Summary
Dans ce protocole, nous démontrons et élaborons sur la façon d'utiliser les cellules souches pluripotentes induites par l'homme pour la différenciation et la purification des cardiomyocytes, et en outre, sur la façon d'améliorer son efficacité de transplantation avec l'inhibiteur de kinase de protéine Rho-associé prétraitement dans un modèle d'infarctus du myocarde de souris.
Abstract
Un facteur crucial dans l'amélioration de l'efficacité de la thérapie cellulaire pour la régénération myocardique est d'augmenter en toute sécurité et efficacement le taux d'engraftment cellulaire. Y-27632 est un inhibiteur très puissant de la kinase de protéine rho-associée, enroulée-contenante de cire (RhoA/ROCK) et est employé pour empêcher l'apoptose de cellules dissociation-induite (anoikis). Nous démontrons que le prétraitement de Y-27632 pour les cardiomyocytes pluripotents induits par l'homme de cellules souches (hiPSC-CMs'RI)avant l'implantation a comme conséquence une amélioration de taux d'engraftment de cellules dans un modèle de souris de l'infarctus aigu du myocarde (MI). Ici, nous décrivons une procédure complète de différenciation, de purification, et de prétraitement cellulaire de hiPSC-CMs avec Y-27632, aussi bien que la contraction cellulaire résultante, les mesures transitoires de calcium, et la transplantation dans les modèles de MI de souris. La méthode proposée fournit une méthode simple, sûre, efficace et peu coûteuse qui augmente considérablement le taux d'engraftment cellulaire. Cette méthode ne peut pas seulement être utilisée en conjonction avec d'autres méthodes pour améliorer davantage l'efficacité de la transplantation cellulaire, mais fournit également une base favorable pour l'étude des mécanismes d'autres maladies cardiaques.
Introduction
Les thérapies à base de cellules souches ont montré un potentiel considérable comme traitement pour les dommages cardiaques causés par MI1. L'utilisation de hiPSC différenciés fournit une source inépuisable de hiPSC-CMs2 et ouvre la porte au développement rapide de traitements révolutionnaires. Cependant, de nombreuses limitations à la traduction thérapeutique demeurent, y compris le défi du taux d'engraftment sévèrement bas des cellules implantées.
Dissociation des cellules avec trypsine initie anoikis3, qui n'est accélérée qu'une fois que ces cellules sont injectées dans des environnements difficiles comme le myocarde ischémique, où l'environnement hypoxique accélère le cours vers la mort cellulaire. Parmi les cellules restantes, une grande proportion est lavée du site d'implantation dans la circulation sanguine et répandue dans toute la périphérie. L'une des principales voies apoptotiques est la voie RhoA/ROCK4. Basé sur des recherches antérieures, la voie RhoA/ROCK régule l'organisation cytosquelettique actine5,6, qui est responsable du dysfonctionnement cellulaire7,8. L'inhibiteur ROCK Y-27632 est largement utilisé lors de la dissociation et de la passification somatiques et des cellules souches, pour augmenter l'adhérence cellulaire et réduire l'apoptose cellulaire9,10,11. Dans cette étude, Y-27632 est utilisé pour traiter les hiPSC-CMs avant la transplantation dans une tentative d'augmenter le taux d'engraftment cellulaire.
Plusieurs méthodes visant à améliorer le taux d'engraftment cellulaire, telles que le choc thermique et le revêtement de matrice de membrane de sous-sol12,ont été établies. Mis à part ces méthodes, la technologie génétique peut également favoriser la prolifération des cardiomyocytes13 ou inverser les cellules nonmyocardiques en cardiomyocytes14. Du point de vue de la bioingénierie, les cardiomyocytes sont ensepépins sur un échafaudage biomatériau pour améliorer l'efficacité de la transplantation15. Malheureusement, la majorité de ces méthodes sont compliquées et coûteuses. Au contraire, la méthode proposée ici est simple, rentable et efficace, et elle peut être utilisée comme traitement basal avant la transplantation, ainsi que dans la conjugaison avec d'autres technologies.
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Protocol
Toutes les procédures relatives aux animaux de cette étude ont été approuvées par le Comité institutionnel des soins et de l'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université de l'Alabama à Birmingham et étaient fondées sur les Lignes directrices sur les soins et l'utilisation des animaux des National Institutes of Health Laboratory (Publication des NIH No 85-23).
1. Préparation des plaques de la culture et des médias culturels
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Préparation moyenne
- Pour le milieu hiPSC, mélanger 400 ml de milieu basal pluripotent humain (hPSC) (Tableaudes matériaux 1) et 100 mL de supplément hPSC 5x; conserver le mélange à 4 oC.
- Pour le RPMI 1640/B27 moins l'insuline (RB-) moyen, mélanger 500 ml de RPMI 1640 et 10 ml de supplément B27 moins l'insuline.
- Pour le milieu RPMI 1640/B27 (RBMD), mélangez 500 ml de RPMI 1640, 10 ml de supplément B27 et 5 mL d'antibiotique pénicilline-streptomycine (pen-streptocoque).
- Pour le milieu de purification16, mélanger 500 mL de RPMI sans glucose 1640, 10 ml de supplément B27, 5 ml d'antibiotique pen-streptocoque, et 1 000 l de solution de sodium DL-lactate (à une concentration finale de 4 mM).
- Pour la solution neutralisante, mélanger 200 mL de RPMI 1640, 50 ml de sérum bovin fœtal (FBS), 2,5 mL d'antibiotique pen-streptocoque et 50 oL de Y-27632 (à une concentration finale de 10 M).
- Pour le milieu de congélation, mélanger 9 ml de FBS, 1 ml de sulfoxide de diméthyle (DMSO) et 10 l de Y-27632 (à une concentration finale de 10 M).
- Pour la solution de matrice extracellulaire (SME), décongeler concentré matrice extracellulaire (Tableau des matériaux 1) à 4 oC jusqu'à ce qu'il ait atteint un état liquide uniformément cohérente. Précool pipette pointes et tubes avant de faire des aliquots de matrice de 350 L chacun sur la glace, et de stocker les aliquots à -20 oC. Avant d'enrober les plaques, diluer un aliquot décongelé en 24 ml de milieu DMEM/F12 glacé (SME); maintenir le SME à 4 oC jusqu'à 2 semaines.
REMARQUE: Effectuer toutes les étapes de revêtement sur la glace pour empêcher la solidification de la matrice de la membrane du sous-sol. - Pour la solution de Tyrode, prenez 90 % du volume final requis d'eau de qualité de culture tissulaire, ajoutez la quantité appropriée des réactifs suivants et remuez jusqu'à dissolution. Ensuite, utilisez 1 N NaOH pour ajuster le pH à 7,4. Ajouter de l'eau supplémentaire à une concentration finale de 140 mmol/L de chlorure de sodium, 1 chlorure de magnésium mmol/L, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L de chlorure de potassium, 10 mmol/L de glucose et 1,8 mmol/L de chlorure de calcium. Stériliser par filtration, à l'aide d'une membrane de 0,22 m.
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Revêtement de plaque de culture cellulaire
- Pour les plaques de culture hiPSC, appliquer 1 ml d'EMS sur chaque puits d'une plaque de 6 puits et incuber la plaque pendant au moins 1 h à 37 oC. Aspirez la solution DMEM/F12 avant d'ensemencer des cellules.
- Pour le revêtement de gélatine, dissoudre 0,2 g de poudre de gélatine dans l'eau de qualité de culture tissulaire pour faire une solution de 0,2 % (w/v). Stériliser en autoclactant à 121 oC, 15 psi pendant 30 min. Enrober chaque puits d'une assiette de 6 puits avec 2 ml de la solution et couver pendant 1 h à 37 oC. Avant de passer les cellules, aspirez la solution et laissez la plaque sécher pendant au moins 1 h à température ambiante à l'intérieur du capuchon de culture tissulaire.
2. entretien hiPSC et ddifférenciation cardiomyocyte
- Culture les hiPSCs dans le milieu hiPSC (voir l'étape 1.1.1) avec un changement quotidien de milieu jusqu'à ce que les cellules atteignent 80%-90% confluence par puits.
REMARQUE: Pour des raisons d'entretien, les hiPSC sont généralement prêts pour le passage tous les 4 jours. - Pour passer hiPSCs, aspirer le milieu et laver le puits 1x avec 1x phosphate tamponné saline (PBS). Ajouter 0,5 ml de solution de détachement de cellules souches (tableaudes matériaux 1) à chaque puits et incuber à 37 oC pendant 5 à 7 min.
REMARQUE: Le temps d'incubation dépend de la densité des cellules et du taux de dissociation, qui peut être observé au microscope. - Neutraliser la solution de détachement de cellules souches avec 1 ml de milieu hiPSC complété par 5 M Y-27632. Recueillir le mélange dans un tube centrifugeuse de 15 ml. Centrifuger le tube pendant 5 min à 200 x g, aspirer le supernatant sans déranger le granule cellulaire, puis, resuspendre les cellules dans 1 ml de milieu hiPSC contenant 5 M Y-27632.
- Ensemencez les hiPSC sur une nouvelle plaque de 6 puits recouverte de SME à un rapport entre 1:6 à 1:18. Changer le milieu à hiPSC milieu sans Y27632 après 24 h.
- Pour congeler les cellules, resuspendre les hiPSC dissociés dans un milieu de congélation à une concentration de 0,5 à 1 million/500 l, placer la suspension dans des cryovials et les conserver dans un congélateur de -80 oC. Transférer les flacons congelés à l'azote liquide après 24 h.
- Pour différencier, remplacez le milieu hiPSC par 2 ml de RB- milieu complété par 10 'M GSK-3' inhibiteur CHIR99021 (CHIR) à 80%-90% de la confluence cellulaire. Remplacer le milieu par 3 ml de RB- moyen après 24 h et couver pendant 48 h supplémentaires (jour 3).
- Le jour 3, changer le milieu à 3 ml de RB- milieu avec 10 M Wnt inhibiteur IWR1 pendant 48 h (jour 5), puis remplacer le milieu par 3 ml de RB- moyen et maintenir pendant 48 h (jour 7).
- Le jour 7, remplacer le milieu par 3 ml de rb moyen et changer le milieu tous les 3 jours à l'avenir. Le battement spontané des hiPSC-CMs devrait être observé entre les jours 7-10.
3. hiPSC-CMs Purification et prétraitement des petites molécules
REMARQUE: Des enzymes de dissociation cellulaire hautement purifiées et recombinantes (tableaudes matériaux 1) ont été utilisées pour dissocier les hiPSC-CM.
- Le jour 21 après la différenciation hiPSC-CM, aspirer le milieu et laver les cellules 1x avec PBS stérile. Incuber les cellules avec 0,5 ml d'enzymes de dissociation cellulaire par puits pendant 5 à 7 min à 37 oC. Pipette à plusieurs reprises la suspension de la cellule à l'aide d'une pipette de 1 ml afin de dissocier complètement les cellules.
- Après que les cellules soient dissociées, ajouter 1 ml de solution neutralisante à chaque puits, recueillir le mélange de cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et centrifugeuse à 200 x g pendant 3 min. Jeter le supernatant et resuspendre les cellules dans la solution neutralisante.
- Replantez les cellules sur des plaques de 6 puits recouvertes de gélatine à une densité de 2 millions de cellules par puits.
- Après 24 à 48 h, remplacer le milieu de culture par un milieu de purification pendant 3 à 5 jours.
REMARQUE: La purification est complète lorsque plus de 90 % des cellules de chaque champ de vision du microscope battent. Pour éviter d'autres dommages aux cardiomyocytes, ne prolongez pas la durée de purification au-delà de 5 jours. Si le premier tour ne donne pas la pureté nécessaire, remplacez le milieu de purification par un milieu RBMD pendant 1 jour, puis complétez un deuxième cycle de purification. - Avant la transplantation, la culture des cellules dans le groupe de traitement pendant 12 h dans le milieu de RBmD complété avec 10 'M Y-27632. De la même façon, effectuez un traitement verapamil sur les cellules du milieu de la RBavec 1 m verapamil pendant 12 h (hiPSC-CM- VER).
- Après le traitement, laver le hiPSC-CMs 1x avec PBS et couver les cellules avec 0,5 ml d'enzymes de dissociation cellulaire par puits pendant un maximum de 2 min. À plusieurs reprises pipette la suspension cellulaire, à l'aide d'une pipette de 1 ml, pour dissocier soigneusement les cellules. Neutraliser les cellules avec une solution neutralisante, recueillir le mélange cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 ml, et centrifugeuse à 200 x g pendant 3 min. Resuspendre les cellules en PBS à une concentration de 0,1 million de cellules/5 l en préparation à l'injection.
4. Infarctus du myocarde et transplantation cellulaire
REMARQUE: Tous les instruments chirurgicaux sont presterilisés avec autoclave et sont maintenus dans un état aseptique pendant les chirurgies multiples par l'intermédiaire d'un stérilisateur chaud de perle (tableau des matériaux 2).
- Anesthésiez les souris NOD/scid(tableau des matériaux 2) avec l'isoflurane inhalé (1,5 % à 2 %). Surveillez les niveaux d'anesthésie par les réponses des souris à une pincée d'orteil. Placez l'onguent optique vétérinaire sur les yeux pour les empêcher de sécher pendant la chirurgie.
- Fournir 0,1 mg/kg de buprénorphine sous-cutanée pour la gestion de la douleur avant la chirurgie.
- Placez et fixez la souris en position de supine sur une table d'opération chauffée, retirez les cheveux de la région du cou ventral et du thorax gauche à l'aide d'une crème dépilatoire, exposez la peau et désinfectez-la avec 70 % d'alcool.
- Couper une incision de 0,5 cm au centre du cou à l'aide de ciseaux chirurgicaux, séparer la graisse sous-cutanée avec des forceps stériles, et exposer la trachée. Introduire oralement la canule d'intubation dans la trachée, connecter la canule à un petit ventilateur animal, et ajuster les paramètres de ventilation (régler le volume de marée à 100 à 150 l et le taux de respiration à 100x -150x par min).
- Après la stabilisation de la souris, couper une incision de 0,5 cm au milieu de la peau de la poitrine gauche. Utilisez des forceps pour séparer la couche musculaire et faire une petite incision dans le cinquième espace intercostal pour exposer la cavité thoracique. Placez le rétracteur dans l'incision pour ouvrir la cavité thoracique et localiser l'artère coronaire descendante gauche (LAD). Sous un microscope chirurgical disséquant, ligate le LAD avec un 8-0 suture non absorbable.
- Immédiatement après l'induction de l'IM, injectez 5 ll de hiPSC-CM-RI, hiPSC-Cms'RI, hiPSC-CMs-VER, hiPSC-CMs'VER, ou un volume égal de PBS dans le myocarde de la souris à chaque site (3 x 105 cellules/animal, 1 x 105 cellules/site), une dans la zone infarctus et deux dans les zones autour de l'infarctus.
REMARQUE: Étant donné que 5 L est un volume très faible, il n'est pas facile de contrôler avec précision le volume en le suçant directement avec une seringue. Le couvercle d'un plat stérile Petri peut être retourné, et 5 l des cellules peuvent d'abord être déposés sur le couvercle avec une pipette. En raison de la tension de surface, il ne se propagera pas mais se condensera en une petite masse liquide. Cela peut être facilement absorbé et injecté dans le myocarde de la souris. - Éliminez l'air résiduel dans la cavité thoracique en le remplissant d'une solution saline isotonique chaude. Coudre les côtes, les muscles et la peau dans l'ordre avec une suture absorbable 6-0. Éteignez l'injection d'anesthésie isoflurane. Gardez les animaux de chirurgie sur le coussin chauffant et observez-les de près pendant qu'ils reprennent conscience. Ensuite, placez les animaux dans une cage propre. Ne remettez pas les animaux en compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'ils soient complètement récupérés.
- Après la chirurgie, injecter aux souris par voie intrapéritone de buprénorphine (0,1 mg/kg) tous les 12 h pendant 3 jours consécutifs et leur injecter de l'ibuprofène (5 mg/kg) tous les 12 h pendant une journée. Effectuer des études d'analyse ultérieures à des moments précis.
REMARQUE: Suivez les directives de votre comité local de soins aux animaux pour l'analgésie.
5. Enregistrement de la passagère et de la contractilité du calcium
- Plaquedh de 15 mm de diamètre (Tableaudes matériaux 2) et pinceà d'œil dans un petit bécher en verre à 121 oC, 15 psi pendant 15 min. Prérefroidir les couvercles et les pinces à 4 oC.
- À l'aide de la pince à épiler, placez le bordereau de couverture dans une plaque de 12 puits et une pipette de 300 l de matrice extracellulaire sur chaque bordereau.
REMARQUE: Ne laissez pas la matrice dépasser le bord de la glissière de couverture pour éviter de réduire la quantité de revêtement de matrice. Incuber la plaque de 12 puits dans un incubateur de culture cellulaire de 37 oC pendant 1 h. - Aspirez le milieu dans la plaque de 6 puits recouverte de gélatine avec hiPSC-CM purifiés, lavez-le 1x avec du PBS, puis digérez-le avec 0,5 ml d'enzymes de dissociation cellulaire pendant 1,5 min. Ajouter 1 ml de solution neutralisante, pipette à plusieurs reprises pour pas plus de 5x-10x avec une pipette de 1 ml avec une pipette de 1 ml avec une pipette de 1 ml avec une pipette de 1 ml , et centrifuger le mélange à 200 x g pendant 3 min.
- Aspirez la matrice extracellulaire enduite des couvertures. Comptez le numéro de cellule et resuspendez les cellules dans la solution neutralisante à une concentration de 40 000/300 l, puis ajoutez 300 L de la suspension cellulaire sur chaque bordereau. Culture de l'assiette dans un incubateur de 37 oC.
- Après 24 h, aspirez doucement la solution neutralisée, ajoutez 500 l de moyenne de RB à chaque puits de la plaque, et continuez à la culture pendant 2 jours.
- Ajouter Y-27632 (10 M), Rho kinase activateur (RA, 100 nM), verapamil (1 M), ou un volume égal de PBS dans le milieu de culture de hiPSC-CMs, 12 h avant la détection de la passation de calcium et de la contractilité.
REMARQUE: En plus de la détection du taux de calcium transitoire et de la contractilité des cellules après 12 h de traitement chimique, la détection de ces paramètres a également été testée à 12, 24, 48 et 72 h après retrait chimique. - Sortir l'assiette, jeter le milieu et laver la plaque 1x avec du PBS. Changer le milieu à un DMEM sans phénol contenant 0,02 % (w/v) de polyol surfactant (Tableau des matériaux 1), indicateur de calcium de 5 M ( Tableau desmatériaux 1), et le Y-27632 correspondant (10 M), RA (100 nM), verapamil (1 M), ou un volume égal PBS, et incuber la plaque pendant 30 min à 37 oC.
- Jeter le supernatant, laver les cellules 3x avec un milieu DMEM sans colorant, et laisser reposer le milieu pendant 30 min pour désestersifier le colorant cartographique.
- Placez la plaque de couverture ensemiée de cellules dans une chambre de bain ouverte et insérez la chambre dans un système de microincubation à 37 oC avec un contrôleur automatique de température (Tableau des matériaux 2), perférez-le avec la solution de Tyrode, et ajoutez continuellement Inhibiteur de kinase de Rho (RI), RA, ou PBS à la solution de perfusion.
- Utilisez un microscope à fluorescence inversée (Tableau des matériaux 2) et une tête de balayage laser ( Tableau desmatériaux 2) pour enregistrer le calcium spontané transitoire en utilisant un balayage de ligne x-t, en utilisant un laser argon 488 nm pour l'excitation de teinture et un 515 - 10 nm filtre de barrière pour recueillir la lumière d'émission. Enregistrez la contraction spontanée des hiPSC-CM s'appuyant sur la fonctionnalité contrastant différentiel d'interférence du microscope confocal (Tableaudes matériaux 2).
REMARQUE: Les enregistrements transitoires de calcium ont été traités et analysés à l'aide du logiciel MATLAB R2016A (Tableau des matériaux 4). Les essais de changement de contraction cellulaire ont été effectués à l'aide du logiciel ImageJ (Tableau des matériaux 4).
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Representative Results
Les hiPSC-CMs utilisés dans cette étude ont été dérivés de l'origine humaine avec le gène de journaliste de luciferase ; par conséquent, le taux de survie des cellules transplantées in vivo a été détecté par imagerie par bioluminescence (BLI)17 (figure 1A, B). Pour les sections cardiaques histologiques, les cellules à double positif de la troponine cardiaque spécifique à l'homme (HcTnT) et de l'antigène nucléaire humain (HNA) ont été classées comme hiPSC-CM greffées (figure1C). Les deux résultats ont indiqué que le prétraitement de Y-27632 a sensiblement amélioré le taux d'engraftment de cellules. L'activité de luciferase du groupe hiPSC-CM-RI a été multipliée par environ six les jours 3, 7 et 28 après la transplantation, comparativement à celle du groupe hiPSC-CM-RI (figure1B). De plus, l'expression hcTnT/HNA a presque été multipliée par sept dans le groupe hiPSC-CM RI, par rapport à celle du groupe hiPSC-CM-RI (figure1C).
Les résultats ont également indiqué que Y-27632 prétraitement des changements cytosquelettiques réglementés dans les cellules transplantées. Les jours 7 et 28 de la transplantation, les hiPSC-CMont présenté une structure cytosquelettique plus grande et plus définie en forme de tige que les hiPSC-CM-RI (Figure 1D).
De plus, le prétraitement Y-27632 a le potentiel de réduire in vivo l'apoptose de hiPSC-CM transplantée. La coloration tUNEL a montré que le nombre de cellules TUNEL-positives a été significativement diminué dans le groupe hiPSC-CMRI par rapport à celui dans le groupe hiPSC-CM-RI le jour 2 après la transplantation (Figure 1E).
L'inhibition de ROCK a favorisé l'adhérence des cellules transplantées et a eu le potentiel d'augmenter davantage la conservation des cellules implantées aux emplacements d'administration. L'immunostaining de tache occidentale et de tissu cardiaque a suggéré que le prétraitement de Y-27632 a réversiblement favorisé l'expression accrue de l'integrin no 1 et de n-cadherin et a diminué l'expression de la chaîne lumineuse de phospho-myosin 2 (p-MLC2) (figure2A,B ).
La lignée de cellules de souris HL-1 a été sélectionnée comme CM de contrôle pour les expériences d'attachement cellulaire in vitro. Les résultats ont indiqué que le prétraitement de Y-27632 a augmenté de manière significative l'adhésion de hiPSC-CM par rapport à HL-1. Pour confirmer davantage ces résultats, les hiPSC-CM ont été incubés avec de l'anticorps neutralisant n-cadherin ou intégrine 1 pendant 1 h, ce qui a entraîné la disparition de l'adhérence améliorée observée précédemment (figure 2C).
Par rapport au groupe hiPSC-CM-RI, la force contractuelle du groupe hiPSC-CM-RI a été réduite de 32 %, et dans le groupe hiPSC-CM-RA (hiPSC-CM prétraités avec l'activateur ROCK, Tableau des matériaux 1), il a été augmenté de 42 % ( Figure 3A). Pendant ce temps, par rapport au groupe hiPSC-CM-RI, la fluorescence transitoire maximale du calcium (Max. F/F0) pour le groupe hiPSC-CMet RI a été réduite de 41 %, et la durée transitoire du calcium (CaTD50) a été réduite de 11 % (figure 3B ,C). En revanche, le pic F/F0 pour le groupe hiPSC-CMet RA a augmenté de 48 % et le CaTD50 a augmenté de 13 % (figure3B, C).
En outre, un prétraitement des cardiomyocytes avec Y-27632 pendant 12 h avant la transplantation a réduit de manière significative l'expression de cTnI et cTnT (figure 3D),qui sont tous deux des sous-unités de troponine (Tn) qui règlent la contraction de cardiomyocyte.
Semblable à Y-27632, un prétraitement de verapamil (1 M, 12 h) a augmenté de manière significative le taux d'engraftment des hiPSC-MC chez les souris MI induites. L'hypothèse a été confirmée par l'observation d'un signal de luciférase accru dans l'analyse de bioluminescence (figure 4A) et d'un nombre accru de cellules hcTnT/HNA double-positives les jours 7 et 28 après la transplantation cellulaire (figure 4B).
Figure 1 : Le prétraitement de Y-27632 a augmenté le taux d'engraftment des hiPSC-MC dans les cœurs de souris MI. (A) Courbe standard des mesures BLI. (B) Signal de Luciferin chez les souris NOD/scid traitées avec PBS, hiPSC-CM-RI, ou hiPSC-CMs'RI les jours 3, 7, et 28 après chirurgie. n - 6-9 souris par groupe. P lt; 0,05 vs PBS; - L'ide P lt; 0.05 vs hiPSC-CMs-RI. (C) Immunostaining des sections de coeur pour hcTnT et HNA. Barres d'échelle de 100 m (images 10x); 20 m (40x images). n - 5 souris par groupe. P lt; 0.05 vs hiPSC-CMs-RI. (D) Images représentatives de sections cardiaques tachées de phalloidin et de hcTnT. Barre d'échelle de 20 m. n 5 souris par groupe. P lt; 0.05 vs hiPSC-CMs-RI. (E) Images représentatives des sections cardiaques pour la coloration TUNEL. Barre d'échelle de 20 m. n 4-6 souris par groupe. P lt; 0.05 vs hiPSC-CMs-RI. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhao et coll.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Y-27632 a amélioré l'adhérence des hiPSC-CMs en maintenant l'expression des protéines d'adhérence. (A et B) Analyse de tache occidentale de l'expression de l'intégrine no 1, de la n-cadhérine et de la phosphorylation du MLC2 (p-MLC2) dans les hiPSC-CM traités par RI et chez les hiPSC-CM non traités. n - 5 répliques par groupe. (C) hcTnT immunofluorescence analyse des taches de -RI et de 'RI hiPSC-CM avec et sans un prétraitement des anticorps anti-N-cadherin (N-Cad) et anti-intégrine no 1 (Integ). Barres d'échelle de 100 m. P et lt; 0,05 vs hiPSC-CMs-RI; - L'ide P lt; 0.05 vs hiPSC-CMs'RI. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhao et coll.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Le prétraitement avec Y-27632 a réduit la contractilité des hiPSC-CMet régulé l'expression des sous-unités cardiaques de troponine. (A) Quantification du pourcentage de raccourcissement des hiPSC-CM exposés au traitement de r-est et de RA. P et lt; 0,05 vs hiPSC-CMs-RI; - L'ide P lt; 0.05 vs hiPSC-CMs'RI. (B et C) Images représentatives et quantification des mesures transitoires de calcium des hiPSC-CMtraités avec IR et RA et d'un groupe non traité. P et lt; 0,05 vs hiPSC-CMs-RI; - L'ide P lt; 0.05 vs hiPSC-CMs'RI. (D) Analyse de tache occidentale de l'expression des sous-unités cardiaques de troponin (cTnC, cTnT, et cTnI) dans hiPSC-CMs traités avec IR et RA et dans un groupe non traité. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhao et coll.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Le prétraitement de Verapamil a amélioré le taux d'engraftment des hiPSC-MC chez les souris MI. (A) Signal de Luciferin chez les souris NOD/scid traitées avec PBS, hiPSC-CMs-VER, ou hiPSC-CMs-VER les jours 3, 7, et 28 après chirurgie. n - 8 souris par groupe. P lt; 0,05 vs PBS; - L'ide P lt; 0.05 vs hiPSC-CMs-VER. (B) Immunostaining des sections de coeur pour hcTnT et HNA. Pour les images 10x, barres d'échelle de 100 m (images 10x); 20 m (40x images). n - 5 souris par groupe. P lt; 0.05 vs hiPSC-CMs-VER. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhao et coll.18. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les principales étapes de cette étude comprennent l'obtention de l'hiPSC-MC pur, l'amélioration de l'activité des hiPSC-MC par le prétraitement Y-27632, et enfin, la transplantation d'une quantité précise de hiPSC-MC dans un modèle MI souris.
Les principaux problèmes abordés ici étaient que, d'abord, nous avons optimisé les méthodes de purification sans glucose19 et mis en place un nouveau système de purification efficace. La procédure du système comprenait l'application d'enzymes de dissociation cellulaire, la replantation de cellules dans des plaques recouvertes de gélatine, la culture des cellules dans le milieu de neutralisation pendant 24 h après le replaquage, et la minimisation du temps de digestion des cellules avant la transplantation, tous les dont ont été effectués pour atteindre l'activité la plus élevée des cellules tout en obtenant des cardiomyocytes purs.
Deuxièmement, nous avons élaboré sur le prétraitement des hiPSC-CMs avec Y-27632 à 12 h avant l'injection cellulaire. Les anoikis sont généralement induits par la modification des protéines d'adhérence des cellules, telles que les integrins4,20 et N-cadherin21, qui conduisent à l'activation de la voie apoptotique. Nous avons démontré que le prétraitement de Y-27632 pourrait favoriser l'adhérence des hiPSC-CM au site de transplantation en maintenant l'expression de l'intégrine no 1 et de la n-cadherin, supprimant l'expression du p-MLC2, qui est liée aux changements dans le cytoskeletal architecture22,23. Sept jours après la transplantation de hiPSC-CM, hiPSC-CMs-RI a eu comme conséquence une plus grande zone d'engraftment de cellules, des formes définies plus fines de tige, et une organisation cytosquelettique plus complète comparée à hiPSC-CMs-RI (figure 1B-D).
Troisièmement, nous avons établi un nouveau système d'injection intracellulaire dans les modèles MI de souris, avec 5 L par point d'injection pour injecter avec précision le nombre requis de cellules, tout en évitant une diminution du taux de survie de la souris en raison du volume d'injection excessif.
Quatrièmement, nous avons élaboré sur la façon de déterminer les changements dans la contraction cellulaire et le taux de calcium transitoire dans les hiPSC-CM après le prétraitement par RI ou RA. Nous avons constaté que Y-27632 peut réversiblement réduire la contractilité cellulaire et le taux transitoire de calcium. L'hypothèse ici est qu'en raison des besoins énergétiques plus faibles des cellules transplantées, le taux d'engraftment a augmenté. Des effets similaires peuvent être obtenus à l'aide de l'inhibiteur du canal calcique verapamil. Le mécanisme proposé ayant pour résultat l'inhibition de contractilité est que Y-27632 réduit l'expression des sous-unités de troponin e cTnT et cTnI dans hiPSC-CMs.
La principale limitation est que Y-27632 n'a joué un rôle transitoire que pendant la transplantation. Comment inhiber Rho kinase pendant une plus longue période, améliorant ainsi encore l'efficacité de transplantation des hiPSC-CMs, est un problème à résoudre à l'avenir. Comme pour plus d'applications de cette méthode, inhibiteur de ROCK peut non seulement améliorer l'activité des cardiomyocytes pendant la transplantation mais également améliorer l'activité d'autres cellules ; par conséquent, il peut également être utilisé pendant le prétraitement dans les processus de transplantation d'autres cellules. En outre, l'approche présentée ici pose une bonne base expérimentale pour plus de recherche sur les maladies cardiaques.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le Dr Joseph C. Wu (Université Stanford) d'avoir aimablement fourni la construction Fluc-GFP et le Dr Yanwen Liu pour l'excellente assistance technique. Cette étude est soutenue par les subventions RO1 des National Institutes of Health HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (à J.Z.), et HL121206A1 (à L.Z.), et une subvention R56 HL142627 (à W.Z.), une subvention de développement scientifique de l'American Heart Association 16SDG30410018, et l'Université de l'Alabama à Birmingham Faculty Development Grant (à W.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| ImageJ | NIH | 1.52g |
References
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