Method Article

تعزيز تطعيم خلايا القلب المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان عن طريق تثبيط عابر لنشاط رو كيناز

DOI:

10.3791/59452

⸱

July 10th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Cardiovascular Diseases, School of Medicine, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Cardiac Surgery, The Second Xiangya Hospital of Central South University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، نقوم بشرح وتفصيل كيفية استخدام الخلايا الجذعية متعددة القوى التي يسببها الإنسان للتمايز وتنقية خلايا القلب، والمزيد، حول كيفية تحسين كفاءتها في زرع مع مثبطات كيناز البروتين المرتبطة بـ Rho المعالجة المسبقة في نموذج احتشاء عضلة القلب الماوس.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عامل حاسم في تحسين فعالية العلاج الخلوي لتجديد عضلة القلب هو زيادة بأمان وكفاءة معدل تطعيم الخلايا. Y-27632 هو مثبط قوي للغاية من الكينا البروتين المرتبطة بـ Rho، واللفائف المحتوية على لفائف (RhoA/ROCK) ويستخدم لمنع المبرمج الخلوي الناجم عن التفكك (anoikis). نثبت أن المعالجة المسبقة Y-27632 لخلايا القلب المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى (hiPSC-CMs+RI)قبل زرع نتائج في تحسين معدل تطعيم الخلايا في نموذج الماوس من احتشاء عضلة القلب الحاد (MI). هنا، نقوم بوصف إجراء كامل من التمايز hiPSC-CMs، وتنقية، والعلاج المسبق للخلايا مع Y-27632، فضلا عن تقلص الخلايا الناتجة، قياسات عابرة الكالسيوم، وزرع في نماذج MI الماوس. توفر الطريقة المقترحة طريقة بسيطة وآمنة وفعالة ومنخفضة التكلفة مما يزيد بشكل كبير من معدل تطعيم الخلايا. لا يمكن استخدام هذه الطريقة فقط جنبا إلى جنب مع طرق أخرى لزيادة تعزيز كفاءة زرع الخلايا ولكن أيضا يوفر أساسا مواتيا لدراسة آليات أمراض القلب الأخرى.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أظهرت العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية إمكانات كبيرة كعلاج لتلف القلب الناجم عن MI1. استخدام hiPSCs المتمايزة يوفر مصدرا لا ينضب من hiPSC-CMs2 ويفتح الباب أمام التطور السريع للعلاجات اختراق. ومع ذلك، لا تزال هناك العديد من القيود على الترجمة العلاجية، بما في ذلك التحدي المتمثل في انخفاض معدل تطعيم الخلايا المزروعة بشكل حاد.

فصل الخلايا مع التربسين يبدأ anoikis3، والتي يتم تسريعها فقط مرة واحدة يتم حقن هذه الخلايا في بيئات قاسية مثل عضلة القلب الإقفارية ، حيث البيئة نقص الأكسجة يسرع المسار نحو موت الخلايا. من الخلايا المتبقية، يتم غسل نسبة كبيرة من موقع الزرع في ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة ألاباما في برمنغهام، واستندت إلى المعاهد الوطنية للصحة مختبر رعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية (NIH المنشور لا 85-23).

1. إعداد لوحات الثقافة والإعلام والثقافة

  1. إعداد متوسط
    1. لhiPSC المتوسطة، مزيج 400 مل من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى (hPSC) الوسط القاعدي (جدولالمواد1) و 100 مل من الملحق hPSC 5X؛ تخزين الخليط في 4 درجة مئوية.
    2. للنوم في الدقيقة 1640/B27 ناقص الأنسولين (RB-) المتوسطة، مزيج 500 مل من RPMI 1640 و 10 مل من الملحق B27 ناقص الأنسول....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استمدت الـ hiPSC-CMs المستخدمة في هذه الدراسة من أصل بشري مع جين مراسل لوسيفيراز؛ لذلك، تم الكشف عن معدل البقاء على قيد الحياة من الخلايا المزروعة في الجسم الحي عن طريق التصوير الإنارة الحيوية (BLI)17 (الشكل1A،B). بالنسبة لأقسام القلب النسيجية، تم تصنيف التروبونين القلبي الخاص بالإنسان T (hcTnT) ومستضد نووي بشري (HNA) الخلايا ذات الإيجابية المزدوجة على أنها خلايا هيسي بك-CMs (الشكل1C)........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتشمل الخطوات الرئيسية لهذه الدراسة الحصول على hiPSC-CMs نقية، وتحسين نشاط hiPSC-CMs من خلال Y-27632 المعالجة المسبقة، وأخيرا، زرع كمية دقيقة من hiPSC-CMs في نموذج MI الماوس.

وكانت القضايا الرئيسية التي تم تناولها هنا هي أننا، أولاً، قمنا بتحسين أساليب التنقية الخالية من الجلوكوز19 وأنشأنا نظاماً جديداً فعالاً للتنقية. وشملت إجراءات النظام تطبيق إنزيمات تفكك الخلايا، وإعادة زرع الخلايا في لوحات مغلفة بالجيلاتين، وزراعة الخلايا في وسط التحييد لمدة 24 ساعة بعد إعادة الطلا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشكر المؤلفان الدكتور جوزيف وو (جامعة ستانفورد) على التكرم بتقديم بناء شركة Fluc-GFP والدكتور يانوين ليو على المساعدة التقنية الممتازة. ويدعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة RO1 المنح HL95077، HL114120، HL131017، HL138023، UO1 HL134764 (إلى J.Z.)، وHL121206A1 (إلى L.Z.)، وR56 منحة HL142627 (إلى W.Z.)، وهو جمعية القلب الأمريكية منحة العالم 16SDG30410018، وجامعة ألاباما في برمنغهام كلية منحة التنمية (إلى W.Z.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي > كاشف < / قوي >
أكوتاز (محلول انفصال الخلايا الجذعية) STEMCELLTechnologies# 07920
B27 ناقص الأنسولينمكمل فيشر العلميA1895601
B27فيشر ساينتفيك17-504-044
CHIR99021تقنيات الخلايا الجذعية72054
DMEM (1x) ، نسبة عالية من الجلوكوز ، HEPES ، بدون فينولأحمر Thermofisher20163029
مصل بقري الجنينAtlanta BiologicalsS11150
Fluo-4 AM (مؤشر الكالسيوم)Invitrogen / ThermofisherF14201
RPMI خال من الجلوكوز 1640فيشر ساينتفيك11879020
IWR1تقنيات الخلايا الجذعية72562
Matrigel (مصفوفة خارج الخلية) FisherScientificCB-40230C
mTeSR (وسط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات)تقنيات STEMCELL85850
مضاد حيوي Pen-Strepفيشر Scientific15-140-122
بلورونيك F-127 (بوليول خافض للتوتر السطحي)Sigma-AldrichP2443
Rho Activator IIالهيكل الخلويCN03
RPMI1640فيشر Scientific11875119
الصوديوم DL-lactateSigma-AldrichL4263
TrypLE (إنزيمات تفكك الخلايا)فيشر ساينتفيك12-605-010
فيراباميلسيجما ألدريتشV4629
Y-27632تقنيات الخلية الجذعية72304
< قوية>الاسمCompany Catalog NumberComments
Equipment and Supplies
IVIS Lumina III Bioluminescence InstrumentsCLS136334Elmer
15 مم CoverslipsWarnerCS-15R15
جهاز طرد مركزيEppendorf5415R
مجهر متحد البؤرأوليمبوسIX81
CryostatThermo ScientificNX50
جهاز تحكم في درجة الحرارة الأوتوماتيكي المزدوجWarner InstrumentsTC-344B
الطاقة BIO-RAD1645050
مجهر الفلورأوليمبوسIX83
كاميرا عالية السرعةpco1200 s
رأس المسح بالليزرأوليمبوسFV-1000
غرفة حمام مفتوحة منخفضة المستوى (تتصاعد في نظام الحضانة الدقيقة أعلاه)نظام الحضانة الدقيقة من Warner InstrumentsRC-42LP
Warner InstrumentsDH-40iL
جهاز التنفس الصناعي الماوس MiniventHarvard Apparatus845
NOD / SCID الفئرانمختبر جاكسون001303
المواد الهلامية البروتينية مسبقة الصبBIO-RAD4561033
PVDF حزم نقلBIO-RAD1704156
Trans-BlotBIO-RADTrans-Blot Turbo
معقم الخرز الساخنأدوات العلوم الدقيقة18000-45
<قوي> الاسم< / strong> Company< / strong> رقم الكتالوج< / strong>تعليقات< / strong>
Antibody< / strong>
anti-human nucleolin (Alexa Fluor 647)Abcamab198580
Cardiac Troponin TR & D SystemsMAB1874
Cardiac Troponin CAbcamab137130
Cardiac Troponin IAbcamab47003
Cy5-donkey المضاد للفأرمختبر جاكسون للأبحاث المناعية715-175-150
Cy3-donkey المضاد للأرانبمختبر جاكسون للأبحاث المناعية711-165-152
Fitc-donkey المضاد للفأرجاكسون مختبر البحوث المناعية715-095-150
GAPDHAbcamab22555
تروبونين القلب البشري TAbcamab91605
Integrin & beta ؛ 1Abcamab24693
Ki67EMD Milliporeab9260
N-cadherinAbcamab18203
Phospho-Myosin Light Chain 2Cell Signaling Technology3671s
NameCompanyCatalog NumberComments< / strong>
Software< / strong>
MatlabMathWorksR2016A
ImageJNIH1.52g
مزود

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
  2. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Induced Pluripotent Stem Cell derived CardiomyocytesRho Kinase InhibitionY 27632 PretreatmentCell Engraftment RateMyocardial Infarction ModelCell Dissociation EnzymesCalcium Transient MeasurementsConfocal MicroscopyWestern Blot AnalysisLuciferase Activity Assay

Related Articles