इस प्रोटोकॉल में, हम प्रदर्शित करते हैं और कैसे cardiomycyte भेदभाव और शुद्धि के लिए मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करने पर विस्तृत, और आगे, कैसे Rho-संबद्ध प्रोटीन kinase अवरोध करनेवाला के साथ अपने प्रत्यारोपण दक्षता में सुधार करने के लिए पर एक माउस मायोकार्डियल इंफार्क्शन मॉडल में पूर्व उपचार।
मायोकार्डियल पुनर्जनन के लिए सेलुलर चिकित्सा प्रभावशीलता में सुधार लाने में एक महत्वपूर्ण कारक सुरक्षित रूप से और कुशलता से सेल engraftment दर में वृद्धि करने के लिए है. Y-27632 Rho-associated, coiled-कुंडल युक्त प्रोटीन kinase (RhoA/ROCK) का एक अत्यधिक शक्तिशाली अवरोध करनेवाला है और वियोजन प्रेरित सेल apoptosis (anoikis) को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि Y-27632 मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomycytes (HIPSC-CMs+RI) के लिए pretreatment तीव्र मायोकार्डियल इंफार्क्शन (एमआई) के एक माउस मॉडल में एक सेल engraftment दर में सुधार में प्रत्यारोपण के परिणाम से पहले. यहाँ, हम Y-27632 के साथ hiPSC-CMs भेदभाव, शुद्धि, और सेल pretreatment की एक पूरी प्रक्रिया का वर्णन, साथ ही जिसके परिणामस्वरूप सेल संकुचन, कैल्शियम क्षणिक माप, और माउस एमआई मॉडल में प्रत्यारोपण. प्रस्तावित विधि एक सरल, सुरक्षित, प्रभावी, और कम लागत वाली विधि प्रदान करती है जो सेल engraftment दर को काफी बढ़ाती है। इस विधि केवल अन्य तरीकों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता आगे सेल प्रत्यारोपण दक्षता बढ़ाने के लिए, लेकिन यह भी अन्य हृदय रोगों के तंत्र के अध्ययन के लिए एक अनुकूल आधार प्रदान करता है.
स्टेम सेल आधारित उपचार एमआई1की वजह से हृदय क्षति के लिए एक इलाज के रूप में काफी क्षमता दिखाई है. विभेदित HIPSCs का उपयोग HIPSC-CMs2 का एक अटूट स्रोत प्रदान करता है और सफलता उपचार के तेजी से विकास के लिए दरवाजे खोलता है। हालांकि, चिकित्सीय अनुवाद के लिए कई सीमाएं बनी हुई हैं, प्रत्यारोपित कोशिकाओं की गंभीर रूप से कम engraftment दर की चुनौती भी शामिल है.
ट्रिप्सिन के साथ कोशिकाओं को अलग करने से एनोकिकिस3शुरू होता है, जो केवल एक बार इन कोशिकाओं को इस्केमिक मायोकार्डियम जैसे कठोर वातावरण में इंजेक्ट किए जाने के बाद त्वरित होता है, जहां हाइपोक्सिक वातावरण सेल मौत की ओर पाठ्यक्रम को तेज करता है। शेष कोशिकाओं में से, एक बड़ा अनुपात प्रत्यारोपण साइट से खून में धोया जाता है और परिधि में फैल जाता है। एक प्रमुख apoptotic रास्ते में से एक RhoA / रॉक पथ4है. पिछले अनुसंधान के आधार पर, RhoA/ROCK मार्ग actin cytoskeletal संगठन5,6, जो सेल रोग7,8के लिए जिम्मेदार है नियंत्रित करता है. रॉक अवरोधक Y-27632 व्यापक रूप से दैहिक और स्टेम सेल वियोजन और passaging के दौरान प्रयोग किया जाता है , सेल आसंजन बढ़ाने के लिए और सेल apoptosis9को कमकरने केलिए ,10,11. इस अध्ययन में, Y-27632 सेल engraftment दर को बढ़ाने के प्रयास में प्रत्यारोपण से पहले HIPSC-सीएम के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है.
सेल engraftment दर में सुधार करने के उद्देश्य से कई तरीकों, गर्मी सदमे और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग12के रूप में, स्थापित किया गया है. इन तरीकों के अलावा, आनुवंशिक प्रौद्योगिकी भी कार्डियोमायोसाइट प्रसार को बढ़ावा कर सकते हैं13 या कार्डियोमायोसाइट्स14में nonmyocardial कोशिकाओं रिवर्स . जैव इंजीनियरिंग के नजरिए से, कार्डियोमायोसाइट्स को प्रत्यारोपण दक्षता15में सुधार करने के लिए बायोमैटेरियल पाड़ पर बीज दिया जाता है। दुर्भाग्य से, इन तरीकों के बहुमत जटिल और महंगा कर रहे हैं. इसके विपरीत, यहाँ प्रस्तावित विधि सरल, लागत कुशल, और प्रभावी है, और यह प्रत्यारोपण से पहले एक बेसल उपचार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही अन्य प्रौद्योगिकियों के साथ संयोजन में.
इस अध्ययन के प्रमुख कदमों में शुद्ध HIPSC-CMs प्राप्त करना, Y-27632 pretreatment के माध्यम से HIPSC-CMs की गतिविधि में सुधार, और अंत में, एक माउस एमआई मॉडल में HIPSC-सीएम की एक सटीक राशि प्रत्यारोपण शामिल हैं.
यहाँ संबोधित…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों कृपया उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Fluc-GFP निर्माण और डॉ Yanwen लियू प्रदान करने के लिए डॉ जोसेफ सी वू (स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय) धन्यवाद. इस अध्ययन के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों RO1 अनुदान HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (जे.जेड.) के लिए, और HL121206A1 (एल.जेड.), वैज्ञानिक अनुदान HL14267 (एक अमेरिकी अनुदान के लिए) द्वारा समर्थित है 16SDG30410018, और बर्मिंघम संकाय विकास अनुदान में अलबामा विश्वविद्यालय (W.$).
Reagent | |||
Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment and Supplies | |||
IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
High Speed Camera | pco | 1200 s | |
Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibody | |||
Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
GAPDH | Abcam | ab22555 | |
Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Matlab | MathWorks | R2016A | |
Image J | NIH | 1.52g |