चुनौतियों से उबरने के लिए, oocytes तय की और मैंयुअल रूप से buffers की बूंदों के बीच स्थानांतरित किया गया । इसके अलावा, permeabilization और किट में धोने बफ़र्स सेल lysis को कम करने के लिए प्रतिस्थापित किया गया । Predesigned जांच मछली किट या विशिष्ट टेप के साथ खरीद रहे है अनुरोध किया जा सकता है । प्रत्येक मालिकाना जांच सेट multiplexing के लिए अनुमति देने के लिए तीन प्रतिदीप्ति चैनल (C1, C2 और C3) में से एक में उपलब्ध है । वर्तमान प्रयोग में, murine oocytes दोहरे दाग रहे थे और एक C2 nanog जांच और एक C3 Pou5f1 जांच का उपयोग कर मात्रा निर्धारित. इन जांच Nanog और oocytes और भ्रूण में Pou5f1 की रिपोर्ट अभिव्यक्ति के आधार पर चयन किया गया । संकरण कदम के समापन पर, oocytes विरोधी की बूंदों में रखा गया-फ़ेड बढ़ते मीडिया ऊतकीय स्लाइड के लिए आवेदन के लिए । Confocal छवियों कबरा फ्लोरोसेंट संकेतों जो व्यक्तिगत mRNAs का प्रतिनिधित्व की संख्या को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया । एमएनए के परिमाण के अतिरिक्त, इमेजिंग में कोशिका में विशिष्ट मृणा के स्थानिक वितरण को भी दर्शाया गया है, जो अन्य आरएनए प्रमात्रीकरण पद्धतियों को प्राप्त करने में असमर्थ है । इस तकनीक के लिए एक प्रयोगात्मक समूह में oocytes की छोटी संख्या के उपयोग की अनुमति एक प्रायोगिक समूह के भीतर कम परिवर्तनशीलता है साबित करने के लिए प्रयोगात्मक3समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर की पहचान ।

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Protocol

पशु प्रक्रियाओं की समीक्षा की और नेब्रास्का लिंकन विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया और सभी तरीकों प्रासंगिक दिशा निर्देशों और विनियमों के अनुसार प्रदर्शन किया गया । इस अध्ययन के लिए, सीडी-1 outbred चूहों सामान्य कृंतक चाउ और पानी के लिए विज्ञापन libitum का उपयोग किया था; वे एक 12:12 अंधेरे: प्रकाश चक्र में बनाए रखा गया ।

1. आवश्यक मीडिया की तैयारी

  1. आधार मीडिया के लिए (OMM), जोड़ें १०० mM NaCl, 5 मिमी KCl, ०.५ mM KH2पो4, And १.७ mM cacl 2-2h2ओ to १०० एमएल बाँझ पानी ।
    नोट: OMM माध्यम 1 महीने तक के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. पूर्ण मीडिया (OMOPS) के लिए, जोड़ें 20 मिमी 3-morpholinopropane-1-सल्फॉनिक एसिड (MOPS), १.२ मिमी MgSO4-7h2O, ०.५ मिमी ग्लूकोज, 6 मिमी एल लैक्टेट, 1 मिमी ala-gln, ०.१ मिमी taurine, 1x गैर आवश्यक अमीनो एसिड (neaa) ०.०१ EDTA), 10 μM अल्फा lipoic एसिड, 10 μg/एमएल undiluted जेंटॅमाइकिन, 21 मिमी 1 एम NaOH, 5 मिमी NaHCO3, ०.२ मिमी पाइरूवेट, ०.५ Mm साइट्रेट, 4 मिलीग्राम १०० 1:10/ एक ०.२२ μM फ़िल्टर के साथ माध्यम जीवाणुरहित ।
    नोट: OMOPS 1 सप्ताह तक के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
  3. होल्डिंग माध्यम (एचएम) के लिए OMOPS करने के लिए 5% भ्रूण गोजातीय सीरम जोड़ें । माउस प्रति 2 मिलीलीटर एचएम बनाओ ।
  4. Hyaluronidase समाधान के लिए गोजातीय वृषण से प्राप्त hyaluronidase के ०.१ मिलीग्राम/एमएल जोड़ने के लिए, 1 मिलीलीटर एचएम.
  5. निर्धारण बफर के लिए 1 x पीबीएस के 10 मिलीलीटर में 4% पैराफॉर्माल्डिहाइड ०.१% भ्रूण ग्रेड पॉलीवाइनिलपाइरोलीडन (PVP)14के साथ गठबंधन ।
  6. ५० मिलीलीटर वॉश बफर (डब्ल्यूबी) तैयार करने के लिए, ०.१% गैर ईओण surfactant और ०.१% PVP 1x PBS14जोड़ें ।
  7. 10 मिलीलीटर permeabilization बफर तैयार करने के लिए, 1x PBS14के लिए 1% गैर ईओण surfactant जोड़ें ।
    नोट: धोने और permeabilization बफ़र्स के ऊपर वर्णित व्यावसायिक उपलब्ध किट में मालिकाना बफ़र्स की जगह ।

2. महिला चूहों से ovulated oocytes का संग्रह

  1. तैयारी:
    1. Intraperitoneal (आईपी) के इंजेक्शन से उम्र के 5-8 सप्ताह में महिला चूहों को उत्तेजित 5 iu घोड़े chorionic गोनॉडोट्रॉफिन (ईसीजी) 5 iu मानव chorionic गोनॉडोट्रॉफिन के बाद (एचसीजी) 44-48 एच बाद में15,16.
    2. एक ३७ डिग्री सेल्सियस वार्मिंग की थाली पर एचएम के 2 मिलीलीटर युक्त ३५ मिमी पेट्री व्यंजन रखें । एक ६० mm पेट्री डिश में hyaluronidase बिना एचएम के तीन, ५० μL बूंदों के बाद पतला hyaluronidase युक्त एचएम के pipette एक, १००-μL ड्रॉप । प्लेस का उपयोग करने से पहले ३७ डिग्री सेल्सियस वार्मिंग प्लेट पर बूंदों युक्त प्लेटें ।
      ध्यान दें: hyaluronidase बूंदों के साथ या बिना hyaluronidase एचएम के घटकों के वाष्पीकरण और एकाग्रता को रोकने के लिए प्रत्येक अंडवाहिनी जोड़ी के विच्छेदन से पहले किया जाना चाहिए ।
  2. चूहों euthanize, 16 एच एचसीजी के आईपी इंजेक्शन के बाद, isoflurane ओवरडोज का उपयोग कर ग्रीवा अव्यवस्था के बाद ।
  3. ७०% इथेनॉल का उपयोग कर माउस को साफ करें । उदर गुहा का पर्दाफाश और महिला प्रजनन पथ कल्पना । अंडाशय को संदंश से रोके रखें और गर्भाशय स्नायुबंधन और अधिक वसा वाले ऊतक को अंडाशय के चारों ओर से हटा दें । अंडवाहिनी को गर्भाशय से काटें और ३५ mm डिश में ओवरी-ओवीडक्ट पेयर को गर्म एचएम में रखें ।
  4. अंडाशय और किसी भी आसपास के वसा ऊतक निकालें । अंडवाहिनी के सूज तुंबिका को 1/2 इंच के 27-गेज सुई के प्रयोग से फाड़ डालेंगे । अंडवाहिनी को अश्रु के स्थल पर धकेलें तथा कपासी कोशिका-अंडकोशिका कॉंप्लेक्स (सीओसीएस) निष्कासित कर दिए जाएंगे । एक मुंह पिपेट का उपयोग hyaluronidase के साथ एचएम मीडिया युक्त १०० μl ड्रॉप करने के लिए, जो meiosis के मध्यावस्था द्वितीय (mii) में माना जाता है ovulated oocytes, स्थानांतरण (चित्रा 2) ।

Figure 2
चित्रा 2 : मुंह pipettor के कुछ हिस्सों oocytes हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया । (क) मुंह का टुकड़ा (ख) ०.२२ उम, 4mm फिल्टर (ग) चूषित्र टयूबिंग (घ) १००० μl पिपेट टिप (ई) 9 "पाश्र पिपेट । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

  1. पिपेट, मीआई अंडकोशिका कपासी कोशिका परिसर ऊपर और नीचे hyaluronidase मुंह पिपेट के साथ एचएम युक्त कपासी कोशिकाओं को उखाड़ फेंकना करने के लिए । प्रत्येक oocyte स्थानांतरण, एक बार वे केवल मुंह pipette का उपयोग एचएम युक्त धोने ड्रॉप करने के लिए मेघरस कोशिकाओं से रहित हैं । प्रत्येक धोने droplet के लिए इस दोहराएं । खंडित या पारदर्शी oocytes15स्थानांतरित न करें ।
    नोट: यह के रूप में संभव के रूप में थोड़ा एचएम के साथ ३५ mm पकवान में प्रत्येक बूंद से oocytes स्थानांतरण करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह प्रोटोकॉल में हर स्थानांतरण के लिए सही है । MII oocytes एक मिनट से अधिक के लिए एचएम मध्यम युक्त hyaluronidase में नहीं रहना चाहिए.

3. एस-मछली Oocytes के धुंधला

  1. एक 6 अच्छी तरह से निर्धारण बफर की ५०० μL युक्त थाली के एक व्यक्ति में अच्छी तरह से oocytes फिक्स । 20 oocytes या अच्छी तरह से कम में डूब । कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
    नोट: प्रत्येक एसएम-मछली धुंधला कदम एक अच्छी तरह से एक 6-अच्छी तरह से शंक्वाकार प्लेट में एक व्यक्ति के भीतर होता है । सुनिश्चित करें कि oocytes पूरी तरह से बफ़र्स में डूबे हुए हैं और बफर के शीर्ष पर चल नहीं । प्रत्येक चरण 20 oocytes या प्रत्येक अच्छी तरह से कम के साथ किया जाना चाहिए ।
  2. ५०० μL धोने बफर के लिए फिक्स्ड oocytes हस्तांतरण (WB चरण १.६ में वर्णित) प्रत्येक के लिए 10 मिनट. दोहराएं 2 अधिक बार ।
  3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए permeabilization बफर में oocytes इनक्यूबेट ।
    नोट: permeabilization चरण १.७ में वर्णित बफर औचित्य permeabilization बफर बदलता है ।
    1. जांच सेट इकट्ठा और जल्दी से उंहें एक microकेंद्रापज में नीचे स्पिन । एक ४० डिग्री सेल्सियस जल स्नान या इनक्यूबेटर में 10 मिनट के लिए सेट प्रत्येक जांच गर्म । कमरे के तापमान को शांत ।
      नोट: यह कदम permeabilization ऊष्मायन के दौरान किया जाना चाहिए
  4. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पश्चिम बंगाल के ५०० μL में oocytes धो लें ।
  5. Oocytes स्थानांतरित करने के लिए ८० Μase III बफर (किट से उपलब्ध), कि 1:8 पतला है 1X PBS में, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ।
    नोट: ८० μL मात्रा पर्याप्त रूप से एक 6-कूप प्लेट में एक व्यक्ति के नीचे अच्छी तरह से शामिल हैं ।
  6. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पश्चिम बंगाल के ५०० μL में oocytes धो लें ।
  7. Nanog, Pou5f1 के लिए गरम जांच सेट पतला, और dapb (एक नकारात्मक नियंत्रण जीन), जांच में 1:50 diluent । ४० डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए ट्रांसक्रिप्ट-स्पेसिफिक प्रोब के ८० μL में ओओसाइट्स को इनक्यूबेट करते हैं ।
    नोट: प्रत्येक मालिकाना जांच सेट तीन प्रतिदीप्ति चैनल (C1, C2 और C3) में से एक में उपलब्ध है । Nanog और Pou5f1 जांच क्रमशः C2 और C3 के साथ टैग किए गए थे ।
  8. गर्म स्वामित्व, एम्पलीफायर 1 (AMP 1), एम्पलीफायर 2 (AMP2), एम्पलीफायर 3 (AMP3) और प्रवर्धक 4-फ्लोरेसेंस (AMP 4-FL) कमरे के तापमान पर.
    नोट: यह चरण 2-घंटे ट्रांसक्रिप्ट-विशिष्ट प्रोब इंक्यूबेशन के दौरान किया जाना चाहिए ।
  9. Oocytes पश्चिम बंगाल के ५०० μL के लिए स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
  10. प्रवर्धन बफ़र्स में अंडकोशिका को क्रमिक रूप से सेते हैं ।
    1. ८० μL में ओओसाइट्स को 30 मिनट के लिए ४० डिग्री सेल्सियस पर, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए oocytes ५०० μL के लिए AMP1 ।
    2. ४० डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए AMP2 की μl ८० में ओओसाइट्स को इनक्यूबेट । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए oocytes ५०० μL पश्चिम बंगाल के लिए स्थानांतरण ।
    3. ४० डिग्री सेल्सियस पर AMP3 के लिए 30 मिनट के लिए ८० μL में oocytes इनक्यूबेट । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए oocytes ५०० μL पश्चिम बंगाल के लिए स्थानांतरण ।
      नोट: प्रोटोकॉल के शेष के अंधेरे में किया जाता है क्योंकि AMP-FL fluorophore शामिल हैं. जब विदारक माइक्रोस्कोप के तहत काम कर, प्रकाश के रूप में जितना संभव हो कम ।
    4. Oocytes ८० μL AMP4-FL के लिए ४० ° C पर 15 मिनट के लिए जोड़ें ।
      नोट: AMP4-FL वैकल्पिक बफर के रूप में प्रदान की जाती है-ए (Alt-A), Alt-B या Alt-C. चुनें AMP4-FL बफर निर्भर है जिस पर उत्सर्जन तरंगदैर्घ्य वांछित है ।
  11. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पश्चिम बंगाल के ५०० μL में oocytes धो लें । कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए DAPI के ८० μL में ओयोसाइट्स को इनक्यूबेट करते हैं । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पश्चिम बंगाल के ५०० μL में oocytes धो लें ।
  12. Pipette विरोधी लुप्त होती बढ़ते मीडिया के reagent बुलबुले जोड़ने के बिना एक स्लाइड के केंद्र पर 12 μL । बढ़ते मीडिया में संभव के रूप में थोड़ा डब्ल्यूबी के साथ oocytes स्थानांतरण और एक coverslip लागू होते हैं ।
    1. एक कोण पर coverslip झुकाव और धीरे और धीरे स्लाइड पर तरल पर जगह है । Oocytes और बुलबुले की शुरुआत की विरूपण को रोकने के लिए भी मुश्किल coverslip दबाने से बचें.
    2. कमरे के तापमान पर रात भर सूखने के लिए स्लाइड्स को अंधेरे बॉक्स में स्टोर करें । कोट साफ नेल पॉलिश में स्लाइड के किनारों coverslip सील करने के लिए ।
  13. एक स्थायी मार्कर के साथ स्लाइड और सर्कल पर oocytes खोजने के लिए एक मानक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें ।
    नोट: यह चरण आवश्यक नहीं है लेकिन स्लाइड पर oocytes का पता लगाने में सुधार करता है । सर्वश्रेष्ठ परिणामों के लिए, 1 से 5 दिनों के भीतर छवि स्लाइड फ्लोरोसेंट संकेत के रूप में फीका शुरू हो जाएगा ।

4. छवि प्रसंस्करण

  1. 3-आयामी oocytes छवि, जेड कदम संनाभि माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर ।
    नोट: छवियों का सही विश्लेषण करने के लिए, प्रत्येक जेड कदम १.० μm/
  2. संनाभि छवियों को एक संपीड़ित nd2 या व्यक्ति के रूप में सहेजें । प्रत्येक oocyte के लिए TIFF फ़ाइलें । दोनों छवि प्रकार खुला स्रोत छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम, फिजी के साथ संगत कर रहे हैं ।
  3. डाउनलोड और ओपन एक्सेस फिजी सॉफ्टवेयर (https://imagej.net/Fiji/Downloads) स्थापित करें ।
    1. Nd2 फ़ाइलों को फिजी में खींचें और हाइपरस्टैकचुनें । यदि संनाभि छवियों के रूप में सहेजा गया था । TIFF फ़ाइलें चरण ४.४ करने के लिए छोड़ें ।
      नोट: जब nd2 फ़ाइल फिजी में ड्रॉप की गई है hyperstack ड्रॉपडाउन स्वचालित रूप से प्रकट होना चाहिए ।
    2. छवि टैब पर क्लिक करें, रंगका चयन करें, और nd2 फ़ाइल के फ्लोरोसेंट चैनल को अलग करने के लिए चैनल विभाजित क्लिक ।
    3. व्यक्तिगत उत्पंन करते हैं । प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल में अंडक के प्रत्येक z-स्लाइस के लिए TIFF फ़ाइलें । छवि टैब क्लिक करें, स्टैकचुनें, और छवियों के लिए स्टैकक्लिक करें । छवि टैब क्लिक करें, प्रकारचुनें, और प्रत्येक z स्लाइस को एक अलग rgb रंग छवि में कनवर्ट करने के लिए rgb रंग क्लिक करें ।
      नोट: आरजीबी रंग कृत्रिम है और प्रत्येक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के लिए वांछित के रूप में चुना जा सकता है ।
    4. प्रत्येक कनवर्ट की गई छवि को इस रूप में सहेजें । TIFF फ़ाइल । एक नया फ़ोल्डर में प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल के लिए एक एकल अंडक से जगह छवियों सिलाई के दौरान भ्रम की स्थित से बचने के लिए (कदम ४.३) ।
  4. प्रत्येक को सामान्य । Pou5f1 और nanog नकारात्मक नियंत्रण छवियों (dapb) का उपयोग करने के लिए TIFF छवि ।
    नोट: किसी फ़ोटो संपादन प्रोग्राम का उपयोग करके सामांयीकरण किया जाता है । प्रत्येक नियंत्रण छवि से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के एक ही स्तर को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें ।
  5. प्रत्येक सामान्यीकृत खोलें । फिजी में TIFF फ़ाइल प्रत्येक तरंग दैर्ध्य में प्रत्येक अंडकोशिका के लिए सभी z-स्लाइस एक साथ सिलाई करने के लिए ।
    1. प्लगइंस टैब क्लिक करें, सिलाईचुनें, और ग्रिड पर क्लिक करें / ड्रॉप-डाउन मेनू से अनुक्रमिक छवियां चुनें और ठीक क्लिक करें (चित्र 3b) ।
    2. निर्देशिका ब्राउज़ करें और एक तरंग दैर्ध्य पर एक व्यक्ति अंडक के लिए जेड स्लाइस छवियों के सभी युक्त फ़ोल्डर का चयन करें (कदम 4.3.4 देखें) । क्लिक करें, ok।
    3. इस्तेमाल तरंगदैर्ध्य के लिए उपयुक्त रंग चैनल के लिए सिले छवि के तल पर स्लाइडर हटो और छविपर क्लिक करके अंतिम rgb सिले छवि बनाने के लिए, प्रकारका चयन, और आरजीबी रंगक्लिक करें ।
      नोट: इस छवि के नीचे चरण ४.६ में वर्णित प्रतिदीप्ति quantitation के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  6. सिले छवि ३२-बिट अधिकतम अनुमानित चित्र में कनवर्ट करें । छविक्लिक करें, प्रकारचुनें, और ३२-बिट (चित्र 3c) क्लिक करें । इस छवि को नए के रूप में सहेजें । TIFF फ़ाइल ।

Figure 3
चित्रा 3 : संनाभि z-oocytes की श्रृंखला छवियों के साथ सिलाई । (A) फ़िजी में प्लग-इन ग्रिड/संग्रह टूल दिखा रहा है जिसका उपयोग oocyte की समग्र छवियों का उत्पादन करने के लिए किया गया था । (ख) अनुक्रमिक चित्र अनुक्रमिक के बीच प्रतिदीप्ति अतिव्याप्ति का उपयोग करता है । एक मिश्रित छवि जनरेट करने के लिए TIFF फ़ाइलें । (ग) समग्र छवि को ३२-बिट के रूप में सहेजा गया था । TIFF फ़ाइल । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

  1. डाउनलोड करें और स्पॉट ढूंढना और ट्रैकिंग कार्यक्रम13, जो D.r. larson, राष्ट्रीय स्वास्थ्य राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson) के नेशनल इंस्टीट्यूट में एक अन्वेषक के लिए वेबसाइट से उपलब्ध है स्थापित करें । डाउनलोड करें और खोलें access वर्चुअल मशीन के लिए सहभागी डेटा भाषा (IDL) ऑपरेटिंग सिस्टम जो स्पॉट ढूँढना और ट्रैकिंग प्रोग्राम को चलाने के लिए आवश्यक है (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf) स्थापित करें ।
  2. ३२-bit, सिले छवि है, जो चरण ४.६ में उत्पंन किया गया था खोलो (चित्रा 4a), स्पॉट ढूंढना और ट्रैकिंग कार्यक्रम में । Localize ड्रॉपडाउन का चयन करें और localize (चित्रा 4b), जो छवि में पाया संख्या स्थानों की गणना करेगा क्लिक ।
    नोट: प्रत्येक स्थान गिना एक व्यक्ति mRNA का प्रतिनिधित्व करता है । बैंड पास और फोटॉन दहलीज सेटिंग्स स्क्रीनशॉट में दिखाए जाते हैं (चित्रा 4b). इस प्रोटोकॉल के लिए, प्रत्येक थ्रेशोल्ड सेटिंग के लिए डिफ़ॉल्ट का उपयोग किया गया था । प्रतिनिधि धनात्मक और पृष्ठभूमिक धब्बे दर्शाए गए हैं (चित्र 4c) ।

Figure 4
चित्रा 4 -स्पॉट फाइंडर और ट्रैकिंग का उपयोग करके एमआरएनए का परिमाणीकरण । (क) व्यक्तिगत जेड-श्रृंखला छवियों को एक साथ सिले गए जैसा कि चित्र 3 में वर्णित किया गया है और ३२-बिट अधिकतम प्रक्षेपित के रूप में सहेजा गया है । TIFF फ़ाइल । (ख) स्पॉट फाइंडर और ट्रैकिंग में संयुक्त छवि खोली गई थी । स्थानीय बनाना फ्लोरोसेंट स्पॉट (लाल बॉक्स) गिनती करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । बैंड पास और फोटॉन दहलीज ब्लू बॉक्स द्वारा संकेत कर रहे हैं. (ग) नीला तीर किसी धनात्मक संकेत (सीमा से ऊपर) को इंगित करते हैं । सफेद तीर दहलीज के नीचे एक फ्लोरोसेंट स्थान से पता चलता है और, इसलिए, नहीं गिना । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Representative Results

प्रोटोकॉल के पूरा होने पर, परिणाम संनाभि z-श्रृंखला से व्यक्तिगत छवियों (चित्रा 4a और चित्रा 5), सिले छवियों (चित्रा 4c), और mrna गिनती ( चित्रा 4c) हो जाएगा. जब बहुसंकेतन किया जाता है, तो दो भिन्न mRNAs के लिए लेबल प्रदर्शित करने वाली छवियां भी मर्ज की जाएंगी (चित्र 5)। MRNA मायने रखता है फिजी (चित्रा 3) द्वारा उत्पन्न सिले छवियों का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं और कबरा प्रतिदीप्ति स्पॉट ढूँढना और ट्रैकिंग कार्यक्रम का उपयोग कर गिना धब्बे (चित्रा 4b).

MRNA गिना जाता है बाद में एक मानक डेटा विश्लेषण उपकरण का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम Pou5f1 और nanogके साथ n = 12 oocytes लेबल । प्रत्येक mRNA के लिए परिणाम औसत हैं और माध्य गणना के मानक त्रुटि । इस प्रोटोकॉल में एकत्र आंकड़ों ७७५ ± 26 SEM Pou5f1 टेप और mii oocytes में ११३ ± 5 Sem nanog ट्रांस्क्रिप्ट दिखाया (चित्रा 5) । एक छात्र टी परीक्षण Pou5f1 और nanogके बीच mrna गिनती में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित किया है । महत्वपूर्ण बात यह है कि कोई स्थान n = 5 oocytes कि DapB जांच (यानी, नकारात्मक नियंत्रण) के साथ लेबल रहे है में पता चला रहे थे । केवल 12 व्यक्तिगत oocytes का उपयोग कर छोटे मानक त्रुटि नोट करें । परख की संवेदनशीलता भी nanogका सकारात्मक reproducible पता लगाने के द्वारा पर बल दिया है(चित्रा 5)। पिछले dpcr प्रयोगों का पता लगाने के लिए नहीं किया गया था कि nanog की संख्या एक व्यक्ति अंडक में नानोग mrnas की संख् या dpcr 3का उपयोग कर थ्रेशोल्ड पहचान से नीचे इंगित करता है ।

प्रायोगिक प्रयोगों में, यदि अंडकोशिका के निर्धारण और एसएम-फिश प्रोटोकोल की दीक्षा के बीच विलंब हुआ तो हमने कम प्रतिदीप्ति का पता लगाया । इसी प्रकार, यदि स्वामित्व संकरण बफ़र्स का उपयोग नहीं किया जाता है, तो प्रोब और प्रवर्धन शाखित डीएनए कोशिका में प्रवेश नहीं करते हैं जिसके परिणामस्वरूप ओणु की प्लाज्मा झिल्ली के चारों ओर प्रतिदीप्ति उत्पन्न होती है । यह शाखित डीएनए के एकत्रीकरण के कारण संभव है । अंडक झिल्ली के चारों ओर चक्राभ प्रतिदीप्ति भी अगर वहाँ प्लाज्मा झिल्ली के गरीब permeabilization परिणाम होगा । MRNAs करने के लिए बाध्य प्रोटीन की इष्टतम गिरावट भी आवश्यक है । प्रोटीज SM-मछली किट में प्रदान की बफर ऊतक वर्गों और आसंन कोशिकाओं के उपचार के लिए एक इष्टतम एकाग्रता पर है । हालांकि, जब गैर का उपयोग-आसंन कोशिकाओं, यह महत्वपूर्ण है के लिए अनुभवपूर्ण सबसे अच्छा प्रोटीज कमजोर पड़ने की पहचान । बहुत कम प्रोटीज बफर एमआरएनए के लिए जांच की गरीब पहुंच के कारण mrnas के undercounting में परिणाम सकता है । इसी प्रकार, बहुत अधिक प्रोटीनयुक्त होने से न केवल एमआरएनए से बंधे प्रोटीन का ह्रास हो सकता है बल्कि एमएनएएस में अस्थिरता भी आ सकती है । इस प्रोटोकॉल में, हम mrna पता लगाने का परीक्षण एक अनुमापन वक्र का उपयोग कर undiluted (1:1), 1:4, 1:8, और 1:12 पतला प्रोटीज बफर 1x pbs में (n = 2 करने के लिए 3 oocytes प्रति कमजोर पड़ने). MII oocytes में Pou5f1 mrna की औसत फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति १६९ ± ४२ sem (undiluted) था, १७६ ± ३६ sem (1:4), ३०८ ± 18 sem (1:8), और ४४५ ± 24 sem (1:12) (चित्रा 6) । Protease इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया कमजोर पड़ने 1:8 था के रूप में यह सबसे कम भिंनता दिखाई ।

Figure 5
चित्रा 5 : MII oocyte में Pou5f1 और Nanog एमआरएनए । (A). मध्य z-श्रृंखला छवि की प्रतिनिधि छवियां बाईं ओर दिखाई जाती हैं । Pou5f1 लाल (६४७ एनएम) तरंगदैर्ध्य में पाया जाता है जबकि nanog हरी (४८८ एनएम) तरंगदैर्ध्य में पाया जाता है । डी-पी-आई-ओयोसाइट की विशेषता, मेटाज द्वितीय धुरी पर संरेखित गुणसूत्रों के DAPI धुंधला, सफेद में दिखाया गया है । वहां या तो ६४७ एनएम या ४८८ एनएम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य में Dapb के लिए कोई धुंधला था । (ख) Pou5f1 और nanog mrnas की संख्या मतलब SEM के रूप में दिखाया गया है (n = 12 oocytes); Dapbका कोई डिटेक् शन (एन. डी) नहीं था । * इंगित करता है P < 0.05, स्केल बार 10 μm है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6 : प्रोटीज बफर के आनुभविक अनुमापन mrnas की सटीक गिनती का अनुकूलन करने के लिए । MII oocytes में एसएम-मछली की Pou5f1 की प्रतिनिधि छवियों । Dapi धुंधला से पता चलता है गुणसूत्र mii धुरी पर गठबंधन । Oocytes undiluted (1:1), 1:4, 1:8, या Protease III बफर के 1:12 dilutions के साथ इनक्यूबेटेड थे । Pou5f1 mrnas की संख्या (n = 2-3 oocytes) गिना गया और मतलब SEM दिखाया गया है । स्केल बार 10 μm है । कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7 : निर्धारण, protease, और एक 6-कूप प्लेट के कुओं में संकरण बफ़र्स के माध्यम से MII oocytes के स्थानांतरण । प्रत्येक कूप का आकार दर्शाया गया है । (क) बफ़र्स में पहली बार जोड़े जाने पर कक्ष फ़्लोट करते हैं (ख) बफ़र्स में अंडकोशिका का जलमग्न होना । (ग) ऊष्मायन अवधि के दौरान अंडकोशिका कूप के तल तक जाती है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रोटोकॉल के दौरान छोटे कदमों की एक श्रृंखला mRNAs के सफल प्रतिदीप्ति और सटीक गिनती सुनिश्चित करेगा । पहले, प्रोटोकॉल संग्रह और oocytes का निर्धारण करने के बाद तुरंत किया जाना चाहिए । ध्यान दें कि PVP के लिए जोड़ा जाता है 4% पैराफार्मलेडिहाइड निर्धारण बफर एक दूसरे से चिपके से oocytes को रोकने के लिए. हमने पाया कि इस प्रयोग को तुरंत करने के लिए आवश्यक है कि यह ऑलोसाइट्स के एकत्रण और निर्धारण के बाद हो । किसी भी देरी के परिणाम में एक बहुत कम प्रतिदीप्ति संकेत है कि transcripts के undercounting में परिणाम होगा । इसका कारण आरएनए निम्नीकरण होता है । कोई 20 से अधिक oocytes एक ही समय में 6 अच्छी थाली में एक अच्छी तरह से हस्तांतरित किया जाना चाहिए और प्रत्येक अच्छी तरह से केवल एक बार इस्तेमाल किया जाना चाहिए । ऊष्मायन समय को छोटा या हर कदम की लंबाई के बिना भी सही ढंग से पालन किया जाना चाहिए । धोने बफ़र चरण अपवाद है; oocytes प्रयोगात्मक परिणामों में फेरबदल के बिना एक लंबे समय के लिए धोने बफर में छोड़ दिया जा सकता है. एसएम-फिश जांच तीन फ्लोरेसेंस चैनल C1, C2 और C3 में उपलब्ध हैं । बहुसंकेतन के लिए, एक ही चैनल टैग है कि नहीं मिक्स जांच. इसका परिणाम यह होगा कि दोनों ही प्रोब्स एक ही उत्सर्जक तरंगदैर्घ्य के विश्लेषण को असंभव बना देंगे क्योंकि जांच सेटों के बीच अंतर करने का कोई तरीका नहीं होगा । हाउसकीपिंग जीन के खिलाफ तैयार की गई सकारात्मक नियंत्रण जांच तीन चैनलों में से प्रत्येक में उपलब्ध हैं । नकारात्मक नियंत्रण जांच (उदा., Dapb) उन प्रीमिस्ड सेट्स में भी उपलब्ध हैं, जिनमें सभी तीन चैनलों के लिए टैग होते हैं । इस प्रयोग को मंद प्रकाश में आयोजित करने की आवश्यकता है क्योंकि अंडवाहिनी17,18से हटाने के बाद oocytes प्रकाश संवेदी होते हैं । AMP4 करने के लिए संलग्न fluorophores के अलावा के बाद, चरणों fluorophore की विरंजन को रोकने के लिए संभव के रूप में छोटे प्रकाश के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए. अंत में, जब ऊतकीय स्लाइड पर oocytes बढ़ते, ध्यान से oocytes और बुलबुले जो इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते है के गठन के विरूपण को रोकने के coverslip जगह है । यदि आपको कोशिका विरूपण से बचना कठिन लगता है, तो अंडकोशिका की गोलाकार आकृति बनाए रखने के लिए स्लाइड spacers का उपयोग किया जाना चाहिए ।

प्रोटोकॉल के एक आवश्यक संशोधन permeabilization के प्रतिस्थापन है, और धोने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट में प्रदान की बफ़र्स । मालिकाना प्रोटीज और संकरण बफ़र्स प्रदान की oocytes के लिए कठोर वातावरण रहे हैं, लेकिन प्रोटोकॉल की सफलता के लिए आवश्यक हैं । यदि उपयोग नहीं किया जाता है, तो एम्पलीफायरों कोशिका है जो branched डीएनए के एकत्रीकरण के कारण होने की संभावना है प्रवेश करने में असमर्थ हैं । इन कठोर वातावरण से अपेक्षाकृत हल्के permeabilization करने के लिए oocytes चल रहा है और धोने बफ़र्स, इम्यूनोफ्लोरेसेंस14के लिए डिजाइन, प्रोटोकॉल की सफलता के लिए पर्याप्त साबित कर दिया और एक ही समय में oocytes के lysis रोका. क्योंकि oocytes और preimplantation भ्रूणों एक ऊतकीय स्लाइड का पालन नहीं करते हैं, एक अंय आवश्यक संशोधन एक संस्कृति पकवान की एक अच्छी तरह से भीतर बफ़र्स में oocytes दे रहा था । हम एक 6-कूप भ्रूण संस्कृति प्लेट का इस्तेमाल किया । थाली में प्रत्येक अच्छी तरह से पतला और sloped पक्षों और एक 8 मिमी फ्लैट नीचे (चित्रा 7)है, जो अंडक वसूली में सुधार । यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है के रूप में oocytes उनके रिफ्रैक्टरी गुण खो देते हैं और संकरण बफ़र्स में लगभग पारदर्शी हो जाते हैं ।

जब अच्छी तरह से oocytes स्थानांतरित करने के लिए अच्छी तरह से, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि oocytes पूरी तरह से में समाधान में डूबे हुए हैं के रूप में कोशिकाओं को पहली बार एक अच्छी तरह से स्थानांतरित कर दिया जब नाव जाएगा (चित्रा 7A). एक बार जब वे यंत्रवत् बफर (7B चित्र) में डुबकी लगा रहे हैं, वे ऊष्मायन के अंत तक अच्छी तरह से नीचे डूब जाएगा (चित्रा 7b) । अपवाद AMP 1 और AMP 3 है; जब यंत्रवत् oocytes पनडुब्बी पूरी तरह से अच्छी तरह से नीचे करने के लिए व्यवस्थित नहीं है । इन oocytes खोजने के लिए, आप फोकस के विमान को बदलने की आवश्यकता हो सकती है । पिपेट ध्यान से और हानि रोकने के लिए स्थानांतरित किए जा रहे कक्षों की संख्या की गणना करें ।

एकाधिक एकल अणु मछली तकनीक, कि प्रतिदीप्त संकेत के बजाय cdna बढ़ाना, branched डीएनए chemistries सहित, 9,19विकसित किया गया है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट ऊतक वर्गों या एक हिस्टोलॉजिकल स्लाइड पर आसंन कोशिकाओं में व्यक्तिगत mRNAs की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पता लगाने के लिए branched डीएनए एसएम-मछली विधि अनुकूलित किया है । प्रोटोकॉल यहां वर्णित एकल गैर आसंन कोशिकाओं (जैसे, oocytes और preimplantation भ्रूण)3के साथ प्रयोग के लिए संशोधित किया गया है । यह न केवल विशिष्ट और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिमाणीकरण लेकिन यह भी एक mRNA की oocyte में स्थानीयकरण सक्षम बनाता है । हालांकि इस परख का एक फायदा है, वहां पाठ्यक्रम की सीमाएं हैं । उदाहरण के लिए, आरएनए-अनुक्रमण के विपरीत, यह उपंयास mRNAs की पहचान नहीं कर सकता । प्रोटोकॉल की एक अतिरिक्त सीमा ट्रांसक्रिप्ट-स्पेसिफिक जांच की उपलब्धता है । मालिकाना जांच कंपनियों है कि एसएम मछली किट बेचने से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । वहां कई जांच है कि पहले से बना रहे हैं । दूसरों को किसी भी एनोटेटिड mRNA एक उद्देश्य एल्गोरिथ्म10का उपयोग करने के लिए कंपनी द्वारा डिजाइन किया जा सकता है । हालांकि, अगर एक mRNA खराब sequenced यह उच्च विशिष्टता के साथ जांच की रूपरेखा के लिए मुश्किल होगा । लघु टेप के लिए यह भी काफी जांच की जोड़ी है कि पार नहीं अंय परख की विशिष्टता को कम करने के टेप के साथ प्रतिक्रिया की पहचान करना मुश्किल हो सकता है । इसी प्रकार, जांच सेट की एक छोटी संख्या स्पॉट ढूँढना और ट्रैकिंग प्रोग्राम में सकारात्मक के रूप में पता लगाने के लिए सीमा के ऊपर फ्लोरेसेंस सिग्नल का उत्पादन करने के लिए अपर्याप्त हो सकता है । इसी नस में, इस विधि के साथ ट्रांसक्रिप्ट वेरिएंट का पता नहीं लगाया जा सकता ।

सीमाओं के बावजूद ऊपर वर्णित है, वहां एसएम मछली के लिए कई आवेदन कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, एकल कोशिका आरएनए-अनुक्रमण के डेटा को विशेष रूप से तब मान्य किया जा सकता है जब सेल संख्याएं छोटी हों और प्राप्त करने में कठिन हों (उदा., अंडसाइट्स और भ्रूण). पीसीआर के लिए cDNA प्रवर्धन एक प्रयोगात्मक त्रुटि है जो आम तौर पर stably व्यक्त हाउसकीपिंग जीन से डेटा का उपयोग कर एक सामान्यीकरण कदम से कम है परिचय. हालांकि, पूर्व प्रत्यारोपण भ्रूण के माध्यम से अंडक में लौकिक परिवर्तन भी हाउसकीपिंग जीन की अभिव्यक्ति बदलता है । एसएम-फिश प्रोटोकॉल सीडीएनए के बजाय प्रतिदीप्ति को प्रदीप्त करता है । इसलिए, कम परिवर्तनशीलता के साथ प्रतिलिपि बनाने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए ट्रांसक्रिप्ट-विशिष्ट mRNA स्तर के सामान्यीकरण के लिए कोई आवश्यकता नहीं है । पीसीआर प्राइमर दक्षता की परिवर्तनशीलता के कारण, अलग mRNA प्रजातियों की निरपेक्ष संख्या में अंतर सही के भीतर या सेल प्रकार के बीच की तुलना में नहीं किया जा सकता है । एसएम-मछली localizes और mRNA की मात्रा । इसलिए, यह एक मिश्रित सेल आबादी में जो कोशिकाओं mRNA एक्सप्रेस की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, जब oocytes प्राथमिक या माध्यमिक कूप के भीतर बढ़ रहे हैं, कूप अलग किया जा सकता है और सुसंस्कृत में alginate मोती20 लेकिन दैहिक कोशिकाओं से अंडकोशिका का अलग होना मुश्किल है । इसलिए, मिश्रित सेल आबादी का उपयोग करते हुए अनुक्रमण और पीसीआर अध्ययन किया गया है । SM-FISH का उपयोग निर्धारित कर सकते है यदि mrnas दैहिक कोशिकाओं या कूप के अंडक में पाए जाते हैं । अंत में, एसएम मछली उच्च संवेदनशीलता और कम बहुतायत टेप का पता लगाने के लिए अनुमति विशिष्टता है; उदाहरण के लिए, MII oocytes में Nanog का पता लगाने (चित्रा 5).

एमएनएएस का भंडारण और अवक्रमण प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण विनियामक तंत्र हैं । अनुवाद, भंडारण, और गिरावट के बाद ट्रांसक्रिमेशनल विनियमन प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता कर रहे है कि21mrnas के लिए बाध्य । वर्तमान में, आरएनए-प्रोटीन इम्यूनोसेपिटेशन (आरआईपी) नियमित रूप से किया जा सकता है जब कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में उपलब्ध हैं22. एक ही जानवर से एकत्र किया जा सकता है कि Xenओपन अंडे की बड़ी संख्या के कारण, चीर सफलतापूर्वक इस जानवर मॉडल में प्रदर्शन किया गया है. हालांकि, यह पर्याप्त स्तनधारी oocytes और पूर्व प्रत्यारोपण भ्रूण को चीर प्रदर्शन प्राप्त करने के लिए मुश्किल है । एस-फिश और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (इम्यूनोफिश) 23 ऊतक वर्गों के युग्मन में ट्रांसलेशनल मशीनरी24,25सहित विशिष्ट एमआरएनएएस से जुड़े प्रोटीन को विज़ुअलाइज़ करने की क्षमता होती है । जीनोमिक्स आनुवंशिक वेरिएंट (उदाहरण के लिए, छोटे न्यूनोटाइड polymorphisms, SNPs) स्वास्थ्य और रोग26के साथ जुड़े उपाय । फिन्फिनिक्स पर्यावरणीय दबावों के कारण सेलुलर प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन की पहचान करता है27,28. वर्तमान अनुसंधान के लिए तंत्र है कि विशिष्ट phenotypes के साथ जीनोम में परिवर्तन जोड़ता है खोजने के लिए करना है । ImmunoFISH के उपयोग के लिए mRNA अभिव्यक्ति में SNP निर्भर परिवर्तन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति है कि सेलुलर phenotypes में योगदान को जोड़ने की क्षमता है । के रूप में प्रौद्योगिकी विकसित, वहां संभावना है कि एसएम के अंय अनुप्रयोगों-मछली है कि कई जैविक प्रणालियों में महत्वपूर्ण तंत्र की पहचान करेगा ।

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Disclosures

लेखकों के लिए कुछ भी नहीं की घोषणा की है

Acknowledgments

हम स्थापना और स्थान खोजने और ट्रैकिंग 13 कार्यक्रम और संनाभि माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए नेब्रास्का लिंकन माइक्रोस्कोपी कोर के विश्वविद्यालय के तकनीकी समर्थन के उपयोग के साथ अपने उदार मदद के लिए डॉ डैनियल आर larson धंयवाद । यह अध्ययन नेब्रास्का कृषि अनुसंधान प्रभाग, लिंकन, नेब्रास्का के विश्वविद्यालय के योगदान का प्रतिनिधित्व करता है और यूएनएल हैच फंडों द्वारा समर्थित था (NEB-26-206/परिग्रहण संख्या-२३२४३५ और एनईबी-26-231/परिग्रहण संख्या-१०१३५११) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-α-Lipoic acid Sigma-Aldrich T1395 Alpha Lipoic Acid
Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid MP Biomedicals, LLC 199899 FAF BSA
BD 10mL TB Syringe Becton, Dickinson and Company 309659 10 mL syringe
BD PrecisionGlide Needle Becton, Dickinson and Company 305109 27 1/2 gauge needle
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 CaCl2-2H2O
Citric acid Sigma-Aldrich C2404 Citrate
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 Glucose
Disodium phosphate Na2HPO4
Easy Grip Petri Dish Falcon Corning 351008 35 mm dish
Edetate Disodium Avantor 8994-01 EDTA
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08 Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors
Fetal Bovine Serum Atlanta biologicals S10250 FBS
Gentamicin Reagent Solution gibco 15710-064 Gentamicin
GlutaMAX-I (100X) gibco 35050-061 Glutamax
Gold Seal Micro Slides Gold Seal 3039 25 x 75mm slides
Gonadotropin, From Pregnant Mares' Serum Sigma G4877 eCG
hCG recombinant NHPP AFP8456A hCG
Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes Sigma-Aldrich H3884 Hyaluronidase
Jewelers Style Forceps Integra 17-305X Forceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw
L-(+)-Lactic Acid, free acid  MP Biomedicals, LLC 190228 L-Lactate
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M2773 MgSO4-7H2O
MEM Nonessential Amino Acids Corning  25-025-Cl NEAA
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-C 25 x 25x 0.15 mm cover slips
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe Advanced Cell Diagnostics 501891-C2 Nanog Probe
Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe Advanced Cell Diagnostics 501611-C3 Pou5f1 Probe
MOPS Sigma-Aldrich M3183
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Paraformaldehyde
PES 0.22 um Membrane -sterile Millex-GP SLGP033RS 0.22 um filters
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich P0930 PVP
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60128 KCl
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 60218 KH2PO4
Prolong Gold antifade reagent invitrogen P36934 Antifade reagent without DAPI
RNAscope DAPI Advanced Cell Diagnostics 320858 DAPI
RNAscope FL AMP 1 Advanced Cell Diagnostics 320852 Amplifier 1
RNAscope FL AMP 2 Advanced Cell Diagnostics 320853 Amplifier 2
RNAscope FL AMP 3 Advanced Cell Diagnostics 320854 Amplifier 3
RNAscope FL AMP 4 ALT A Advanced Cell Diagnostics 320855 Amplifier 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT B Advanced Cell Diagnostics 320856 Amplifier 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT C Advanced Cell Diagnostics 320857 Amplifier 4 ALT C
RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit Advanced Cell Diagnostics 320851 FISH Reagent Kit
RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics 320871 Negative Control
RNAscope Probe 3-plex Positive Control Advanced Cell Diagnostics 320881 Positive Control
RNAscope Probe Diluent Advanced Cell Diagnostics 300041 Probe Diluent
RNAscope Protease III Advanced Cell Diagnositics 322337 Protease III
RNAscope Protease III & IV Reagent Kit Advanced Cell Diagnostics 322340 FISH Protease Kit
RNAscope Protease IV Advanced Cell Diagnostics 322336 Protease IV
S/S Needle with Luer Hub 30G Component Supply Co. NE-301PL-50 blunt 30 gauge needle
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 NaHCO3
Sodium chloride Sigma-Aldrich S6191 NaCl
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 306576 NaOH
Sodium pyruvate, >= 99% Sigma-Aldrich P5280 Pyruvate
Solution 6 Well Dish Agtechinc D18 6 well dish
Taurine Sigma-Aldrich T8691 Taurine
Tissue Culture Dish Falcon Corning 353002 60 mm dish
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Triton X-100

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References

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आनुवंशिकी मुद्दा १४६ Oocyte एमआरएनए परिमाणीकरण mRNA स्थानीयकरण गैर आसंन कोशिकाओं स्वस्थानी संकरण में प्रतिदीप्ति BRANCHED डीएनए
एक अणु स्वस्थानी संकरण (एस-फिश) में फ्लोरोसेंट का उपयोग करना और मुरीन ओओसाइट्स में mRNAs का स्थानीयकरण करना ।
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Timme, K. R., Wood, J. R. Use of… More

Timme, K. R., Wood, J. R. Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes. J. Vis. Exp. (146), e59414, doi:10.3791/59414 (2019).

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