Summary
Försäljningsbonus reproducibly numrerar av mRNA i enskilda oocyter, enda molekyl RNA fluorescens in situ var hybridisering (RNA-fisk) optimerad för icke-anhängare celler. Oocyter samlades, hybridiseras med de avskrift särskilda sonderna och kvantifieras med hjälp av ett bildbehandlingsprogram för kvantifiering.
Abstract
Nuvarande metoder som rutinmässigt används för att kvantifiera mRNA i oocyter och embryon inkluderar digital omvänd-transkription polymeras-kedjereaktion (dPCR), kvantitativa, real-time RT-PCR (RT-qPCR) och RNA-sekvensering. När dessa tekniker utförs med en enda äggcell eller embryo, upptäcks låg-kopia mRNA inte tillförlitligt. För att lösa detta problem, kan oocyter eller embryon poolas tillsammans för analys. Detta leder dock ofta till hög variation bland prover. I detta protokoll beskriver vi användningen av fluorescens in situ hybridisering (FISH) med hjälp av förgrenade DNA kemi. Denna teknik identifierar det rumsliga mönstret av mRNA i enskilda celler. När tekniken är tillsammans med plats att hitta och spårningsprogramvara, kan mängden av mRNA i cellen också kvantifieras. Med denna teknik, finns det nedsatt variabilitet inom en experimentell grupp och färre oocyter och embryon krävs för att identifiera betydande skillnader mellan experimentella grupper. Kommersiellt tillgängliga Grenade-DNA SM-fisk Kit har optimerats för att påvisa mRNA i sektionerad vävnader eller fastsittande celler på bilderna. Men oocyter effektivt följer inte bilder och vissa reagenser i kit var för hård vilket resulterar i äggcellen lysis. För att förhindra detta lysis, har flera ändringar gjorts i fisk-kit. Specifikt, ersatte äggcell permeabilisering och tvätta buffertar för immunofluorescens av oocyter och embryon de egenutvecklade buffertarna. Den permeabilisering, tvättar och inkubationer med sonder och förstärkare utfördes i 6-bra plattor och oocyter placerades på bilder i slutet av protokollet med montering media. Dessa ändringar skulle kunna övervinna begränsningarna av kommersiellt tillgängliga kit, i synnerhet äggcellen Lys. För att korrekt och reproducibly räkna antalet mRNA i enskilda oocyter, användes datorprogram. Tillsammans, utgör detta protokoll ett alternativ till PCR och sekvensering för att jämföra uttrycket av specifika avskrifter i enstaka celler.
Introduction
Transkriptas polymeras-kedjereaktion (PCR) har varit den gyllene standarden för mRNA kvantifieringsmetoden. Två analyser, digital PCR (dPCR)1 och kvantitativa, real time PCR (qPCR)2 används för närvarande. Av de två PCR-teknikerna har dPCR större känslighet än qPCR tyder på att det kunde användas att mäta mRNA överflöd i enstaka celler. Dock i våra händer producerat dPCR analys av låg överflöd mRNA i pooler av 5 till 10 ägg per varje experimental prov data med låg reproducerbarhet och hög variation3. Detta beror sannolikt på den experimentella fel i samband med RNA-extraktion och omvänd transkription effektivitet. RNA-sekvensering har också utförts med ett enda musklick och mänskliga äggceller4,5. Denna teknik kräver cDNA förstärkning steg krävs för bibliotek produktion vilket sannolikt ökar variationen inom en experimentell grupp. Låg överflöd avskrifter kan dessutom inte upptäckas. Även om sekvensering priserna har gått ner de senaste åren, kan det fortfarande vara kostnadseffektivt oöverkomliga på grund av de höga kostnaderna för bioinformatik analyser. Slutligen, mRNA lokalisering är en dynamisk process med rumsliga förändringar bidrar till protein funktion6. Därför har vi ställt ut för att anta en teknik som skulle ge exakta och reproducerbara kvantitativa åtgärder och lokalisering av enskilda mRNA i enda oocyter.
Grenad DNA kopplat till fluorescens in situ hybridisering förstärker fluorescens signal i stället för ljudförstärkande RNA/cDNA möjliggör detektering av enda mRNA i enskilda celler 7,8,9. Analysen utförs genom en serie av hybridisering, amplifiering (med förgrenade DNA) och fluorescens märkning steg för att förstärka fluorescens signal7. Tekniken börjar med bindningen av 18 - till 25-base oligonukleotiden sonden par som kompletterar en specifik mRNA3,8,10. Femton till tjugo sonden par är utformade för varje avskrift säkerställa specificitet för målet avskriften. MRNA-specifika hybridisering följs av förförstärkare och slutsteg sonder som bildar en förgrenad konfiguration. Ungefärligt binder 400 etikett fluorophores till varje förstärkare, vilket resulterar i en 8000-fold ökning fluorescens som möjliggör identifiering av enskilda mRNA (figur 1)11.
Figur 1: Schematisk av protokollet SM-fisk. Sekventiell hybridisering av avskrift specifika sond, grenad DNA förstärkare och fluorophore till ett mål som mRNA visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tidigare studier med enda molekyl fluorescens i situ hybridisering (SM-fisk) lokaliserade β-aktin mRNA i enskilda nervceller12 och humant papillomvirus DNA i livmoderhalscancer cell linjer7. Det datorprogram som plats att hitta och spåra programmet identifierar enskilda punktuell fluorescerande signalen och har framgångsrikt använts för att kvantifiera antalet mRNA i varje cell3,13.
Baserat på resultaten av mRNA detection i nervceller12, hypotesen vi att SM-fisk skulle visa sig vara ett användbart verktyg att kvantifiera avskrift nivåer i murina oocyter och embryon inklusive låg överflöd mRNA. Men tekniken är optimerad för användning med vidhäftande fast celler och formaldehyd fast paraffin inbäddade (FFPE) vävnadssnitt. Oocyter kan inte följa en bild, även när de är belagda med Poly-L-Lysin. Dessutom är de mer ömtålig än somatiska celler och vävnadssnitt resulterar i cellen lysis när de utsätts för vissa av de egenutvecklade buffertarna i kommersiellt tillgängliga kit3. För att övervinna dessa utmaningar, var oocyter fast och manuellt överförs mellan droppar av buffertar. Dessutom byttes permeabilisering och tvätta buffertar i kits för att minska cellys. Fördesignade sonder köps tillsammans med fisk kit eller specifika avskrifter kan begäras. Varje egenutvecklade probe set finns i en av tre fluorescens kanaler (C1, C2 och C3) för att låta för multiplexering. I det nuvarande experimentet var murina oocyter dual-färgade och kvantifieras med hjälp av en C2 Nanog sond och en C3 Pou5f1 sond. Dessa sonder valdes baserat på rapporterade uttryck för Nanog och Pou5f1 i oocyter och embryon. Vid avslutningen av hybridisering steg placerades oocyter i droppar anti fade montering media för ansökan till histologiska bilder. Confocal bilder har använts för att kvantifiera antalet punktuell fluorescerande signaler som företräder enskilda mRNA. Förutom att kvantifiera mRNA, imaging visade också den rumsliga fördelningen av specifika mRNA i cellen, är som andra RNA kvantifiering metoder oförmögen att uppnå. Denna teknik visade sig ha låg variabilitet inom en experimentell grupp som medger användning av mindre antal ägg i varje experimentell grupp att identifiera betydande skillnader mellan experimentella grupper3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djur förfaranden var granskad och godkänd av institutionella djur vård och användning kommittén vid University of Nebraska-Lincoln och alla metoder utfördes i enlighet med tillämpliga riktlinjer och förordningar. För denna studie, CD-1 utkonkurrerat dö ut möss hade ad libitum tillgång till normala gnagare chow och vatten; de bibehölls i en 12:12 mörka: ljus cykel.
1. beredning av krävs media
- För base media (OMM), lägga till 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO4och 1,7 mM CaCl2-2 H2O i 100 mL sterilt vatten.
Obs: OMM medium kan lagras i upp till 1 månad. - För komplett media (OMOPS), Lägg till 20 mM 3-morpholinopropane-1-sulfonsyra (moppar), 1,2 mM MgSO4-7 H2O, 0,5 mM glukos, 6 mM L-laktat, 1 mM ala-gln, 0,1 mM taurin, 1 x icke-essentiella aminosyror (NEAA), syra () 0,01 mM etylendiamintetraättiksyra EDTA), 10 µM alfaliponsyra, 10 µg/mL outspädd gentamicin, 21 mM 1 M NaOH, 5 mM NaHCO3, 0,2 mM Pyruvat, 0,5 mM citrat, 4 mg/mL FAF BSA en 1:10 utspädning av OMM i sterilt vatten för en total volym om 100 mL. Sterilisera medium med 0,22 µM filter.
Obs: OMOPS kan lagras i upp till 1 vecka. - Lägga till 5% fetalt bovint serum OMOPS för jordbruksföretaget mediet (HM). Gör 2 mL HM per mus.
- Lägg till 0,1 mg/mL av hyaluronidas som härrör från nötkreatur testiklarna, 1 ml HM hyaluronidas lösning.
- För fixering bufferten kombinera 4% paraformaldehyd i 10 mL 1 x PBS tillsammans med 0,1% embryo grade polyvinylpyrrolidon (PVP)14.
- För att förbereda 50 mL tvättbuffert (WB), tillsätt 0,1% icke-jonisk tensid och 0,1% PVP till 1 x PBS14.
- Att förbereda 10 mL permeabilisering buffert, lägga till 1% icke - joniskt ytaktivt ämne 1 x PBS14.
Obs: Tvätta och permeabilisering buffertar ovan ersätter egenutvecklade buffertarna i kommersiellt tillgängliga kits.
2. insamling av ägglossning oocyter från honmöss
- Förberedelser:
- Stimulera honmöss vid 5-8 veckors ålder av intraperitoneal (IP) injektion av 5 IE equine koriongonadotropin (EKG) följt av 5 IE humant koriongonadotropin (hCG) 44-48 h senare15,16.
- Hålla 35 mm petriskålar innehållande 2 mL HM på en 37 ° C värmande tallrik. Pipettera en, 100-µL droppe HM som innehåller utspädda hyaluronidas följt av tre, 50 µL droppar HM utan hyaluronidas i en 60 mm petriskål. Placera plattor som innehåller droppar på 37 ° C uppvärmningen tallrik före användning.
Obs: Hyaluronidas dropparna bör göras strax före dissektion av varje äggledaren par att förhindra avdunstning och halt av beståndsdelarna av HM med eller utan hyaluronidas.
- Euthanize möss, 16 h efter IP-injektion av hCG, med isofluran överdosering följt av cervikal Dislokation.
- Rengöra musen med 70% etanol. Exponera bukhålan och visualisera de kvinnliga fortplantningsorganen. Håll äggstocken med pincett och ta bort uterina ligament och överskott adipose vävnad från runt äggstockarna. Skär i äggledaren från livmodern och placera äggstock-äggledaren paret i varma HM i 35 mm skålen.
- Ta bort äggstockar och alla omgivande fettvävnad. Riv den svullna ampulla av den äggledaren med en ½ tum 27 gauge nål. Tryck på äggledaren på platsen för tår och de cumulus cell-äggcell komplex (COC) kommer att utvisas. Överföra ovulated oocyterna, som förmodas vara i metafas II (MII) av meios, till 100 μL släppa innehållande HM media med hyaluronidas med munnen pipett (figur 2).
Figur 2 : Delar av munnen vi rekommenderar som används för att överföra oocyter. (A) mun bit (B) 0.22 um, 4 mm filter (C) hygienfilter slangar (D) 1000 μl Pipettera tip (E) 9 ”Pasteur Pipettera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Pipettera MII äggcell-cumulus cell komplexen upp och ner i det hyaluronidas som innehåller HM med munnen pipetten rubba cumulus celler. Överföra varje äggcell, när de saknar cumulus celler till en tvätt sjunka innehållande HM bara använder munnen pipetten. Upprepa detta för varje tvätt droplet. Över inte fragmenterade eller transparent oocyter15.
Obs: Det är viktigt att överföra oocyterna från varje droppe i 35 mm skålen med som lite HM som möjligt. Detta gäller för varje överföring i protokollet. MII oocyterna förbli inte i det hyaluronidas som innehåller HM medium för mer än en minut.
3. SM-fisk färgning av oocyter
- Fixa oocyter i en enskild brunn 6-well platta innehållande 500 µL av fixering buffert. Dränka 20 oocyter eller mindre i brunnen. Inkubera i 20 min i rumstemperatur.
Obs: Varje SM-fisk färgning steg sker inom en enskild brunn i en 6-väl konisk tallrik. Säkerställa att oocyter är helt nedsänkt i buffertar och inte flytande ovanpå bufferten. Varje steg bör vara utförda med 20 oocyter eller mindre i varje brunn. - Överför fasta oocyter till 500 μL tvättbuffert (WB beskrivs i steg 1,6) i 10 min varje. Upprepa 2 gånger.
- Inkubera oocyter i permeabilisering buffert för 30 min i rumstemperatur.
Obs: Permeabilisering bufferten beskrivs i steg 1,7 ersätter anständighet permeabilisering bufferten.- Samla in sonden uppsättningar och snabbt snurra dem ner i en mikrocentrifug. Varm varje sond för 10 min i en 40 ° C vattenbad eller inkubator. Kyl till rumstemperatur.
Obs: Detta steg bör utföras under permeabilisering ruvning
- Samla in sonden uppsättningar och snabbt snurra dem ner i en mikrocentrifug. Varm varje sond för 10 min i en 40 ° C vattenbad eller inkubator. Kyl till rumstemperatur.
- Tvätta oocyter i 500 µL av WB under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Överföra oocyter till 80 μl av proteashämmare III buffert (tillgänglig från kit), som är utspädd 1:8 i 1 X PBS, i 30 min i rumstemperatur.
Obs: 80 µL volymen tillräckligt täcker botten av en enskild brunn i en 6-bra platta. - Tvätta oocyter i 500 µL av WB under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Späd den värmda probe set för Nanog, Pou5f1, och DapB (en negativ kontroll genen), 1:50 i sonden spädningsvätska. Inkubera oocyter i 80 μl av avskrift-specifika sonden i 2 timmar vid 40° C.
Obs: Varje egenutvecklade probe set finns i en av tre fluorescens kanaler (C1, C2 och C3). Nanog och Pou5f1 sonderna har taggats med C2 och C3, respektive. - Värma egenutvecklat, förstärkare 1 (AMP 1), förstärkare 2 (AMP2), förstärkare 3 (AMP3) och förstärkare 4-fluorescens (AMP 4-FL) vid rumstemperatur.
Obs: Detta steg bör utföras under 2 timmar avskrift-specifika sonden ruvning. - Överföra oocyterna till 500 μL av WB och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Inkubera oocyter sekventiellt i förstärkning buffertar.
- Inkubera oocyter i 80 µL AMP1 för 30 min vid 40° C. överföring oocyter till 500 µL av WB under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Inkubera oocyter i 80 µL AMP2 för 15 min vid 40 ° C. Överföra oocyter till 500 µL av WB under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Inkubera oocyterna i 80 µL AMP3 för 30 min vid 40 ° C. Överföra oocyter till 500 µL av WB under 10 minuter vid rumstemperatur.
Obs: Resten av protokollet utförs i mörkret eftersom AMP-FL innehåller fluorophore. När du arbetar under mikroskopet dissekera, minska ljuset så mycket som möjligt. - Lägga till oocyter i 80 μl av AMP4-FL för 15 min vid 40° C.
Obs: AMP4-FL tillhandahålls som alternativa buffert-A (Alt-A), Alt-B eller Alt-C. Välj AMP4-FL bufferten beroende på vilka utsläpp våglängd önskas.
- Tvätta oocyter i 500 µL av WB under 10 minuter vid rumstemperatur. Inkubera oocyter i 80 µL DAPI i 20 min i rumstemperatur. Tvätta oocyter i 500 µL av WB för 5 min i rumstemperatur.
- Pipettera 12 µL av anti-fading montering media på mitten av en bild utan att lägga till bubblor reagensen. Överför oocyter med som lite WB som möjligt till montering media och Lägg på ett täckglas.
- Luta täckglaset i vinkel och långsamt och försiktigt placera över vätskan i bilden. Undvik att trycka på täckglaset alltför svårt att hindra snedvridning av oocyter och införandet av bubblor.
- Lagra bilder i en mörk låda att torka över natten i rumstemperatur. Täck kanterna bilder i genomskinligt nagellack att försegla täckglas.
- Använda en standard Mikroskop för att hitta oocyter på bild och cirkeln med en permanent spritpenna.
Obs: Detta steg är inte nödvändigt men förbättrar att lokalisera oocyter i bilden. För bästa resultat, bild bilder inom 1 till 5 dagar som fluorescerande signalen börjar blekna.
4. bildbehandling
- Bild 3-dimensionell oocyterna, använder z steg konfokalmikroskopi.
Obs: För att korrekt analysera bilderna, varje z steg bör vara 1,0 µm/skiva. - Spara confocal bilder som en komprimerad nd2 eller enskilda. TIFF-filer för varje äggcell. Båda bildtyper är kompatibel med öppen källkod bild bearbetningsprogram, Fiji.
- Ladda ner och installera programvaran öppna Fiji (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- Dra nd2 filer till Fiji och välja hyperstack. Om confocal bilder var sparade som. TIFF-filer hoppa till steg 4,4.
Obs: När filen nd2 tappas in Fiji hyperstack listrutan ska visas automatiskt. - Klicka på fliken bild , Välj färgoch klicka på Split kanaler för att separera de fluorescerande kanalerna av filen nd2.
- Generera individuella. TIFF-filer för varje z-skiva av äggcellen i varje fluorescerande kanal. Klicka på fliken bild , Välj stackaroch klicka på Stack till bilder. Klicka på fliken bild , Välj typoch klicka på RGB-färg för att konvertera varje z-skiva till en individuell RGB-färgbild.
Obs: RGB-färgen är konstgjord och kan väljas som önskas för varje utsläpp våglängd. - Spara varje konverterade bilden som. TIFF-fil. Placera bilder från en enda äggcell för varje fluorescerande kanal i en ny mapp för att undvika förvirring under sömmar (steg 4,3).
- Dra nd2 filer till Fiji och välja hyperstack. Om confocal bilder var sparade som. TIFF-filer hoppa till steg 4,4.
- Normalisera varje. TIFF-bild för Pou5f1 och Nanog använda negativ kontroll bilder (DapB).
Obs: Normalisering utförs med hjälp av ett fotoredigeringsprogram. Se till att ta bort samma nivåer av bakgrunden fluorescens från varje kontroll bild. - Öppna varje normaliserade. TIFF-fil i Fiji att sy ihop alla z-segment för varje äggcell i varje våglängd.
- Klicka på fliken Plugins , Välj syoch klicka på Rutnätet/samling (figur 3A). Välj Sekventiell bilder från rullgardinsmenyn och Klicka på OK (figur 3B).
- Bläddra i katalogen och välj den mapp som innehåller alla z-slice bilder för en enskild äggcell vid en våglängd (se steg 4.3.4). Klicka på OK.
- Flytta skjutreglaget längst ned på sydda bilden till kanalen lämplig färg för den våglängd som används och skapa den slutliga RGB sydda bilden genom att klicka på bilden, välja typen, och klicka på RGB-färg.
Obs: Den här bilden kommer att användas för fluorescens kvantitering beskrivs i steg 4,6 nedan.
- Konvertera sydda bilden till 32-bitars maximal projicerad bild. Klicka på bilden, Välj typoch klicka på 32-bitars (figur 3 c). Spara bilden som en ny. TIFF-fil.
Figur 3 : Sy ihop confocal z-serie bilder av oocyter. (A) skärmdump visar verktyget Plug-in rutnät/samling i Fiji som användes för att producera sammansatta bilder av en äggcell. (B) sekventiella bilder använder fluorescens överlappning mellan sekventiella. TIFF-filer för att generera en sammansatt bild. (C) den sammansatta bilden sparades som ett 32-bitars. TIFF-fil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Hämta och installera plats att hitta och spåra Program13, som är tillgängliga från webbplatsen för D.R. Larson, utredare vid nationella institut för hälsa National Cancer Institute (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson). Hämta och installera den öppna virtuella för interaktiva data språk (IDL) operativsystemet som krävs för att köra plats att hitta och programmet för att spåra (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf).
- Öppna i 32-bitars, sydda bild, som skapades i steg 4,6 (figur 4A), i plats att hitta och spåra Program. Välj den lokalisera rullgardinsmenyn och klicka på lokalisera (figur 4B), som beräknar antalet fläckar i bilden.
Notera: Varje plats räknas representerar en enskild mRNA. Bandet passerar och photon tröskel inställningar visas i skärmbilden (figur 4B). För detta protokoll användes standard för varje tröskelvärde inställning. Representant positiva och bakgrunden fläckar visas (figur 4 c).
Figur 4 : Kvantifiering av mRNA med Spot Finder och spårning. (A) individuella z-serie bilder var ihopsydda som beskrivs i figur 3 och sparas som ett 32-bitars maximum projiceras. TIFF-fil. (B) sammansatt bild öppnades i Spot Finder och spårning. Lokalisera var brukade räkna fluorescerande fläckarna (röd ruta). Band pass och photon tröskelvärdet markeras med den blå rutan. (C) den blå pilen pekar på en positiv signal (över tröskelvärdet). Den vita pilen visar en fluorescerande plats under tröskelvärdet och därför räknas inte. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter slutförandet av protokollet, kommer att leda enskilda bilder från confocal z-serien (figur 4A och figur 5), sydda bilder (figur 4 c), och mRNA räknar (figur 4B). När multiplexing utförs, kommer det också finnas sammanslagna bilder visar etiketten för två olika mRNA (figur 5). MRNA räkningarna genereras med hjälp av sydda bilder som genereras av Fiji (figur 3) och punktuell fluorescens fläckarna räknas med hjälp av plats att hitta och spåra Program (figur 4B).
MRNA räkningarna analyseras därefter med ett verktyg för analys av standarddata. I detta protokoll, vi märkt n = 12 oocyter med Pou5f1 och Nanog. Resultaten för varje mRNA är i genomsnitt och standardavvikelsen för medelvärdet beräknas. Datainsamlingen i detta protokoll visade 775 ± 26 SEM Pou5f1 avskrifter och 113 ± 5 SEM Nanog avskrifter i MII oocyter (figur 5). En Students t-test fastställs en statistiskt signifikant skillnad i mRNA räknar mellan Pou5f1 och Nanog. Ännu viktigare, det fanns inga ställen som upptäckts i n = 5 oocyter som är märkta med DapB sond (dvs negativ kontroll). Observera små standardfel använder bara 12 individuella oocyter. Analysens känslighet framhävs också av positiva reproducerbar upptäckt av Nanog(figur 5). Tidigare dPCR experiment upptäcka reproducibly inte Nanog som anger att antalet Nanog mRNA i en individuell äggcell understiger tröskelvärdet detektion med dPCR 3.
I pilotförsök upptäckt vi reducerad fluorescens om det var en fördröjning mellan fixering av oocyter och initiering av protokollet SM-fisk. Likaså om egenutvecklade hybridisering buffertar inte används, den sonden och förstärkning förgrenade DNA inte ange cellen vilket resulterar i fluorescens ringade runt plasmamembranet av en äggcell. Detta beror sannolikt på aggregering av förgrenade DNA. Ringmärkta fluorescens runt äggcellen membranet resulterar också om det finns dålig permeabilisering av plasmamembranet. Det krävs också optimal nedbrytning av protein bunden till mRNA. Proteas bufferten i SM-fisk kit är en optimal koncentration för behandling av vävnadssnitt och vidhäftande celler. När du använder icke-anhängare celler, är det dock viktigt att empiriskt fastställa bästa proteas utspädning. För lite proteas buffert kan resultera i undercounting av mRNA på grund av dålig tillgänglighet av sonden till mRNA. Likaså för mycket proteas kan leda till nedbrytning av inte bara proteiner bunden till mRNA men också destabilisering av mRNA. I detta protokoll, vi testade mRNA detection använda en titrerkurvan outspädd (1:1), 1:4, 1:8 och 1:12 utspädda proteas buffert i 1 x PBS (n = 2 till 3 oocyter per utspädning). Den genomsnittliga fluorescerande uttrycket Pou5f1 mRNA i MII oocyter var 169 ± 42 SEM (outspädd), 176 36 ± SEM (1:4), 308 ± 18 SEM (1:8) och 445 ± 24 SEM (1:12) (figur 6). Proteas-utspädning som användes i detta protokoll var 1:8 som det visade den lägsta variationen.
Figur 5 : Pou5f1 och Nanog mRNA i MII äggcellen. (A). representativa bilder av mellersta z-serie bilden visas till vänster. Pou5f1 upptäcks i rött (647 nm) våglängd medan Nanog upptäcks i gröna (488 nm) våglängd. DAPI färgning av kromosomer justerade på metafas II spindeln, kännetecknar den MII äggcellen, visas i vitt. Det fanns ingen färgning för DapB i antingen 647 nm eller 488 nm utsläpp våglängd. (B) antalet Pou5f1 och Nanog mRNA visas som betyder SEM (n = 12 oocyter); Det fanns ingen upptäckt (Norell) av DapB. * indikerar P < 0,05, skalstapeln är 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6 : Empiriska titrering av proteashämmare buffert att optimera korrekt räkna av mRNA. Representativa bilder av SM-fisk av Pou5f1 i MII oocyter. DAPI färgning visar kromosomer justerade på MII spindeln. Oocyter inkuberades med outspädd (1:1), 1:4 eller 1:8 1:12 utspädningar av proteashämmare III buffert. Antalet Pou5f1 mRNA (n = 2-3 oocyter) räknades och medelvärdet för SEM visas. Skalstapeln är 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7 : Överföring av MII oocyter genom fixering, proteas och hybridisering buffertar i brunnar i en 6-väl plattan. Formen på varje brunn visas. (A) celler flyta när först läggas till buffertar (B) nedsänkning oocyter i buffertar. (C) oocyter bosätta sig till botten av brunnen under inkubationstiden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En serie smärre steg under protokollet kommer att säkerställa framgångsrika fluorescens och korrekt räkningarna av mRNA. Det första måste protokollet utföras omedelbart efter insamling och fixering av oocyterna. Observera att PVP är 4% paraformaldehyd fixering bufferten att förhindra oocyter fastnar till varandra. Vi hittade att det är nödvändigt att utföra experimentet omedelbart efter insamling och fixering av oocyterna. Varje försening resulterar i en mycket lägre fluorescens signal som skulle leda till undercounting av avskrifter. Detta beror delvis på RNA nedbrytning. Högst 20 oocyter ska överföras till en brunn i 6-väl plattan på en gång och var väl bör endast användas en gång. Inkubationstider bör också följas noggrant utan förkortning eller förlängning av varje steg. Undantaget är de wash buffer steg; oocyter kan lämnas i tvättbuffert under en längre tid utan att ändra experimentella resultat. SM-fisk sonderna finns i tre fluorescens kanaler C1, C2 och C3. För multiplexering, blanda inte sonder som har samma kanal tagg. Detta kommer att resultera i både sonder som fluorescerar vid samma utsändande våglängd rendering analys omöjligt eftersom det kommer att finnas något sätt att skilja mellan sonden uppsättningar. Positiv kontroll sonder utformad mot städning gener finns i varje av de tre kanalerna. Negativ kontroll sonder (t.ex. DapB) finns också i färdigblandad set som innehåller en tagg för alla tre kanaler. Experimentet behöver genomföras i svagt ljus som oocyter är ljuskänslig efter borttagning från äggledaren17,18. Efter tillägg av den fluorophores som bifogas AMP4, bör stegen utföras med så lite ljus som möjligt för att förhindra blekning av fluorophore. Slutligen, vid montering av oocyter på histologiska bilder, noggrant placera täckglaset för att förhindra snedvridning av äggcellen och bildandet av bubblor som kan störa imaging. Om du tycker att det är svårt att undvika cell snedvridning, bör slide distanser användas för att bibehålla sfäriska formen av en äggcell.
En väsentlig ändring av protokollet är byte av permeabilisering och tvätta buffertar i kommersiellt tillgängliga kit. De egenutvecklade proteas och hybridisering buffertar som tillhandahålls är hårda miljöer för oocyterna men krävs för att lyckas i protokollet. Om inte används, är förstärkarna oförmögna att ange cellen, vilket beror sannolikt på aggregering av förgrenade DNA. Flyttar oocyterna från dessa tuffa miljöer till relativt milda permeabilisering och tvätta buffertar, avsedd för immunofluorescens14, visade sig vara tillräcklig för att lyckas i protokollet och samtidigt förhindrat Lys av oocyterna. Eftersom oocyter och preimplantatorisk embryon inte följer en histologisk bild, var en annan viktig ändring att placera oocyterna i buffertar inom en väl av en kultur maträtt. Vi använde en 6-väl embryo kultur plattan. Varje brunn i plattan har avsmalnande och sluttande sidor och en 8 mm platt botten (figur 7), vilket förbättrar äggcellen återhämtning. Detta är särskilt viktigt eftersom oocyter förlorar sina eldfasta egenskaper och bli nästan genomskinliga i hybridisering buffertar.
När du överför oocyter från brunn till brunn, är det viktigt att säkerställa att oocyterna är fullständigt nersänkta i lösningarna i varje brunn som celler kommer att flyta när först överförs till varje brunn (figur 7A). När de är mekaniskt dränka in i bufferten (figur 7B), kommer de sjunka till botten av brunnen i slutet av inkubationen (figur 7 c). Undantaget är AMP 1 och AMP 3; När mekaniskt dränka oocyter do inte helt lösa till botten av brunnen. För att hitta dessa oocyter, kan du behöva ändra plan fokus. Pipettera omsorgsfullt och räkna antalet celler som överförs för att förhindra förlust.
Flera enda molekyl fisk tekniker, som förstärker signalen fluorescerande snarare än cDNA, inklusive förgrenade DNA kemiska sammansättningar, har utvecklat 9,19. Kommersiellt tillgängliga Kit har optimerat förgrenade DNA SM-fisk metoden för reproducerbar upptäckt av enskilda mRNA i vävnadssnitt eller fastsittande celler på en histologisk bild. Protokollet beskrivs här har modifierats för användning med enstaka icke-anhängare celler (t.ex. oocyter och preimplantatorisk embryon)3. Detta gör inte bara specifika och reproducerbara kvantifiering utan även lokalisering av en mRNA inom äggcellen. Detta är en fördel för analysen, finns det naturligtvis begränsningar. Till exempel, till skillnad från RNA-sekvensering, kan inte det identifiera roman mRNA. En ytterligare begränsning av protokollet är tillgången på avskrift-specifika prober. Egenutvecklade sonder är kommersiellt tillgängliga från de företag som säljer de SM-fisk-kit. I området i närheten finns det flera sonder som är färdiga. Andra kan vara utformade av företaget för någon kommenterad mRNA som använder en algoritm för objektiva10. Dock om en mRNA dåligt sekvenseras det vore svårt att design sonder med hög specificitet. För kort avskrifter kan det också vara svårt att identifiera tillräckligt sond-par som inte korsreagerar med andra avskrifter minska analysens specificitet. Jämväl, ett mindre antal sonden uppsättningar kan vara otillräckligt att producera fluorescens signal över tröskeln för upptäckt som positivt i plats att hitta och spåra Program. I denna samma anda, inte kan avskrift varianter upptäckas med denna metod.
Trots de begränsningar som beskrivs ovan, finns det flera program för SM-fisk. Till exempel data från enstaka cell RNA-sekvensering kunde verifieras särskilt när cell nummer är små och svåra att få (t.ex., oocyter och embryon). Förstärkning av cDNA för PCR-analyser introducerar ett experimentella fel som förminskas vanligtvis av en normalisering steg med hjälp av data från stabilt uttryckt städning gener. Tidsmässiga förändringar i äggcellen genom preimplantatorisk embryon ändrar emellertid också uttrycket av städning gener. SM-fisk protokollet förstärker fluorescens i stället för cDNA. Därför finns det inga krav på normalisering av avskrift-specifika mRNA nivåer att erhålla reproducerbara resultat med låg variabilitet. På grund av variationer i PCR-primer effektivitet, kan inte skillnaderna i absoluta antalet olika mRNA arter jämföras exakt inom eller mellan celltyper. SM-fisk lokaliserar och kvantifierar mRNA. Det kan därför användas för att identifiera vilka celler express mRNA i en blandad cell befolkningen. Till exempel när oocyter växer inom primära eller sekundära folliklar, follikeln kan vara isolerade och odlade i alginat pärlor20 men separation av äggcellen från kroppsceller är svårt. Därför, sekvensering och PCR-studier har utförts med blandad cellpopulationer. Användningen av SM-fisk kan avgöra om mRNA upptäcks i somatiska celler eller donerad av follikeln. Slutligen, SM-fisken har hög känslighet och specificitet som möjliggör identifiering av låg överflöd avskrifter; till exempel upptäckt av Nanog i MII oocyter (figur 5).
Lagring och nedbrytning av mRNA är viktiga reglerande mekanismer för proteinuttryck. Post-transcriptional reglering av översättning, lagring och nedbrytning medieras av proteiner som binder till mRNA21. RNA-protein immunoprecipitation (RIP) kan för närvarande utföras rutinmässigt när ett stort antal celler är tillgängliga22. På grund av det stora antalet Xenopus ägg som kan samlas in från ett enskilt djur, har RIP framgångsrikt utförts i denna djurmodell. Det är dock svårt att få tillräckligt däggdjur oocyter och preimplantatorisk embryon att utföra RIP. 23 i vävnadssnitt koppling av SM-fisk och immunofluorescens (immunoFISH) och håll potential att visualisera proteiner associerade med specifika mRNA inklusive translationell maskiner24,25. Genomik mäta genetiska varianter (t.ex. små nukleotid polymorfismer, SNP) associerade med hälsa och sjukdom26. Phenomics identifierar förändringar i cellulära svar på grund av miljöbelastningar27,28. Aktuell forskning syftar till att hitta den mekanism som förbinder förändringar i genomet med specifika fenotyper. Användningen av immunoFISH har potential att länka SNP-beroende förändringar i mRNA uttryck och uttrycket av proteiner som bidrar till cellulära fenotyper. Som tekniken utvecklas, finns det sannolikt andra tillämpningar av SM-fisk som identifierar viktiga mekanismer i flera biologiska system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att förklara
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Daniel R. Larson för hans generösa hjälp med installation och användning av plats att hitta och spåra Program 13 och tekniskt stöd från University of Nebraska Lincoln mikroskopi kärnan för konfokalmikroskopi bildtagning. Denna studie utgör ett bidrag av universitetar av Nebraska jordbruks forskningsavdelning, Lincoln, Nebraska och stöddes av UNL Hatch medel (NEB-26-206/anslutningen nummer-232435 och NEB-26-231/anslutningen nummer-1013511).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (±)-α-Lipoic acid | Sigma-Aldrich | T1395 | Alpha Lipoic Acid |
| Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid | MP Biomedicals, LLC | 199899 | FAF BSA |
| BD 10mL TB Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 10 mL syringe |
| BD PrecisionGlide Needle | Becton, Dickinson and Company | 305109 | 27 1/2 gauge needle |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | CaCl2-2H2O |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | Citrate |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | Glucose |
| Disodium phosphate | Na2HPO4 | ||
| Easy Grip Petri Dish | Falcon Corning | 351008 | 35 mm dish |
| Edetate Disodium | Avantor | 8994-01 | EDTA |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta biologicals | S10250 | FBS |
| Gentamicin Reagent Solution | gibco | 15710-064 | Gentamicin |
| GlutaMAX-I (100X) | gibco | 35050-061 | Glutamax |
| Gold Seal Micro Slides | Gold Seal | 3039 | 25 x 75mm slides |
| Gonadotropin, From Pregnant Mares' Serum | Sigma | G4877 | eCG |
| hCG recombinant | NHPP | AFP8456A | hCG |
| Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes | Sigma-Aldrich | H3884 | Hyaluronidase |
| Jewelers Style Forceps | Integra | 17-305X | Forceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw |
| L-(+)-Lactic Acid, free acid | MP Biomedicals, LLC | 190228 | L-Lactate |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M2773 | MgSO4-7H2O |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-Cl | NEAA |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-C | 25 x 25x 0.15 mm cover slips |
| Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe | Advanced Cell Diagnostics | 501891-C2 | Nanog Probe |
| Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe | Advanced Cell Diagnostics | 501611-C3 | Pou5f1 Probe |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Paraformaldehyde |
| PES 0.22 um Membrane -sterile | Millex-GP | SLGP033RS | 0.22 um filters |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P0930 | PVP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60128 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60218 | KH2PO4 |
| Prolong Gold antifade reagent | invitrogen | P36934 | Antifade reagent without DAPI |
| RNAscope DAPI | Advanced Cell Diagnostics | 320858 | DAPI |
| RNAscope FL AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 320852 | Amplifier 1 |
| RNAscope FL AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 320853 | Amplifier 2 |
| RNAscope FL AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 320854 | Amplifier 3 |
| RNAscope FL AMP 4 ALT A | Advanced Cell Diagnostics | 320855 | Amplifier 4 ALT A |
| RNAscope FL AMP 4 ALT B | Advanced Cell Diagnostics | 320856 | Amplifier 4 ALT B |
| RNAscope FL AMP 4 ALT C | Advanced Cell Diagnostics | 320857 | Amplifier 4 ALT C |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320851 | FISH Reagent Kit |
| RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics | 320871 | Negative Control |
| RNAscope Probe 3-plex Positive Control | Advanced Cell Diagnostics | 320881 | Positive Control |
| RNAscope Probe Diluent | Advanced Cell Diagnostics | 300041 | Probe Diluent |
| RNAscope Protease III | Advanced Cell Diagnositics | 322337 | Protease III |
| RNAscope Protease III & IV Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 322340 | FISH Protease Kit |
| RNAscope Protease IV | Advanced Cell Diagnostics | 322336 | Protease IV |
| S/S Needle with Luer Hub 30G | Component Supply Co. | NE-301PL-50 | blunt 30 gauge needle |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S6191 | NaCl |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 306576 | NaOH |
| Sodium pyruvate, >= 99% | Sigma-Aldrich | P5280 | Pyruvate |
| Solution 6 Well Dish | Agtechinc | D18 | 6 well dish |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | Taurine |
| Tissue Culture Dish | Falcon Corning | 353002 | 60 mm dish |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Triton X-100 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors. Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).
- Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos. Scientific Reports. 8 (1), 7930 (2018).
- Ruebel, M. L., et al. Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).
- Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).
- Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo. PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).
- Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
- Derti, A., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
- Larson, B., Malayter, D., Shure, M. Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging. BioTek Application Notes. , https://www.biotek.com/resources/application-notes/multiplexed-detection-of-cytokine-cancer-biomarkers-using-fluorescence-rna-in-situ-hybridization-and-cellular-imaging/ 1-5 (2016).
- Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. Single β-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability. Science. 343 (6169), 419-422 (2014).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).
- Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte. Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).
- Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice. Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).
- Hirao, Y., Yanagimachi, R. Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro. Journal of Experimental Zoology. , (1978).
- Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).
- Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).
- Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals. Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).
- Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs. Cells. 5 (1), 4 (2016).
- Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).
- Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution. Scientific Reports. 7 (1), 16459 (2017).
- Voigt, F., et al. Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).
- Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods in Enzymology. 572, Elsevier Inc. (2016).
- Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).
- Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nature Reviews Genetics. 11, 855 (2010).
- Freimer, N., Sabatti, C. The Human Phenome Project. Nature Genetics. 34, 15 (2003).
