Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Bruk av ett molekyl fluorescerende i Situ hybridisering (SM-fisk) å kvantifisere og Localize mRNAs i Murine Oocytes

Published: April 24, 2019 doi: 10.3791/59414
Automatic Translation
1, 1
1Department of Animal Science, University of Nebraska-Lincoln

Summary

Du reproduserbar teller antallet mRNAs i individuelle oocytes, ett molekyl RNA fluorescens i situ var hybridisering (RNA-fisk) optimalisert for ikke-tilhenger celler. Oocytes var samlet, hybridiserte med transkripsjon bestemt sonder og kvantifisert bruker en kvantifisering programvare.

Abstract

Gjeldende metoder rutinemessig brukes å kvantifisere mRNA i oocytes og embryo inkluderer digitale omvendt-transkripsjon polymerasekjedereaksjons (dPCR), kvantitativ, real-time RT-PCR (RT-qPCR) og RNA sekvensering. Når disse teknikkene utføres ved hjelp av en enkelt oocytter og embryo, gjenkjennes lav-kopi mRNAs pålitelig ikke. Du løser dette problemet, kan oocytes eller embryo samordnes sammen for analyse; men fører dette ofte til høy variasjon blant prøver. I denne protokollen beskriver vi bruk av fluorescens i situ hybridisering (fisk) bruker forgrenet DNA kjemi. Denne teknikken identifiserer romlige mønster av mRNAs i enkeltceller. Når teknikken er kombinert med sted å finne og sporingsprogramvare, kan også overflod av mRNAs i cellen kvantifiseres. Bruker denne teknikken, det er redusert variasjon innen en forsøksgruppen og færre oocytes og embryo kreves for å gjenkjenne betydelige forskjeller mellom eksperimentelle grupper. Kommersielt tilgjengelige forgrenet-DNA SM-fisk kits er optimalisert for å oppdage mRNAs i valgte vev eller tilhenger celler i lysbilder. Men oocytes effektivt overholder ikke lysbilder og noen reagenser i kit var for harde resulterer i oocyte lysis. For å forhindre denne lyse, ble flere endringer gjort fisk Kit. Spesielt erstattet oocyte permeabilization og vask buffere designet for immunofluorescence av oocytes og embryo de proprietære bufferne. Den permeabilization, vasker og incubations med sonder og forsterker ble utført i 6-vel plater og oocytes ble plassert på lysbilder på slutten av protokollen bruker monterer medier. Disse endringene kunne overvinne begrensningene til kommersielt tilgjengelige settet, spesielt oocyte lysis. For å nøyaktig og reproduserbar telle antall mRNAs i individuelle oocytes, ble programvare brukt. Sammen, representerer denne protokollen et alternativ til PCR og sekvensering sammenligne uttrykk for bestemte utskrifter i enkeltceller.

Introduction

Revers transkriptase polymerasekjedereaksjons (PCR) har vært gullstandarden for mRNA kvantifisering. To analyser, digital PCR (dPCR)1 og kvantitativ, virkelig tid PCR (qPCR)2 brukes for øyeblikket. Av de to PCR teknikkene har dPCR større følsomhet enn qPCR antyder at det kan brukes til å måle mRNA overflod i enkeltceller. Men i våre hender, har dPCR analyse av lav overflod mRNAs i av 5 til 10 oocytes per hvert eksperimentelle utvalg produsert data med lav reproduserbarhet og høy variant3. Dette er sannsynligvis på grunn av eksperimentelle feil forbundet med RNA utvinning og omvendt transkripsjon effektivitet. RNA sekvensering er også utført med et enkelt museklikk og menneskelig oocytes4,5. Denne teknikken krever cDNA forsterkning fremgangsmåtene for biblioteket generasjon som sikkert øker variasjonen i en forsøksgruppen. Videre kan lav overflod utskrifter ikke være synlig. Selv om sekvensering prisene har gått ned de siste årene, kan det likevel være kostnadseffektivt uoverkommelige på grunn av de høye kostnadene av bioinformatikk analyser. Endelig er mRNA lokalisering en dynamisk prosess med romlig endringer bidra til protein funksjon6. Derfor setter vi opp for vedta en teknikk som vil produsere nøyaktig og reproduserbar kvantitative tiltak og lokalisering av personlige mRNAs i én oocytes.

Forgrenede DNA koblet til fluorescens i situ hybridisering forsterker fluorescens signal i stedet for å forsterke RNA/cDNA aktivere gjenkjenning av ett mRNAs i enkeltceller 7,8,9. Analysen utføres gjennom en rekke hybridisering, forsterkning (med forgrenet DNA) og fluorescens merking skritt for å forsterke fluorescens signal7. Teknikken begynner med binding av 18 - til 25-base oligonucleotide sonde par som er komplementære til en bestemt mRNA3,8,10. Femten til tjue sonde parene er designet for hver utskrift sikre spesifisitet for målet transkripsjon. MRNA-spesifikke hybridization etterfølges av pre forsterker og forsterker sonder som danner en forgrenet konfigurasjon. Ca, 400 etiketten fluorophores binder seg til hver forsterker, resulterer i en 8000-fold økning i fluorescens tillater påvisning av individuelle mRNAs (figur 1)11.

Figure 1
Figur 1: skjematisk av SM-fisk protokollen. Sekvensiell blanding av transkripsjon bestemt sonde, forgrenet DNA forsterker og fluorophore til et mål mRNA vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tidligere studier med ett molekyl fluorescens i situ hybridisering (SM-fisk) lokalisert β-utgangen mRNAs i individuelle neurons12 og humant papillomavirus DNA i livmorhalskreft celle linjer7. Dataprogramvaren sted å finne og sporing programmet identifiserer individuelle vises punctate fluorescerende signal og har blitt brukt å tallfeste antallet mRNAs i hver celle3,13.

Basert på resultatene av mRNA gjenkjenning i neurons12, hypotese vi at SM-fisk ville bevise en nyttig verktøyet å quantitate transkripsjon nivåer i murine oocytes og embryo inkludert lav overflod mRNAs. Men teknikken er optimalisert for bruk med tilhenger fast celler og formaldehyd fast parafin innebygd (FFPE) vev deler. Oocytes kan ikke følge et lysbilde, selv når de er belagt med Poly-L-lysine. Videre, de er mer sårbar enn somatiske celler og vev inndelinger som resulterer i cellen lysis når utsatt for noen av proprietære bufferne i kommersielt tilgjengelig kits3. For å overvinne disse utfordringene, oocytes fast og manuelt overføres mellom dråper bufferne. Videre erstattet permeabilization og vask buffere i settene for å redusere celle lysis. Forhåndsutformede sonder kjøpes sammen med fisk kit eller bestemte utskrifter kan forespørres. Hver proprietære sonde er tilgjengelig i en av tre fluorescens kanaler (C1, C2 og C3) for å tillate multipleksing. I gjeldende eksperimentet var murine oocytes dual-farget og kvantifisert ved hjelp av en C2 Nanog sonde og en C3 Pou5f1 sonde. Disse sonder ble valgt basert på rapporterte uttrykk for Nanog og Pou5f1 i oocytes og embryo. Ved avslutningen av hybridisering trinnene plassert oocytes i dråper av anti-fade monterer medier skal histologiske lysbilder. AC confocal bilder ble brukt om å kvantifisere antall vises punctate fluorescerende signaler som representerer personlige mRNAs. Kvantifisere mRNAs, bildebehandling viste også den romlige fordelingen av den spesifikke mRNA i cellen, er hvilke andre RNA kvantifisering metoder ikke å oppnå. Denne teknikken vist seg for å ha lav variasjon innen en forsøksgruppen tillater bruk av mindre antall oocytes i hver forsøksgruppen å identifisere betydelige forskjeller mellom eksperimentelle grupper3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Animal prosedyrer blir gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen på University of Nebraska-Lincoln og alle metodene ble utført i samsvar med relevante retningslinjer og regler. For denne studien, CD-1 outbred musene hadde ad lib tilgang til normal gnager chow og vann. de ble opprettholdt i en 12:12 mørke: lyset syklus.

1. utarbeidelse av nødvendige medier

  1. For basen medier (OMM), kan du legge 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO4og 1,7 mM CaCl2-2 H2O til 100 mL sterilt vann.
    Merk: OMM medium kan lagres i opptil 1 måned.
  2. For komplett medier (OMOPS), legger du til 20 mM 3-morpholinopropane-1-sulfonic syre (MOPPER), 1.2 mM MgSO4-7 H2O, 0,5 mM glukose, 6 mM L-laktat, 1 mM ala-gln, 0,1 mM taurine, 1 x ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 0,01 mM ethylenediaminetetraacetic syre ( EDTA), 10 µM alpha lipoic syre, 10 µg/mL ufortynnet gentamicin, 21 mM 1 M NaOH, 5 mM NaHCO3, 0.2 mM Pyruvate, 0,5 mM Citrate, 4 mg/mL FAF BSA til en 1:10 fortynning av OMM i sterilt vann i et totalt volum på 100 mL. Sterilisere mediet med filtere 0.22 µM.
    Merk: OMOPS kan lagres i opptil 1 uke.
  3. For holder mellomstore (HM) legge til 5% fosterets bovin serum OMOPS. Gjøre 2 mL HM per musen.
  4. Legge til 0,1 mg/mL av hyaluronidase avledet fra storfe testiklene, 1 mL HM hyaluronidase løsning.
  5. Kombinere 4% paraformaldehyde i 10 mL 1 x PBS med 0,1% embryoet klasse polyvinylpyrrolidone (PVP)14fiksering bufferen.
  6. For å forberede 50 mL vaskebuffer (WB), legge til 0,1% ikke-ioniske surfactant og 0,1% PVP til 1 x PBS14.
  7. Å forberede 10 mL permeabilization buffer, legge til 1% ikke - ioniske surfactant 1 x PBS14.
    Merk: Vask og permeabilization bufferne beskrevet ovenfor erstatte proprietære bufferne i kommersielt tilgjengelig settene.

2. samling av ovulated oocytes fra kvinnelige mus

  1. Forberedelse:
    1. Stimulere kvinnelige mus for 5-8 ukens av alderen av intraperitoneal (IP) injeksjon av 5 IU equine chorion gonadotropin (eCG) etterfulgt av 5 IU humant choriongonadotropin (hCG) 44-48 h senere15,16.
    2. Holde 35 mm Petri retter som inneholder 2 mL HM på en 37 ° C oppvarming plate. Pipetter en 100 µL dråpe HM som inneholder fortynnet hyaluronidase etterfulgt av tre, 50 µL dråper HM uten hyaluronidase i en Petriskål 60 mm. Sett platene som inneholder dråper på 37 ° C oppvarming plate før bruk.
      Merk: Hyaluronidase dråper bør gjøres bare før dissection i hvert oviduct å hindre fordampning og konsentrasjonen av komponentene i HM med eller uten hyaluronidase.
  2. Euthanize mus, 16 h etter IP injeksjon av hCG, bruker isoflurane overdose etterfulgt av cervical forvridning.
  3. Rengjør musen bruker 70% etanol. Utsette bukhulen og visualisere den kvinnelige skjede. Hold eggstokken med tang og fjerne livmor leddbånd og overflødig fettvev fra rundt eggstokken. Skjær oviduct fra livmoren og Legg eggstokk-oviduct paret i varm HM i 35 mm parabolen.
  4. Fjern eggstokken og alle omkringliggende fettvev. Rive den hovne ampulla av oviduct bruker en ½ tommers 27-gauge nål. Skyv oviduct på stedet av tåre og cumulus celle-oocyte komplekser (COCs) vil bli utvist. Overføre ovulated oocytes, som antas å være i metaphase II (MII) av meiose, til 100 μL drop med HM media hyaluronidase bruker en munn pipette (figur 2).

Figure 2
Figur 2 : Deler av munnen hindre brukes til å overføre oocytes. (A) munn stykke (B) 0.22 um, 4 mm filter (C) aspirator rør (D) 1000 μL Pipetter tips (E) 9-"Pasteur pipetter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Pipetter MII oocyte-cumulus celle komplekser opp og ned i hyaluronidase som inneholder HM med munnen pipette å dislodge cumulus celler. Overføre hver oocyte, når de er blottet for cumulus cellene til en vask slippe inneholder HM bare bruker munnen pipette. Gjenta dette for hver vask slippverktøy. Overfør ikke fragmentert eller gjennomsiktig oocytes15.
    Merk: Det er viktig å overføre oocytes fra hver dråpe i 35 mm parabolen med som liten HM som mulig. Dette gjelder for hver overføring i protokollen. MII-oocytes må ikke forbli i hyaluronidase som inneholder HM medium for mer enn ett minutt.

3. SM-fisk farging av Oocytes

  1. Fastsette oocytes i en enkelt godt av en 6-vel plate som inneholder 500 µL fiksering bufferen. Senk 20 oocytes eller mindre i brønnen. Inkuber for 20 min ved romtemperatur.
    Merk: Steg SM-fisk flekker skjer innenfor en enkelt brønn i en 6-godt koniske plate. Kontroller at oocytes er fullstendig neddykket i buffere og ikke flytende på bufferen. Hvert trinn skal utføres med 20 oocytes eller mindre i hver brønn.
  2. Overføre fast oocytes til 500 μL vaskebuffer (WB beskrevet i trinn 1.6) i 10 min. Gjenta 2 ganger.
  3. Inkuber oocytes i permeabilization buffer for 30 min ved romtemperatur.
    Merk: Permeabilization bufferen som beskrevet i trinn 1.7 erstatter anstendighet permeabilization bufferen.
    1. Samle sonde sett og raskt spinne dem ned i en microcentrifuge. Varm hver probe satt for 10 min i 40 ° C vannbad eller inkubator. Avkjøles til romtemperatur.
      Merk: Dette trinnet skal utføres under permeabilization incubation
  4. Legg oocytes i 500 µL av WB i 10 min ved romtemperatur.
  5. Overføre oocytes til 80 μL Protease III Buffer (tilgjengelig fra kit), som er fortynnes 1:8 i 1 X PBS, i 30 min ved romtemperatur.
    Merk: 80 µL volumet tilstrekkelig dekker bunnen av en enkelt brønn i en 6-vel plate.
  6. Legg oocytes i 500 µL av WB i 10 min ved romtemperatur.
  7. Fortynne de varmet sonde settene for Nanog, Pou5f1, og DapB (en negativ kontroll gen), 1:50 i sonde fortynner. Inkuber oocytes i 80 μL transkripsjon-spesifikke sonden i 2 timer på 40° C.
    Merk: Hver proprietære sonde sett er tilgjengelig i en av tre fluorescens kanaler (C1, C2 og C3). Nanog og Pou5f1 sonder var merket med C2 og C3, henholdsvis.
  8. Varm proprietær, forsterker 1 (AMP 1), forsterker 2 (AMP2), forsterker 3 (AMP3) og forsterker 4-fluorescens (AMP 4-FL) i romtemperatur.
    Merk: Dette trinnet skal utføres under 2 timer transkripsjon-spesifikke sonde incubation.
  9. Overføre til oocytes til 500 μL WB og ruge i 10 min ved romtemperatur.
  10. Inkuber oocytes i forsterkning buffere.
    1. Inkuber oocytes i 80 µL av AMP1 i 30 min på 40° C. overføring oocytes til 500 µL av WB i 10 min ved romtemperatur.
    2. Inkuber oocytes i 80 µL av AMP2 i 15 min på 40 ° C. Overføre oocytes til 500 µL av WB i 10 min ved romtemperatur.
    3. Inkuber oocytes i 80 µL av AMP3 i 30 min på 40 ° C. Overføre oocytes til 500 µL av WB i 10 min ved romtemperatur.
      Merk: Resten av protokollen utføres i mørket fordi AMP-FL inneholder fluorophore. Når du arbeider under dissecting mikroskopet, redusere lyset så mye som mulig.
    4. Legger til oocytes 80 μL AMP4-FL i 15 min på 40° C.
      Merk: AMP4-FL tilbys som alternativ buffer-A (Alt-A), Alt-B eller Alt-C. Velg AMP4-FL bufferen avhengige på hvilke utslipp bølgelengde er ønsket.
  11. Legg oocytes i 500 µL av WB i 10 min ved romtemperatur. Inkuber oocytes i 80 µL av DAPI etter 20 min ved romtemperatur. Legg oocytes i 500 µL av WB i 5 minutter ved romtemperatur.
  12. Pipetter 12 µL av anti-filtrert montering medier på midten av et lysbilde uten å legge bobler reagensen. Overføre oocytes med som liten WB som mulig til montering media og bruke en dekkglassvæske.
    1. Tilt dekkglassvæske i vinkel og sakte og forsiktig plasserer over væske på lysbildet. Unngå å trykke på dekkglassvæske for vanskelig å unngå forvrengning av oocytes og innføringen av bobler.
    2. Lagre lysbilder i en mørk til tørre over natten i romtemperatur. Coat kantene på lysbildene i klart neglelakk å forsegle dekkglassvæske.
  13. Bruk standard mikroskop for å finne oocytes i lysbildet til sirkelen med en permanent penn.
    Merk: Dette trinnet er ikke nødvendig, men forbedrer å finne oocytes på lysbildet. For best resultat, bilde lysbilder innen 1 til 5 dager fluorescerende signal begynner å visne.

4. bildebehandling

  1. Bilde av 3-dimensjonale oocytes, bruke z trinn AC confocal mikroskopi.
    Merk: Nøyaktig analysere bildene, steg z må være 1.0 µm/skive.
  2. Lagre AC confocal bilder som en komprimert nd2 eller personlige. TIFF-filer for hver oocyte. Begge typer er kompatible med åpen kilde bilde behandling programmet, Fiji.
  3. Dataoverføre og installere åpen tilgang Fiji programvaren (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    1. Dra nd2 filer i Fiji, og velg hyperstack. Hvis AC confocal bilder var lagret som. TIFF-filer går du til trinn 4.4.
      Merk: Når filen nd2 slippes over Fiji hyperstack rullegardinlisten skal vises automatisk.
    2. Klikk kategorien bilde , velge fargeog klikker Del opp kanaler for å skille fluorescerende kanaler for filen nd2.
    3. Generere individuelle. TIFF-filer for hver z stykke oocyte i hver fluorescerende kanal. Klikk kategorien bilde , velger du stakker, og klikk stabel til bilder. Klikk kategorien bilde , Velgog klikk RGB-farger for å konvertere hver z skive til en enkelt RGB-fargebilde.
      Merk: RGB fargen er kunstig og kan bli valgt som ønsket for hver utslipp bølgelengde.
    4. Lagre hver konverterte bildet som. TIFF-fil. Plassere bilder fra en enkelt oocyte for hver fluorescerende kanal i en ny mappe for å unngå forvirring i søm (trinn 4.3).
  4. Normalisere hver. TIFF-bilde for Pou5f1 og Nanog med negativ kontroll bilder (DapB).
    Merk: Normalisering utføres ved å bruke et fotoredigeringsprogram. Husk å fjerne samme nivå av bakgrunnen fluorescens fra hvert kontroll bilde.
  5. Åpne hver normalisert. TIFF-fil i Fiji å sy sammen alle z-skiver for hver oocyte i hver bølgelengde.
    1. Plugins kategorien, velg Stitching, og klikk på Rutenettet/samling (figur 3A). Velg Sekvensielle bilder fra rullegardinmenyen og Klikk OK (figur 3B).
    2. Bla gjennom mappen og velg mappen som inneholder alle z-bit bilder for en individuell oocyte på en bølgelengde (se trinn 4.3.4). Klikk på OK.
    3. Flytt glidebryteren nederst sydd bildet til den riktige fargekanalen for bølgelengden brukes og opprette det endelige RGB sydd bildet ved å klikke bildet, velge Type, og RGB-farge.
      Merk: Dette bildet vil bli brukt til fluorescens kvantifisering beskrevet i trinn 4.6 nedenfor.
  6. Konvertere sydd bildet til 32-biters maksimal projiserte bildet. Klikk bildet, Velgog klikk 32-biters (Figur 3 c). Lagre dette bildet som en ny. TIFF-fil.

Figure 3
Figur 3 : Sette sammen av AC confocal z-serien bilder av oocytes. (A) skjermbilde viser verktøyet Plug-in rutenett/samling i Fiji som ble brukt til å produsere sammensatte bilder av oocyte. (B) sekvensielle bilder bruker fluorescens overlapping mellom sekvensielle. TIFF-filer til å generere et sammensatt bilde. (C) det sammensatte bildet ble lagret som en 32-bit. TIFF-fil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Dataoverføre og installere sted å finne og sporing Program13, som er tilgjengelig fra nettstedet til Dr Larson, en etterforsker på nasjonale institutter for helse National Cancer Institute (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson). Dataoverføre og installere den åpen tilgang virtuelle maskinen for interaktive data språk (IDL) operativsystem som kreves for å kjøre sted å finne og sporing Program (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf).
  2. Åpne det 32-bit, sydd bildet, som ble generert i trinn 4.6 (figur 4A), i stedet finne og sporing Program. Velg Localize rullegardinlisten og klikk Localize (figur 4B), som beregner antall flekker i bildet.
    Merk: Hver spot telles representerer en personlige mRNA. Bandet pass og Foton innstillingene vises i skjermbildet (figur 4B). For denne protokollen, ble standard for hver innstillingen brukt. Representant positiv og bakgrunn flekker vises (figur 4C).

Figure 4
Figur 4 : Kvantifisering av mRNAs ved bruk av Spot søker og sporing. (A) personlige z-serien bilder ble sydd sammen som beskrevet i Figur 3 og lagret som maksimalt 32-biters anslått. TIFF-fil. (B) sammensatt bilde ble åpnet i stedet Finder og sporing. Lokalisere ble brukt til å telle de fluorescerende flekkene (rød boks). Bandet pass og Foton terskelen er angitt av den blå boksen. (C) den blå pilen peker til et positivt signal (over terskel). Den hvite pil viser en lysrør stedet under grensen, og derfor telles ikke. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved ferdigstillelse av protokollen, vil resultatet være enkeltbilder fra AC confocal z-serien (figur 4A og figur 5), sydd bilder (figur 4C), og mRNA teller (figur 4B). Når multipleksing er utført, vil det også være sammenslåtte bilder viser etiketten for to ulike mRNAs (figur 5). MRNA teller genereres sydd bilder generert av Fiji (Figur 3) og vises punctate fluorescens flekker telles sted å finne og sporing Program (figur 4B).

MRNA teller analyseres senere bruker en standard dataanalyseverktøy. I denne protokollen, vi merket n = 12 oocytes med Pou5f1 og Nanog. Resultatene for hver mRNA feltuttrykket og standardfeilen til gjennomsnittet beregnes. Data samlet inn i denne protokollen viste 775 ± 26 SEM Pou5f1 utskrifter og 113 ± 5 SEM Nanog utskrifter i MII oocytes (figur 5). En student t-test bestemt en statistisk signifikant forskjell i mRNA teller mellom Pou5f1 og Nanog. Viktigst, det var ingen flekker i n = 5 oocytes merket med DapB sonde (dvs. negativ kontroll). Merk liten standardfeilen bruker bare 12 personlige oocytes. Følsomheten til analysen er også understreket av reproduserbar positiver Nanog(figur 5). Forrige dPCR eksperimenter finne ikke reproduserbar Nanog indikerer at antall Nanog mRNAs i en enkelt oocyte under terskelen oppdagelsen med dPCR 3.

Piloten eksperimenter fant vi redusert fluorescens hvis det var en forsinkelse mellom fiksering av oocytes og initiering av SM-fisk-protokollen. Likeledes, hvis proprietære hybridisering bufferne ikke brukes, sonde og forsterkningsnivå forgrenet DNA ikke angir cellen som resulterer i fluorescens ringed rundt plasma membranen av oocyte. Dette er sannsynligvis på grunn av samling av forgrenede DNA. Ringmerket fluorescens rundt oocyte membranen medfører også hvis det er dårlig permeabilization i plasma membranen. Optimal nedbrytning av protein bundet til mRNAs er også nødvendig. Protease-bufferen som er definert i SM-fisk kit er en optimal konsentrasjon for behandling av vev seksjoner og tilhenger celler. Men når du bruker ikke-tilhenger celler, er det viktig å identifisere empirisk beste protease fortynning. For lite protease bufferen kan føre til undercounting av mRNAs på grunn av dårlig tilgjengelighet av sonden å mRNA. Likeledes, for mye protease kan medføre nedbrytning av ikke bare proteiner som er bundet til mRNA men også destabilisering av mRNAs. I denne protokollen, vi testet mRNA detection bruke en titrering kurve ufortynnet (1:1), 1:4, 1:8 og 1:12 utvannet protease bufferen i 1 x PBS (n = 2 til 3 oocytes per fortynning). Gjennomsnittet fluorescerende uttrykk for Pou5f1 mRNA i MII oocytes var 169 ± 42 SEM (ufortynnet), 176 ± 36 SEM (1:4), 308 ± 18 SEM (1:8) og 445 ± 24 SEM (1:12) (figur 6). Protease fortynning brukes i denne protokollen var 1:8 som det viste den laveste varianten.

Figure 5
Figur 5 : Pou5f1 og Nanog mRNA i MII oocyte. (A). representant bilder av midtre z-serien bildet vises til venstre. Pou5f1 er oppdaget i rødt (647 nm) bølgelengden mens Nanog er oppdaget i grønne (488 nm) bølgelengde. DAPI farging av kromosomer på metaphase II spindelen, karakteristisk for MII oocyte, vises i hvitt. Det var ingen flekker for DapB enten på 647 nm eller 488 nm utslipp bølgelengde. (B) antall Pou5f1 og Nanog mRNAs vises som betyr SEM (n = 12 oocytes); Det var ingen påvisning (N.D) av DapB. * Angir P < 0,05, skala bar er 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Empirisk titrering protease bufferen å optimalisere nøyaktig telling av mRNAs. Representant bilder av SM-fisk av Pou5f1 i MII oocytes. DAPI flekker viser kromosomene på MII spindelen. Oocytes ble inkubert med ufortynnet (1:1), 1:4, 1:8 eller 1:12 fortynninger av Protease III buffer. Antall Pou5f1 mRNAs (n = 2-3 oocytes) ble regnet og mener SEM vises. Skala bar er 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Overføring av MII oocytes gjennom fiksering og protease hybridisering buffere i brønner av en 6-vel plate. Formen på hver brønn vises. (A) celler flyte når først lagt til buffere (B) neddykking av oocytes i buffere. (C) Oocytes bosette til bunnen av brønnen under inkubasjonstiden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En rekke mindre trinn under protokollen sikrer vellykket fluorescens og nøyaktig antall mRNAs. Protokollen må først utføres umiddelbart etter innsamling og fiksering av oocytes. Merk at PVP legges til 4% paraformaldehyde fiksering bufferen slik at oocytes henger sammen. Vi fant at det er nødvendig å utføre eksperimentet umiddelbart etter innsamling og fiksering av oocytes. Forsinkelser resulterer i en mye lavere fluorescens signal som vil føre til undercounting av transkripsjoner. Dette skyldes delvis RNA degradering. Mer enn 20 oocytes skal overføres til en brønn i 6-vel platen samtidig, og hver vel bør bare brukes en gang. Inkubasjon ganger bør også nøyaktig følges uten forkorte eller forlenge av hvert trinn. Unntaket er vaske bufferen trappene; oocytes kan bli værende i vaskebuffer for en lengre tid uten å endre de eksperimentelle resultatene. SM-fisk sonder finnes i tre fluorescens kanaler C1 og C2, C3. For multiplexing, ikke bland sonder som har den samme kanal koden. Dette vil medføre både sonder fluorescing på samme utslipp bølgelengde gjengivelse analysen umulig som det ikke vil være noen måte å skille mellom sonde. Positiv kontroll sonder designet mot housekeeping gener er tilgjengelige i hver av de tre kanalene. Negativ kontroll sonder (f.eks DapB) er også tilgjengelig i ferdigblandet sett som inneholder en kode for alle tre kanaler. Eksperimentet må være gjennomført i svak belysning som oocytes er lysfølsom etter fjerning fra oviduct17,18. Etter tillegg av fluorophores knyttet til AMP4, bør trinnene utføres med som lite lys som mulig å hindre bleking av fluorophore. Til slutt, når du monterer oocytes på histologiske lysbilder, forsiktig plassere dekkglassvæske for å unngå forvrengning av oocyte og dannelse av bobler som kan forstyrre bildebehandling. Hvis du finner det vanskelig å unngå celle forvrengning, bør lysbilde avstandsstykker brukes for å opprettholde sfærisk form av oocyte.

En viktig endring av protokollen er utskifting av permeabilization, og vaskebuffere i kommersielt tilgjengelig kit. Proprietære protease og hybridisering bufferne gitt er tøffe miljøer for oocytes men er nødvendig for å lykkes med protokollen. Hvis ikke brukes, er forsterkerne ikke angi cellen som sannsynligvis på grunn av samling av forgrenede DNA. Flytte oocytes fra disse tøffe miljøer til relativt milde permeabilization og vaskebuffere, designet for immunofluorescence14, viste seg tilstrekkelig for suksessen av protokollen og samtidig forhindret lysis av oocytes. Fordi oocytes og preimplantation embryoer ikke overholder et histologiske lysbilde, var en annen viktig endring plassere oocytes til buffere i et godt av en kultur parabol. Vi brukte en 6-og embryo kultur plate. Hver brønn i platen har konisk og skrånet sider og en 8 mm flat bunn (figur 7), som forbedrer oocyte utvinning. Dette er spesielt viktig ettersom oocytes mister ildfaste egenskaper og blir nesten gjennomsiktig hybridisering bufferne.

Når du overfører oocytes fra brønn til godt, er det viktig å sikre at oocytes fullstendig senkes i løsningene i hver brønn som celler vil flyte når først overført til hver brønn (figur 7A). Når de er mekanisk senket i bufferen (figur 7B), vil de synke å bunnen av brønnen på slutten av inkubering (figur 7C). Unntaket er AMP 1 og AMP 3; Når mekanisk senket oocytes gjør ikke helt bosette til bunnen av brønnen. Du finner disse oocytes, må du endre flyet av fokus. Pipetter forsiktig og teller antall celler overføres for å hindre tap.

Flere enkelt molekyl fisk teknikker, som utdyper fluorescerende signalet i stedet for cDNA, inkludert forgrenet DNA kjemikalier, har vært utviklet 9,19. Kommersielt tilgjengelige kits har optimalisert metoden for forgrenet DNA SM-fisk reproduserbar deteksjon av personlige mRNAs i vev deler eller tilhenger celler i et histologiske lysbilde. Protokollen beskrevet her er endret for bruk med ikke-tilhenger enkeltceller (f.eks oocytes og preimplantation embryo)3. Dette gjør ikke bare bestemte og reproduserbar kvantifisering, men også lokalisering av en mRNA innenfor oocyte. Mens dette er en fordel analysen, er det selvfølgelig begrensninger. For eksempel, i motsetning til RNA-sekvensering, kan det ikke identifisere roman mRNAs. En ekstra begrensning av protokollen er tilgjengeligheten av transkripsjon-spesifikke sonder. Proprietære sonder er kommersielt tilgjengelige fra firmaer som selger SM-fisk-sett. Det er flere sonder som er pre-laget. Andre kan utvikles av selskapet for noen kommenterte mRNA bruker en objektiv algoritmen10. Men hvis en mRNA er dårlig sekvensert det ville være vanskelig å design sonder med høy spesifisitet. For kort utskrifter kan det også være vanskelig å identifisere nok sonde par som ikke cross-react med andre transkripsjoner redusere spesifisiteten av analysen. Likeledes, færre sonde sett kan være tilstrekkelig til å produsere fluorescens signalet over sperregrensen for søking som positive i stedet finne og sporing Program. I denne samme ånd, kan ikke transkripsjon varianter registreres med denne metoden.

Til tross for begrensningene beskrevet ovenfor, finnes det flere programmer for SM-fisk. For eksempel data fra enkelt celle RNA-sekvensering kan valideres spesielt når cellen tallene er små og vanskelig å få (f.eks oocytes og embryo). Forsterkning av cDNA for PCR analyser introduserer en eksperimentell feil som er vanligvis redusert med en normalisering steg med dataene fra stabilt uttrykt housekeeping gener. Temporal endringer i oocyte gjennom før implantasjon embryo endres imidlertid også uttrykk for housekeeping gener. SM-fisk protokollen forsterker fluorescens i stedet for cDNA. Derfor er det ingen krav til normalisering av transkripsjon-spesifikke mRNA nivåer å oppnå reproduserbar resultater med lite variasjon. Nøyaktig på grunn av variasjon av PCR primer effektivitet, forskjeller i det absolutte antallet ulike mRNA arter kan ikke sammenlignes i eller mellom celletyper. SM-fisk regionaliserer og kvantifiserer mRNA. Derfor kan det brukes til å identifisere hvilke celler uttrykke mRNA i en mikset-celle befolkningen. For eksempel når oocytes vokser i primær eller sekundær follikler, hårsekken kan isolert og kultivert i alginate perler20 men separasjon av oocyte fra somatiske celler er vanskelig. Derfor har sekvenser og PCR studier blitt utført med blandet celle populasjoner. Bruk av SM-fisk kan avgjøre hvis mRNAs er oppdaget i somatiske celler eller oocyte til hårsekken. Til slutt, SM-fisk har høy sensitivitet og spesifisitet tillater for påvisning av lavt overflod transkripsjoner; for eksempel oppdagelsen av Nanog i MII oocytes (figur 5).

Lagring og nedbrytning av mRNAs er viktige forskrifter mekanismer for protein uttrykk. Post-transcriptional regulering av oversettelse, lagring og fornedrelse er formidlet av proteiner som binder seg til mRNAs21. Foreløpig kan RNA-protein immunoprecipitation (RIP) rutinemessig utføres når et stort antall celler er tilgjengelig22. På grunn av det store antallet Xenopus egg som kan hentes fra en enkelt dyr, blitt RIP vellykket utført i denne dyr modellen. Det er imidlertid vanskelig å få nok pattedyr oocytes og før implantasjon embryo utføre RIP. Kopling av SM-fisk og immunofluorescence (immunoFISH) holde 23 av vev potensial til å visualisere proteiner tilknyttet bestemte mRNAs inkludert translasjonsforskning maskiner24,25. Genomics måle genetisk varianter (f.eks liten nukleotid polymorfismer, SNPs) knyttet til helse og sykdom26. Phenomics identifiserer endringer i mobilnettet svar på grunn av miljøbelastningene27,28. Nåværende forskning som mål å finne mekanismen som knytter endringer i genomet bestemt fenotyper. Bruk av immunoFISH har potensial til å koble SNP-avhengige endringer i mRNA uttrykk og uttrykk for proteiner som bidrar til mobilnettet fenotyper. Som teknologien utvikler seg, er det trolig andre programmer av SM-fisk som identifiserer viktige mekanismer i flere biologiske systemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å fortolle

Acknowledgments

Vi takker Dr. Daniel R. Larson for hans sjenerøs hjelp med installasjon og bruk av sted å finne og sporing Program 13 og teknisk støtte fra University of Nebraska Lincoln mikroskopi kjernen for AC confocal mikroskopi avbilding. Denne studien representerer et bidrag på University of Nebraska Agricultural Research Division, Lincoln, Nebraska og ble støttet av UNL Luke midler (NB-26-206/tiltredelse-232435 og NB-26-231/tiltredelse-1013511).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-α-Lipoic acid Sigma-Aldrich T1395 Alpha Lipoic Acid
Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid MP Biomedicals, LLC 199899 FAF BSA
BD 10mL TB Syringe Becton, Dickinson and Company 309659 10 mL syringe
BD PrecisionGlide Needle Becton, Dickinson and Company 305109 27 1/2 gauge needle
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 CaCl2-2H2O
Citric acid Sigma-Aldrich C2404 Citrate
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 Glucose
Disodium phosphate Na2HPO4
Easy Grip Petri Dish Falcon Corning 351008 35 mm dish
Edetate Disodium Avantor 8994-01 EDTA
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08 Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors
Fetal Bovine Serum Atlanta biologicals S10250 FBS
Gentamicin Reagent Solution gibco 15710-064 Gentamicin
GlutaMAX-I (100X) gibco 35050-061 Glutamax
Gold Seal Micro Slides Gold Seal 3039 25 x 75mm slides
Gonadotropin, From Pregnant Mares' Serum Sigma G4877 eCG
hCG recombinant NHPP AFP8456A hCG
Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes Sigma-Aldrich H3884 Hyaluronidase
Jewelers Style Forceps Integra 17-305X Forceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw
L-(+)-Lactic Acid, free acid  MP Biomedicals, LLC 190228 L-Lactate
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M2773 MgSO4-7H2O
MEM Nonessential Amino Acids Corning  25-025-Cl NEAA
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-C 25 x 25x 0.15 mm cover slips
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe Advanced Cell Diagnostics 501891-C2 Nanog Probe
Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe Advanced Cell Diagnostics 501611-C3 Pou5f1 Probe
MOPS Sigma-Aldrich M3183
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Paraformaldehyde
PES 0.22 um Membrane -sterile Millex-GP SLGP033RS 0.22 um filters
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich P0930 PVP
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60128 KCl
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 60218 KH2PO4
Prolong Gold antifade reagent invitrogen P36934 Antifade reagent without DAPI
RNAscope DAPI Advanced Cell Diagnostics 320858 DAPI
RNAscope FL AMP 1 Advanced Cell Diagnostics 320852 Amplifier 1
RNAscope FL AMP 2 Advanced Cell Diagnostics 320853 Amplifier 2
RNAscope FL AMP 3 Advanced Cell Diagnostics 320854 Amplifier 3
RNAscope FL AMP 4 ALT A Advanced Cell Diagnostics 320855 Amplifier 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT B Advanced Cell Diagnostics 320856 Amplifier 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT C Advanced Cell Diagnostics 320857 Amplifier 4 ALT C
RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit Advanced Cell Diagnostics 320851 FISH Reagent Kit
RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics 320871 Negative Control
RNAscope Probe 3-plex Positive Control Advanced Cell Diagnostics 320881 Positive Control
RNAscope Probe Diluent Advanced Cell Diagnostics 300041 Probe Diluent
RNAscope Protease III Advanced Cell Diagnositics 322337 Protease III
RNAscope Protease III & IV Reagent Kit Advanced Cell Diagnostics 322340 FISH Protease Kit
RNAscope Protease IV Advanced Cell Diagnostics 322336 Protease IV
S/S Needle with Luer Hub 30G Component Supply Co. NE-301PL-50 blunt 30 gauge needle
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 NaHCO3
Sodium chloride Sigma-Aldrich S6191 NaCl
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 306576 NaOH
Sodium pyruvate, >= 99% Sigma-Aldrich P5280 Pyruvate
Solution 6 Well Dish Agtechinc D18 6 well dish
Taurine Sigma-Aldrich T8691 Taurine
Tissue Culture Dish Falcon Corning 353002 60 mm dish
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Triton X-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  2. MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors. Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).
  3. Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos. Scientific Reports. 8 (1), 7930 (2018).
  4. Ruebel, M. L., et al. Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).
  5. Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).
  6. Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo. PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).
  7. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).
  8. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  9. Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
  10. Derti, A., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
  11. Larson, B., Malayter, D., Shure, M. Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging. BioTek Application Notes. , https://www.biotek.com/resources/application-notes/multiplexed-detection-of-cytokine-cancer-biomarkers-using-fluorescence-rna-in-situ-hybridization-and-cellular-imaging/ 1-5 (2016).
  12. Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. Single β-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability. Science. 343 (6169), 419-422 (2014).
  13. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  14. Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).
  15. Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte. Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).
  16. Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice. Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).
  17. Hirao, Y., Yanagimachi, R. Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro. Journal of Experimental Zoology. , (1978).
  18. Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).
  19. Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).
  20. Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals. Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).
  21. Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs. Cells. 5 (1), 4 (2016).
  22. Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).
  23. Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution. Scientific Reports. 7 (1), 16459 (2017).
  24. Voigt, F., et al. Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).
  25. Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods in Enzymology. 572, Elsevier Inc. (2016).
  26. Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).
  27. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nature Reviews Genetics. 11, 855 (2010).
  28. Freimer, N., Sabatti, C. The Human Phenome Project. Nature Genetics. 34, 15 (2003).

Tags

Genetikk problemet 146 Oocyte mRNA kvantifisering mRNA lokalisering ikke-tilhenger celler fluorescens i situ hybridisering forgrenede DNA
Bruk av ett molekyl fluorescerende i Situ hybridisering (SM-fisk) å kvantifisere og Localize mRNAs i Murine Oocytes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Timme, K. R., Wood, J. R. Use of… More

Timme, K. R., Wood, J. R. Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes. J. Vis. Exp. (146), e59414, doi:10.3791/59414 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter