Summary
In diesem Protokoll zeigen wir und erläutern, wie man humaninduzierte pluripotente Stammzellen zur Kardiomyozytendifferenzierung und -reinigung verwendet und weiter, wie die Transplantationseffizienz mit dem Rho-assoziierten Proteinkinase-Inhibitor verbessert werden kann. Vorbehandlung in einem Maus-Myokardinfarktmodell.
Abstract
Ein entscheidender Faktor bei der Verbesserung der Wirksamkeit der Zelltherapie bei der Myokardregeneration ist die sichere und effiziente Erhöhung der Zellentransplantationsrate. Y-27632 ist ein hochwirksamer Inhibitor der Rho-assoziierten, coiled-coil-haltigen Proteinkinase (RhoA/ROCK) und wird verwendet, um Dissoziations-induzierte Zellapoptose (Anoikis) zu verhindern. Wir zeigen, dass die Y-27632-Vorbehandlung für humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs+RI) vor der Implantation zu einer Verbesserung der Zellengraftmentrate in einem Mausmodell des akuten Myokardinfarkts (MI) führt. Hier beschreiben wir ein komplettes Verfahren der HiPSC-CMs-Differenzierung, -Reinigung und -Zellvorbehandlung mit Y-27632 sowie die daraus resultierende Zellkontraktion, Kalziumtransientenmessungen und Transplantation in Maus-MI-Modelle. Die vorgeschlagene Methode bietet eine einfache, sichere, effektive und kostengünstige Methode, die die Zellentransplantationsrate deutlich erhöht. Diese Methode kann nicht nur in Verbindung mit anderen Methoden zur weiteren Verbesserung der Zelltransplantationseffizienz eingesetzt werden, sondern bietet auch eine günstige Grundlage für die Untersuchung der Mechanismen anderer Herzerkrankungen.
Introduction
Stammzellbasierte Therapien haben ein erhebliches Potenzial als Behandlung von Herzschäden durch MI1gezeigt. Die Verwendung differenzierter HiPSCs bietet eine unerschöpfliche Quelle für hiPSC-CMs2 und öffnet die Tür für die schnelle Entwicklung bahnbrechender Behandlungen. Es gibt jedoch noch viele Einschränkungen bei der therapeutischen Übersetzung, einschließlich der Herausforderung der stark niedrigen Transplantationsrate implantierter Zellen.
Dissoziierende Zellen mit Trypsin löst Anoikis3, die erst beschleunigt wird, wenn diese Zellen in raue Umgebungen wie das ischämische Myokard injiziert werden, wo die hypoxische Umgebung den Kurs in Richtung Zelltod beschleunigt. Von den verbleibenden Zellen wird ein großer Teil von der Implantationsstelle in den Blutkreislauf ausgewaschen und in der Peripherie verteilt. Einer der wichtigsten apoptotischen Pfade ist der RhoA/ROCK-Weg4. Basierend auf früheren Forschungen reguliert der RhoA/ROCK-Signalweg die aktin zytoskelettale Organisation5,6, die für Zellfunktionsstörungen verantwortlich ist7,8. Der ROCK-Hemmer Y-27632 wird häufig bei der somatischen und Stammzelldissoziation und Passaging verwendet, um die Zelladhäsion zu erhöhen und die Zellapoptose9,10,11zu reduzieren. In dieser Studie wird Y-27632 zur Behandlung von HiPSC-CMs vor der Transplantation verwendet, um die Zellengraftmentrate zu erhöhen.
Es wurden mehrere Methoden zur Verbesserung der Zellentransplantationsrate etabliert, wie Hitzeschock und Kellermembranmatrixbeschichtung12. Abgesehen von diesen Methoden kann die Gentechnologie auch die Proliferation von Kardiomyozyten13 oder die Umkehrung nichtmyokardischer Zellen in Kardiomyozyten14fördern. Aus bioengineering-Sicht werden Kardiomyozyten auf ein Biomaterialgerüst gesetzt, um die Transplantationseffizienz zu verbessern15. Leider sind die meisten dieser Methoden kompliziert und kostspielig. Im Gegenteil, die hier vorgeschlagene Methode ist einfach, kosteneffizient und effektiv, und sie kann als Basalbehandlung vor der Transplantation sowie in der Konjugation mit anderen Technologien eingesetzt werden.
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Protocol
Alle tierischen Verfahren in dieser Studie wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Alabama in Birmingham genehmigt und basierten auf den National Institutes of Health Laboratory Animal Care and Use Guidelines (NIH Publication No 85-23).
1. Vorbereitung von Kulturmedien und Kulturtafeln
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Mittlere Vorbereitung
- Für hiPSC medium 400 ml humane pluripotente Stammzelle (hPSC) Basalmedium (Materialtabelle 1) und 100 ml hPSC 5x Ergänzung mischen; lagern Sie die Mischung bei 4 °C.
- Für RPMI 1640/B27 minus Insulin (RB-) Medium, mischen 500 ml RPMI 1640 und 10 ml B27 Ergänzung minus Insulin.
- Für RPMI 1640/B27 (RB+) medium 500 ml RPMI 1640, 10 ml B27-Ergänzung und 5 ml Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)-Antibiotikum mischen.
- Zur Reinigung medium16mischen 500 ml glukosefreie RPMI 1640, 10 ml B27-Ergänzung, 5 ml Pen-Strep-Antibiotikum und 1.000 l Natrium-DL-Laktatlösung (bei einer Endkonzentration von 4 mM).
- Zur Neutralisierung der Lösung 200 ml RPMI 1640, 50 ml fetales Rinderserum (FBS), 2,5 ml Pen-Strep-Antibiotikum und 50 l Y-27632 (bei einer Endkonzentration von 10 m) mischen.
- Für Gefriermedium 9 ml FBS, 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) und 10 l Y-27632 (bei einer Endkonzentration von 10 m) mischen.
- Bei extrazellulärer Matrixlösung (EMS) tauen konzentrierte extrazelluläre Matrix (Materialtabelle 1) bei 4 °C, bis sie einen gleichmäßig endenden Flüssigkeitszustand erreicht hat. Vorkühl-Pipettenspitzen und -rohre vor der Herstellung von Matrix-Aliquots von je 350 L auf Eis und lagern Sie die Aliquots bei -20 °C. Vor dem Beschichten der Platten ein aufgetautes Aliquot in 24 ml eiskaltes DMEM/F12 Medium (EMS) verdünnen; das EMS bis zu 2 Wochen in 4 °C halten.
HINWEIS: Führen Sie alle Beschichtungsschritte auf Eis durch, um eine Erstarrung der Kellermembranmatrix zu verhindern. - Für Die Tyrodes Lösung 90% des letzten erforderlichen Volumens von Gewebekultur-Wasser nehmen, die entsprechende Menge der folgenden Reagenzien hinzufügen und rühren, bis sie gelöst sind. Verwenden Sie dann 1 N NaOH, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen. Fügen Sie zusätzliches Wasser zu einer Endkonzentration von 140 mmol/L Natriumchlorid, 1 mmol/L Magnesiumchlorid, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L Kaliumchlorid, 10 mmol/L Glukose und 1,8 mmol/L Calciumchlorid hinzu. Sterilisieren Sie durch Filtration mit einer 0,22 m Membran.
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Zellkulturplattenbeschichtung
- Für hiPSC-Kulturplatten 1 ml EMS auf jeden Brunnen einer 6-Well-Platte auftragen und die Platte mindestens 1 h bei 37 °C bebrüten. Aspirieren DMEM/F12 Lösung vor der Aussaat von Zellen.
- Für die Gelatinebeschichtung 0,2 g Gelatinepulver in Gewebekultur-Wasser auflösen, um eine 0,2% (w/v) Lösung zu bilden. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren bei 121 °C, 15 psi für 30 min. Beschichten Sie jeden Brunnen einer 6-Well-Platte mit 2 ml der Lösung und inkubieren Sie für 1 h bei 37 °C. Vor dem Passieren der Zellen, aspirieren Sie die Lösung und lassen Sie die Platte für mindestens 1 h bei Raumtemperatur in der Gewebekultur Haube trocknen.
2. hiPSC Wartung und Cardiomyozyten Ddifferentiation
- Kultur die hiPSCs in hiPSC medium (siehe Schritt 1.1.1) mit einer täglichen mittleren Veränderung, bis die Zellen 80%–90% Zusammenfluss pro Brunnen erreichen.
HINWEIS: Für Wartungszwecke sind hiPSCs in der Regel alle 4 Tage für die Durchreise bereit. - Um hiPSCs zu durchziehen, das Medium ansaugen und den Brunnen 1x mit 1x Phosphat-gepufferter Saline (PBS) waschen. Fügen Sie 0,5 ml Stammzellablösung (Tabelle der Materialien 1) zu jedem Brunnen hinzu und brüten bei 37 °C für 5–7 min.
HINWEIS: Die Inkubationszeit hängt von der Dichte der Zellen und der Dissoziationsrate ab, die unter dem Mikroskop beobachtet werden kann. - Neutralisieren Sie die Stammzellablösung mit 1 ml HiPSC-Medium, ergänzt mit 5 'M Y-27632. Sammeln Sie das Gemisch in einem 15 ml Zentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie das Rohr für 5 min bei 200 x g, aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, und setzen Sie dann die Zellen in 1 ml HiPSC-Medium mit 5 'M Y-27632 wieder auf.
- Säen Sie die hiPSCs auf eine neue EMS-beschichtete 6-Well-Platte im Verhältnis zwischen 1:6 und 1:18. Ändern Sie das Medium auf hiPSC Medium ohne Y27632 nach 24 h.
- Um die Zellen einzufrieren, setzen Sie die dissoziierten HiPSCs im Gefriermedium in einer Konzentration von 0,5–1 Mio. l wieder aus, legen Sie die Suspension in Kryovials und lagern Sie sie in einem Gefrierschrank von -80 °C. Die gefrorenen Fläschchen nach 24 h in flüssigen Stickstoff übertragen.
- Zur Unterscheidung: Ersetzen Sie das HiPSC-Medium durch 2 ml RB-Medium, ergänzt durch den 10-M-GSK-3-Inhibitor CHIR99021 (CHIR) bei 80 %–90%igem Zellzusammenfluss. Ersetzen Sie das Medium durch 3 ml RB-Medium nach 24 h und brüten Sie für weitere 48 h (Tag 3).
- Wechseln Sie am 3. Tag das Medium auf 3 ml RB-Medium mit 10 'M Wnt-Hemmer IWR1 für 48 h (Tag 5), und ersetzen Sie dann das Medium mit 3 ml RB-Medium und halten Sie es für 48 h (Tag 7).
- Ersetzen Sie am 7. Tag das Medium durch 3 ml RB-Medium und wechseln Sie das Medium alle 3 Tage in Zukunft. Spontanes Schlagen von hiPSC-CMs sollte zwischen den Tagen 7–10 beobachtet werden.
3. hiPSC-CMs-Reinigung und kleine Molekül-Vorbehandlung
HINWEIS: Hochgereinigte, rekombinante Zelldissoziationsenzyme (Materialtabelle 1) wurden verwendet, um HiPSC-CMs zu dissoziieren.
- Am 21. Tag nach der hiPSC-CM-Differenzierung das Medium aspirieren und die Zellen 1x mit sterilem PBS waschen. Inkubieren Sie die Zellen mit 0,5 ml zelldissoziationsenzymen pro Brunnen für 5–7 min bei 37 °C. Pipette die Zellsuspension mit einer 1 ml Pipette, um die Zellen gründlich zu dissoziieren.
- Nachdem die Zellen dissoziiert sind, fügen Sie 1 ml neutralisierende Lösung zu jedem Brunnen hinzu, sammeln Sie das Zellgemisch in ein 15 ml Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 200 x g für 3 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in neutralisierender Lösung wieder auf.
- Pflanzen Sie die Zellen mit einer Dichte von 2 Millionen Zellen pro Brunnen auf gelatinebeschichtete 6-Well-Platten.
- Ersetzen Sie nach 24–48 h das Kulturmedium für 3–5 Tage durch Reinigungsmedium.
HINWEIS: Die Reinigung ist abgeschlossen, wenn mehr als 90% der Zellen in jedem Mikroskop-Ansichtsfeld schlagen. Um weitere Schäden an den Kardiomyozyten zu vermeiden, verlängern Sie die Reinigungsdauer nicht über 5 Tage hinaus. Wenn die erste Runde nicht die notwendige Reinheit ergibt, ersetzen Sie das Reinigungsmedium für 1 Tag durch RB+ Medium, und schließen Sie dann eine zweite Reinigungsrunde ab. - Vor der Transplantation die Zellen in der Behandlungsgruppe für 12 h in RB+ Medium mit 10 'M Y-27632 ergänzt. In ähnlicher Weise führen Sie verapamil Behandlung auf den Zellen im RB + Medium mit 1 M verapamil für 12 h (hiPSC-CMs+VER).
- Nach der Behandlung die hiPSC-CMs 1x mit PBS waschen und die Zellen mit 0,5 ml Zelldissoziationsenzymen pro Brunnen für maximal 2 min inkubieren. Wiederholt pipette die Zellsuspension, mit einer 1 ml Pipette, um die Zellen gründlich zu dissoziieren. Neutralisieren Sie die Zellen mit neutralisierender Lösung, sammeln Sie das Zellgemisch in einem 15 ml Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 200 x g für 3 min. Setzen Sie die Zellen in PBS in einer Konzentration von 0,1 Millionen Zellen/5 l zur Vorbereitung auf die Injektion aus.
4. Myokardinfarkt und Zelltransplantation
HINWEIS: Alle chirurgischen Instrumente sind mit Autoklaven vorsterilisiert und werden während mehrerer Operationen über einen heißen Perlensterilisator(Materialtabelle 2) in aseptischem Zustand gehalten.
- Anästhetisieren Sie NOD/scid-Mäuse (Materialtabelle 2) mit inhaliertem Isofluran (1,5%–2%). Überwachen Sie den Anästhesiespiegel durch die Reaktionen der Mäuse auf eine Zehenklemme. Legen Sie die optische Salbe des Tierarztes auf die Augen, um zu verhindern, dass sie während der Operation trocknen.
- Versorgung mit 0,1 mg/kg Buprenorphin subkutan für das Schmerzmanagement vor der Operation.
- Positionieren und sichern Sie die Maus in einer Supine-Position auf einem beheizten Operationstisch, entfernen Sie das Haar aus dem ventralen Halsbereich und den linken Thorax mit einer Enthaarungscreme, setzen Sie die Haut aus und desinfizieren Sie sie mit 70% Alkohol.
- Schneiden Sie einen 0,5 cm Großen Schnitt in der Mitte des Halses mit einer chirurgischen Schere, trennen Sie das subkutane Fett mit sterilen Zangen und setzen Sie die Luftröhre aus. Führen Sie die Intubationskanüle oral in die Luftröhre ein, schließen Sie die Kanüle an ein beatmungskleines Beatmungsgerät an und passen Sie die Belüftungseinstellungen an (stellen Sie das Gezeitenvolumen auf 100–150 l und die Atmungsrate auf 100x–150x pro min).
- Nachdem sich die Maus stabilisiert hat, schneiden Sie einen 0,5 cm Großen Schnitt in die Mitte der linken Brusthaut. Verwenden Sie Zangen, um die Muskelschicht unverblümt zu trennen und einen kleinen Schnitt im fünften interkostalen Raum zu machen, um die Brusthöhle freizulegen. Legen Sie den Retraktor in den Schnitt, um die Brusthöhle zu öffnen und die linke absteigende Herzkranzgefäße (LAD) zu lokalisieren. Unter einem sezierenden Operationsmikroskop ligate der LAD mit einem 8-0 nicht resorbierbare Naht.
- Unmittelbar nach der MI-Induktion 5 l hiPSC-CMs-RI, hiPSC-CMs+RI, hiPSC-CMs-VER, hiPSC-CMs+VER oderein gleiches PBS-Volumen in das Myokard der Maus an jedem Standort (3 x 105 Zellen/Tier, 1 x 105) Zellen/Standort), eine im Infarktbereich und zwei in den Bereichen um den Infarkt.
HINWEIS: Da 5 l sehr geringes Volumen ist, ist es nicht einfach, das Volumen genau zu kontrollieren, indem man es direkt mit einer Spritze saugt. Der Deckel einer sterilen Petrischale kann umgedreht werden, und 5 l der Zellen können zuerst mit einer Pipette auf den Deckel abgelagert werden. Aufgrund der Oberflächenspannung breitet sie sich nicht aus, sondern kondensiert zu einer kleinen Flüssigkeitsmasse. Dies kann leicht absorbiert und in das Myokard der Maus injiziert werden. - Beseitigen Sie Restluft in der Brusthöhle, indem Sie sie mit warmer isotonischer Salinelösung füllen. Nähen Sie die Rippen, Muskeln und die Haut nacheinander mit einer 6-0 resorbierbaren Naht. Schalten Sie die Isofluran-Anästhesie-Injektion aus. Halten Sie die Operationstiere auf dem Heizkissen und beobachten Sie sie genau, während sie das volle Bewusstsein wiedererlangen. Dann legen Sie die Tiere in einen sauberen Käfig. Bringen Sie die Tiere erst dann an die Gesellschaft anderer Tiere zurück, wenn sie vollständig geborgen sind.
- Nach der Operation injizieren Sie die Mäuse intraperitoneal mit Buprenorphin (0,1 mg/kg) alle 12 h für 3 aufeinander folgende Tage und injizieren Sie sie mit Ibuprofen (5 mg/kg) alle 12 h für einen Tag. Führen Sie nachfolgende Analysestudien zu bestimmten Zeitpunkten durch.
HINWEIS: Befolgen Sie die Richtlinien Ihres örtlichen Tierschutzausschusses für Analgesie.
5. Calcium Transient und KontraktilitätAufnahme
- Autoklav 15 mm-Durchmesser Abdeckungen (Materialtabelle 2) und Pinzette in einem kleinen Glasbecher bei 121 °C, 15 psi für 15 min. Die Abdeckungen und Pinzette bei 4 °C vorkühlen.
- Mit der Pinzette legen Sie den Deckelinin in eine 12-Well-Platte und pipette 300 l extrazelluläre Matrix auf jeden Coverslip.
HINWEIS: Lassen Sie die Matrix nicht die Kante des Deckslips überschreiten, um eine Reduzierung der Matrixbeschichtungsmenge zu verhindern. Inkubieren Sie die 12-Well-Platte in einem 37 °C Zellkultur-Inkubator für 1 h. - Das Medium in der gelatinebeschichteten 6-Well-Platte mit gereinigten HiPSC-CMs ansaugen, 1x mit PBS waschen und dann mit 0,5 ml Zelldissoziationsenzymen für 1,5 min verdauen. 1 ml Neutralisationslösung hinzufügen, Pipette wiederholt für nicht mehr als 5x–10x mit einer 1 ml Pipette , und zentrifugieren Sie die Mischung bei 200 x g für 3 min.
- Die beschichtete extrazelluläre Matrix aus den Coverlips absaugen. Zählen Sie die Zellzahl und setzen Sie die Zellen in der neutralisierenden Lösung auf eine Konzentration von 40.000/300 l aus, und fügen Sie dann 300 l der Zellsuspension auf jeden Deckelschlupf hinzu. Die Platte in einem 37 °C-Inkubator besanieren.
- Nach 24 h, die neutralisierte Lösung vorsichtig ansaugen, 500 l RB+ Medium zu jedem Bohrgut der Platte hinzufügen und 2 Tage lang weiter kulturalisieren.
- Fügen Sie Y-27632 (10 M), Rho-Kinase-Aktivator (RA, 100 nM), Verapamil (1 M) oder ein gleiches PbS-Volumen in das Kulturmedium von hiPSC-CMs, 12 h vor Calciumtransienten und Kontraktilitätsdetektion hinzu.
HINWEIS: Neben dem Nachweis des Kalziumtransienten und der Kontraktilität der Zellen nach 12 h chemischer Behandlung wurde der Nachweis dieser Parameter auch bei 12, 24, 48 und 72 h nach chemischer Entnahme getestet. - Nehmen Sie die Platte heraus, entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Platte 1x mit PBS. Ändern Sie das Medium in ein phenolrot-freies DMEM, das 0,02 % (w/v) Destensidpolyol (Materialtabelle 1), 5 m Calciumindikator (Materialtabelle 1) enthält, und das entsprechende Y-27632 (10 m), RA (100 nM), verapamil (1 m) oder ein gleiches Volumen PBS und inkubieren Sie die Platte 30 min bei 37 °C.
- Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie die Zellen 3x mit farbstofffreiem DMEM-Medium und lassen Sie das Medium 30 min ruhen, um den Mapping-Farbstoff zu entestert.
- Legen Sie den zellsäenden Deckel in eine offene Badkammer und legen Sie die Kammer in ein Mikroinkubationssystem ein, das mit einem automatischen Temperaturregler(Materialtabelle2) auf 37 °C ausgeglichen ist, mit der Lösung von Tyrode durchnässt und kontinuierlich Rho-Kinase-Inhibitor (RI), RA oder PBS zur Perfusionslösung.
- Verwenden Sie ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop (Materialtabelle 2) und einen Laser-Scanning-Kopf (Tabelle der Materialien 2), um spontane Kalziumtransienten aufzuzeichnen, indem Sie einen x-t-Linienscan verwenden, mit einem 488 nm Argonlaser für die Farbanregung und einem 515 x 10 nm Barrierefilter, um Emissionslicht zu sammeln. Zeichnen Sie die spontane Kontraktion von hiPSC-CMs mit der Differential Interference Contrast-Funktionalität des konfokalen Mikroskops auf (Materialtabelle 2).
HINWEIS: Calciumtransientaufnahmen wurden mit der Software MATLAB R2016A (Tabelle der Materialien 4) verarbeitet und analysiert. Zellkontraktion selungsänderungstests wurden mit ImageJ-Software durchgeführt (Tabelle der Materialien 4).
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Representative Results
Die in dieser Studie verwendeten HiPSC-CMs wurden von menschlichem Ursprung mit luziferase Reporter-Gen abgeleitet; Daher wurde die Überlebensrate der transplantierten Zellen in vivo durch Biolumineszenz-Bildgebung (BLI)17 (Abbildung 1A,B) nachgewiesen. Für histologische Herzabschnitte wurden humanspezifische sintherzische Troponin T (hcTnT) und humane Kernantigenzellen (HNA) als transplantierte hiPSC-CMs klassifiziert (Abbildung 1C). Beide Ergebnisse zeigten, dass die Y-27632-Vorbehandlung die Zellengraftmentrate signifikant verbesserte. Die Luziferase-Aktivität der HiPSC-CM+RI-Gruppe wurde an den Tagen 3, 7 und 28 nach der Transplantation im Vergleich zur HiPSC-CM-RI-Gruppe (Abbildung1B)etwa versechsfacht. Darüber hinaus hat sich die hcTnT/HNA-Expression in der HiPSC-CM +RI-Gruppe im Vergleich zu der In-Gruppe hiPSC-CM-RI (Abbildung1C) fast versiebenfacht.
Die Ergebnisse zeigten auch, dass Y-27632 Vorbehandlung reguliert eistoskelettale Veränderungen in transplantierten Zellen. An den Tagen 7 und 28 der Transplantation zeigten hiPSC-CMs+RI eine größere und definiertere stabförmige zytoskelettale Struktur im Vergleich zu hiPSC-CMs-RI (Abbildung 1D).
Darüber hinaus hat die Y-27632-Vorbehandlung das Potenzial, die transplantierte HiPSC-CM-Apoptose in vivo zu reduzieren. DIE TUNEL-Färbung zeigte, dass die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen in der HiPSC-CM +RI-Gruppe im Vergleich zur In-Gruppe hiPSC-CM-RI am 2. Tag nach der Transplantation signifikant verringert wurde (Abbildung 1E).
Die ROCK-Hemmung förderte die Adhäsion transplantierter Zellen und hatte das Potenzial, die Retention implantierter Zellen an Verabreichungsstellen weiter zu erhöhen. Western Blot und Herzgewebe Immunostainierung deutete darauf hin, dass Y-27632 Vorbehandlung reversibel förderte die erhöhte Expression von Integrin 1 und N-Cadherin und verringerte die Expression von Phospho-Myosin-Lichtkette 2 (p-MLC2) (Abbildung 2A,B ).
Die Mauszelllinie HL-1 wurde als Kontroll-CMs für In-vitro-Zellanhaftungsexperimente ausgewählt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Y-27632-Vorbehandlung die HiPSC-CM-Adhärenz im Vergleich zu HL-1 signifikant erhöhte. Um diese Befunde weiter zu bestätigen, wurden hiPSC-CMs+RI mit N-Cadherin oder Integrin 1 neutralisierendem Antikörper für 1 h inkubiert, was zu einem Verschwinden der zuvor beobachteten verbesserten Haftung führte (Abbildung2C).
Im Vergleich zur hiPSC-CM-RI-Gruppe wurde die kontraktile Kraft in der hiPSC-CM+RI-Gruppe um 32% reduziert, und in der hiPSC-CM+RA-Gruppe (mit ROCK-Aktivator vorbehandelt, Materialtabelle 1) wurde sie um 42% erhöht ( Abbildung 3A). In der Zwischenzeit wurde die transiente Fluoreszenz (Peak F/F0) für die hiPSC-CM+RI-Gruppe im Vergleich zur hiPSC-CM-RI-Gruppe um 41 % und die Transientendauer (CaTD50) um 11 % verringert (Abbildung3B ,C). Im Gegensatz dazu wurde der Peak F/F0 für die hiPSC-CM+RA-Gruppe um 48 % und CaTD50 um 13 % erhöht ( Abbildung3B,C).
Darüber hinaus reduzierte eine Vorbehandlung der Kardiomyozyten mit Y-27632 für 12 h vor der Transplantation die Expression von cTnI und cTnT (Abbildung 3D), beides Troponin (Tn)-Untereinheiten, die die Kardiomyozytenkontraktion regulieren.
Ähnlich wie bei Y-27632 erhöhte eine Verapamil-Vorbehandlung (1 M, 12 h) die Engraftmentrate von HiPSC-CMs bei induzierten MI-Mäusen signifikant. Die Hypothese wurde durch die Beobachtung eines erhöhten Luziferasesignals im Biolumineszenz-Assay (Abbildung 4A) und einer erhöhten Anzahl von hcTnT/HNA-Doppel-positiven Zellen an den Tagen 7 und 28 nach der Zelltransplantation bestätigt (Abbildung 4B).
Abbildung 1: Die Y-27632-Vorbehandlung erhöhte die Engraftmentrate von HiPSC-CMs in MI-Mäuseherzen. (A) Standardkurve der BLI-Messungen. (B) Luciferin-Signal bei NOD/scid-Mäusen, die mit PBS, hiPSC-CMs-RIoder hiPSC-CMs+RI an den Tagen 3, 7 und 28 nach der Operation behandelt wurden. n = 6-9 Mäuse pro Gruppe. *P < 0,05 gegen PBS; € €€€ P < 0.05 vs. hiPSC-CMs-RI. (C) Immunostainierung von Herzabschnitten für hcTnT und HNA. Skalenbalken = 100 m (10x Bilder); 20 m (40x Bilder). n = 5 Mäuse pro Gruppe. *P < 0.05 vs. hiPSC-CMs-RI. (D) Repräsentative Bilder von Herzabschnitten, die mit Phalloidin und hcTnT befleckt sind. Skala bar = 20 m. n = 5 Mäuse pro Gruppe. *P < 0.05 vs. hiPSC-CMs-RI. (E) Repräsentative Bilder von Herzabschnitten für TUNEL Färbung. Skala bar = 20 m. n = 4-6 Mäuse pro Gruppe. *P < 0.05 vs. hiPSC-CMs-RI. Diese Zahl wurde von Zhao et al.18geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Y-27632 verbesserte die Haftung von HiPSC-CMs durch die Aufrechterhaltung der Expression von Adhäsionsproteinen. (A und B) Western Blot Analyse der Expression von Integrin ß1, N-Cadherin und Phosphorylierung von MLC2 (p-MLC2) in hiPSC-CMs, die mit RI und in nicht behandelten hiPSC-CMs behandelt werden. n = 5 Repliken pro Gruppe. (C) hcTnT Immunfluoreszenz-Färbungsanalyse von -RI und +RI hiPSC-CMs mit und ohne Vorbehandlung von Anti-N-Cadherin (N-Cad) und Anti-Integrin ß1 (Integ) Antikörpern. Skalenstäbe = 100 m. *P < 0,05 vs. hiPSC-CMs-RI; € €€€ P < 0.05 vs. hiPSC-CMs+RI. Diese Zahl wurde von Zhao et al.18geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die Vorbehandlung mit Y-27632 reduzierte die Kontraktilität von HiPSC-CMs und regulierte die Expression von Kardialtroponin-Untereinheiten. (A) Quantifizierung des Prozentsatzes der Verkürzung von HiPSC-CMs, die der RI- und RA-Behandlung ausgesetzt sind. *P < 0.05 vs. hiPSC-CMs-RI; € €€€ P < 0.05 vs. hiPSC-CMs+RI. (B und C) Repräsentative Bilder und Quantifizierung von Kalziumtransientenmessungen von hiPSC-CMs, die mit RI und RA behandelt wurden, und einer nicht behandelten Gruppe. *P < 0.05 vs. hiPSC-CMs-RI; € €€€ P < 0.05 vs. hiPSC-CMs+RI. (D) Western Blot Analyse der Expression von Kardialtroponin-Untereinheiten (cTnC, cTnT und cTnI) in hiPSC-CMs, die mit RI und RA behandelt wurden, und in einer nicht behandelten Gruppe. Diese Zahl wurde von Zhao et al.18geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Verapamil-Vorbehandlung verbesserte die Engraftmentrate von HiPSC-CMs bei MI-Mäusen. (A) Luciferin-Signal bei NOD/scid-Mäusen, die mit PBS, hiPSC-CMs-VER oderhiPSC-CMs+VER an den Tagen 3, 7 und 28 nach der Operation behandelt wurden. n = 8 Mäuse pro Gruppe. *P < 0,05 gegen PBS; € €€€ P < 0.05 vs. hiPSC-CMs-VER. (B) Immunostainierung von Herzabschnitten für hcTnT und HNA. Für 10x Bilder, Scale Bars = 100 'm (10x Bilder); 20 m (40x Bilder). n = 5 Mäuse pro Gruppe. *P < 0.05 vs. hiPSC-CMs-VER. Diese Zahl wurde von Zhao et al.18geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Zu den wichtigsten Schritten dieser Studie gehören die Erlangung reiner HiPSC-CMs, die Verbesserung der Aktivität von HiPSC-CMs durch Y-27632-Vorbehandlung und schließlich die Transplantation einer genauen Menge an HiPSC-CMs in ein Maus-MI-Modell.
Die wichtigsten Themen, die hier angesprochen wurden, waren, dass wir zunächst die glukosefreien Reinigungsmethoden19 optimiert und ein neuartiges effizientes Reinigungssystem etabliert haben. Das Systemverfahren umfasste die Anwendung von Zelldissoziationsenzymen, die Neupflanzung von Zellen in gelatinebeschichteten Platten, die Kultivierung der Zellen im Neutralisationsmedium für 24 h nach der Replatierung und die Minimierung der Verdauungszeit der Zellen vor der Transplantation, von denen durchgeführt wurden, um die höchste Aktivität der Zellen zu erreichen, während reine Kardiomyozyten zu erhalten.
Zweitens haben wir die Vorbehandlung von HiPSC-CMs mit Y-27632 bei 12 h vor der Zellinjektion ausgearbeitet. Die Anoikis wird in der Regel durch die Modifikation der Zelladhäsionsproteine induziert, wie integrine4,20 und N-Cadherin21, die zur Aktivierung des apoptotischen Weges führen. Wir haben gezeigt, dass die Y-27632-Vorbehandlung die Haftung von HiPSC-CMs an der Transplantationsstelle fördern kann, indem die Expression von Integrin Nr. 1 und N-Cadherin beibehalten wird, wodurch die Expression von p-MLC2 unterdrückt wird, was mit Veränderungen im Zytoskelett zusammenhängt. Architektur22,23. Sieben Tage nach der hiPSC-CM-Transplantation führten hiPSC-CMs+RI zu einer größeren Zellengraftmentfläche, feinerdefinierten Stabformen und einer vollständigeren zytoskelettalen Organisation im Vergleich zu hiPSC-CMs-RI (Abbildung 1B-D).
Drittens haben wir in Maus-MI-Modellen ein neuartiges intrazelluläres Injektionssystem mit 5 l pro Injektionspunkt eingerichtet, um die erforderliche Anzahl von Zellen genau zu injizieren und gleichzeitig eine Abnahme der Überlebensrate der Maus aufgrund eines übermäßigen Injektionsvolumens zu vermeiden.
Viertens haben wir erläutert, wie wir die Veränderungen der Zellkontraktion und der Kalziumtransienten in HiPSC-CMs nach der Vorbehandlung mit RI oder RA bestimmen können. Wir fanden heraus, dass Y-27632 die Zellkontraktilität und kalziumtransient eisern reduzieren kann. Die Hypothese hier ist, dass aufgrund des geringeren Energiebedarfs der transplantierten Zellen die Engraftmentrate zunahm. Ähnliche Effekte können mit dem Calciumkanal-Inhibitor verapamil erzielt werden. Der vorgeschlagene Mechanismus, der zur Kontraktilitätshemmung führt, besteht darin, dass Y-27632 die Expression der Troponin-Untereinheiten cTnT und cTnI in hiPSC-CMs reduziert.
Die Hauptbeschränkung ist, dass Y-27632 nur während der Transplantation eine vorübergehende Rolle gespielt hat. Wie Rho Kinase über einen längeren Zeitraum zu hemmen und damit die Transplantationseffizienz von hiPSC-CMs weiter zu verbessern, ist ein Problem, das in der Zukunft gelöst werden muss. Was die Anwendung dieser Methode betrifft, kann der ROCK-Hemmer nicht nur die Aktivität von Kardiomyozyten während der Transplantation verbessern, sondern auch die Aktivität anderer Zellen verbessern; daher kann es auch während der Vorbehandlung in den Transplantationsprozessen anderer Zellen verwendet werden. Darüber hinaus legt der hier vorgestellte Ansatz eine gute experimentelle Grundlage für mehr Forschung über Herzkrankheiten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Joseph C. Wu (Stanford University) für die freundliche Bereitstellung des Fluc-GFP-Konstrukts und Dr. Yanwen Liu für die hervorragende technische Unterstützung. Diese Studie wird von den National Institutes of Health RO1 Grants HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (zu J.Z.) und HL121206A1 (zu L.Z.) und einem R56-Stipendium HL142627 (zu W.Z.) unterstützt, einem American Heart Scientist 16SDG30410018 und die University of Alabama at Birmingham Faculty Development Grant (zu W.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| ImageJ | NIH | 1.52g |
References
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