Summary
في هذا البروتوكول، نقوم بشرح وتفصيل كيفية استخدام الخلايا الجذعية متعددة القوى التي يسببها الإنسان للتمايز وتنقية خلايا القلب، والمزيد، حول كيفية تحسين كفاءتها في زرع مع مثبطات كيناز البروتين المرتبطة بـ Rho المعالجة المسبقة في نموذج احتشاء عضلة القلب الماوس.
Abstract
عامل حاسم في تحسين فعالية العلاج الخلوي لتجديد عضلة القلب هو زيادة بأمان وكفاءة معدل تطعيم الخلايا. Y-27632 هو مثبط قوي للغاية من الكينا البروتين المرتبطة بـ Rho، واللفائف المحتوية على لفائف (RhoA/ROCK) ويستخدم لمنع المبرمج الخلوي الناجم عن التفكك (anoikis). نثبت أن المعالجة المسبقة Y-27632 لخلايا القلب المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى (hiPSC-CMs+RI)قبل زرع نتائج في تحسين معدل تطعيم الخلايا في نموذج الماوس من احتشاء عضلة القلب الحاد (MI). هنا، نقوم بوصف إجراء كامل من التمايز hiPSC-CMs، وتنقية، والعلاج المسبق للخلايا مع Y-27632، فضلا عن تقلص الخلايا الناتجة، قياسات عابرة الكالسيوم، وزرع في نماذج MI الماوس. توفر الطريقة المقترحة طريقة بسيطة وآمنة وفعالة ومنخفضة التكلفة مما يزيد بشكل كبير من معدل تطعيم الخلايا. لا يمكن استخدام هذه الطريقة فقط جنبا إلى جنب مع طرق أخرى لزيادة تعزيز كفاءة زرع الخلايا ولكن أيضا يوفر أساسا مواتيا لدراسة آليات أمراض القلب الأخرى.
Introduction
وقد أظهرت العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية إمكانات كبيرة كعلاج لتلف القلب الناجم عن MI1. استخدام hiPSCs المتمايزة يوفر مصدرا لا ينضب من hiPSC-CMs2 ويفتح الباب أمام التطور السريع للعلاجات اختراق. ومع ذلك، لا تزال هناك العديد من القيود على الترجمة العلاجية، بما في ذلك التحدي المتمثل في انخفاض معدل تطعيم الخلايا المزروعة بشكل حاد.
فصل الخلايا مع التربسين يبدأ anoikis3، والتي يتم تسريعها فقط مرة واحدة يتم حقن هذه الخلايا في بيئات قاسية مثل عضلة القلب الإقفارية ، حيث البيئة نقص الأكسجة يسرع المسار نحو موت الخلايا. من الخلايا المتبقية، يتم غسل نسبة كبيرة من موقع الزرع في مجرى الدم وتنتشر في جميع أنحاء المحيط. واحدة من المسارات المبرمج ة الرئيسية هو مسار RhoA / ROCK4. استنادا إلى البحوث السابقة، ومسار RhoA / ROCK ينظم منظمة الأكتين الخلوية الهيكلية5،6، وهو المسؤول عن خلل الخلية7،8. يستخدم مثبطات ROCK Y-27632 على نطاق واسع خلال انفصال الخلايا الجسدية والجذعية وتمريرها، لزيادة التصاق الخلايا والحد من المبرمج للخلايا9و10و11. في هذه الدراسة، يستخدم Y-27632 لعلاج hiPSC-CMs قبل زرع في محاولة لزيادة معدل تطعيم الخلايا.
وقد تم إنشاء عدة طرق تهدف إلى تحسين معدل تطعيم الخلايا، مثل الصدمة الحرارية والطابق السفلي طلاء مصفوفة غشاء12. وبصرف النظر عن هذه الأساليب، يمكن للتكنولوجيا الوراثية أيضا تعزيز انتشار خلايا القلب13 أو عكس الخلايا غير المريمية في خلايا القلب14. من منظور الهندسة الحيوية، يتم زرع خلايا القلب على سقالة المواد الحيوية لتحسين كفاءة زرع15. ومما يؤسف له أن غالبية هذه الأساليب معقدة ومكلفة. على العكس من ذلك، فإن الطريقة المقترحة هنا بسيطة وفعالة من حيث التكلفة وفعالة، ويمكن استخدامها كعلاج القاعدية قبل زرع، وكذلك في الاقتران مع التكنولوجيات الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة ألاباما في برمنغهام، واستندت إلى المعاهد الوطنية للصحة مختبر رعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية (NIH المنشور لا 85-23).
1. إعداد لوحات الثقافة والإعلام والثقافة
-
إعداد متوسط
- لhiPSC المتوسطة، مزيج 400 مل من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى (hPSC) الوسط القاعدي (جدولالمواد1) و 100 مل من الملحق hPSC 5X؛ تخزين الخليط في 4 درجة مئوية.
- للنوم في الدقيقة 1640/B27 ناقص الأنسولين (RB-) المتوسطة، مزيج 500 مل من RPMI 1640 و 10 مل من الملحق B27 ناقص الأنسولين.
- لRPMI 1640/B27 (RB +) المتوسطة، مزيج 500 مل من RPMI 1640، 10 مل من الملحق B27، و 5 مل من البنسلين-ستربيميتاسين (القلم العقدية) المضادات الحيوية.
- لتنقية المتوسطة16، مزيج 500 مل من لا الجلوكوز RPMI 1640 ، 10 مل من الملحق B27 ، 5 مل من المضادات الحيوية القلم العقدية ، و 1000 ميكرولتر من محلول الصوديوم DL-لاكتات (في تركيز نهائي من 4 MM).
- لحل تحييد، مزيج 200 مل من RPMI 1640، 50 مل من مصل البقر الجنيني (FBS)، 2.5 مل من المضادات الحيوية القلم العقدية، و 50 ميكرولتر من Y-27632 (في تركيز نهائي من 10 درجة مئوية).
- بالنسبة لوسط التجميد، يُمزج 9 مل من FBS، و1 مل من كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO)، و10 ميكرولتر من Y-27632 (بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر).
- لحل المصفوفة خارج الخلية (EMS)، ذوبان مصفوفة خارج الخلية المركزة (جدولالمواد1) في 4 درجة مئوية حتى وصلت إلى حالة سائلة متسقة بالتساوي. نصائح ماصة Precool وأنابيب قبل صنع aliquots مصفوفة من 350 ميكرولتر كل على الجليد، وتخزين aliquots في -20 درجة مئوية. قبل طلاء لوحات، تمييع واحد aliquot المذاب في 24 مل من الجليد الباردة DMEM / F12 المتوسطة (EMS)؛ الحفاظ على EMS في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
ملاحظة: تنفيذ جميع خطوات الطلاء على الجليد لمنع تقوية مصفوفة غشاء الطابق السفلي. - لحل Tyrode، تأخذ 90٪ من الحجم النهائي المطلوب من المياه درجة زراعة الأنسجة، إضافة الكمية المناسبة من الكواشف التالية، ويحرك حتى يذوب. ثم، استخدم 1 N NaOH لضبط الحموضة إلى 7.4. إضافة ماء إضافي إلى التركيز النهائي من 140 مليمول / لتر كلوريد الصوديوم، 1 مليمول / لتر كلوريد المغنيسيوم، 10 مليمول / لتر HEPES، 5 مليمول / لتر كلوريد البوتاسيوم، 10 مليمول / لتر الجلوكوز، و 1.8 مليمول / لتر كلوريد الكالسيوم. تعقيم عن طريق الترشيح، وذلك باستخدام غشاء 0.22 ميكرومتر.
-
خلية طلاء لوحة ثقافة
- للوحات ثقافة hiPSC، وتطبيق 1 مل من EMS على كل بئر من لوحة 6 جيدا واحتضان لوحة لمدة ساعة واحدة على الأقل في 37 درجة مئوية. يستنشق DMEM /F12 الحل قبل خلايا البذر.
- لطلاء الجيلاتين، حل 0.2 غرام من مسحوق الجيلاتين في المياه الصف ثقافة الأنسجة لجعل 0.2٪ (ث / الخامس) الحل. تعقيم عن طريق الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية، 15 رطل لكل دقيقة معطف كل بئر من لوحة 6 جيدا مع 2 مل من الحل وحضانة لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. قبل تمرير الخلايا، يستنشق الحل والسماح لللوحة لتجف لمدة 1 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة داخل غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة.
2. hiPSC الصيانة واستئصال عضلة القلب التمايز
- قم بزراعة الـ hiPSCs في وسط hiPSC (انظر الخطوة 1.1.1) مع تغيير متوسط يومي حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80%-90% لكل بئر.
ملاحظة: لأغراض الصيانة، hiPSCs هي عموما على استعداد للمرور كل 4 أيام. - لتمرير hiPSCs، يستنشق المتوسط وغسل البئر 1X مع 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS). إضافة 0.5 مل من حل مفرزة الخلايا الجذعية (جدولالمواد1) إلى كل بئر وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 5-7 دقيقة.
ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة على كثافة الخلايا ومعدل التفكك، والتي يمكن ملاحظتها تحت المجهر. - تحييد حل مفرزة الخلايا الجذعية مع 1 مل من hiPSC المتوسطة تستكمل مع 5 μM Y-27632. جمع الخليط في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. طرد مركزي أنبوب لمدة 5 دقائق في 200 × ز، يستنشق supernatant دون إزعاج بيليه الخلية، ومن ثم، إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من hiPSC المتوسطة التي تحتوي على 5 μM Y-27632.
- بذور hiPSCs على لوحة جديدة EMS المغلفة 6-جيدا بنسبة بين 1:6 إلى 1:18. تغيير المتوسط إلى hiPSC المتوسطة دون Y27632 بعد 24 ساعة.
- لتجميد الخلايا، إعادة تعليق hiPSCs منفصلة في وسط التجميد بتركيز 0.5-1 مليون/500 درجة مئوية، ووضع التعليق في cryovials، وتخزينها في فريزر -80 درجة مئوية. نقل قارورة المجمدة إلى النيتروجين السائل بعد 24 ساعة.
- للتمييز، استبدل وسيط hiPSC بـ 2 مل من RB- متوسطة مكمّلة بمثبطات GSK-3β 10 درجة مئوية CHIR99021 (CHIR) عند 80% - 90% من التقاء الخلايا. يستعاض عن المتوسط بـ 3 مل من RB-medium بعد 24 ساعة وحضانة لمدة 48 ساعة إضافية (اليوم 3).
- في اليوم 3، تغيير المتوسط إلى 3 مل من RB- المتوسطة مع 10 μM Wnt المانع IWR1 لمدة 48 ساعة (اليوم 5)، ثم استبدال المتوسطة مع 3 مل من RB- المتوسطة والحفاظ على 48 ساعة (اليوم 7).
- في اليوم 7، استبدال المتوسطة مع 3 مل من RB المتوسطة وتغيير المتوسطة كل 3 أيام المضي قدما. وينبغي ملاحظة الضرب التلقائي للـ hiPSC-CMs بين الأيام 7-10.
3. hiPSC-CMs تنقية وجزيء صغير قبل المعالجة
ملاحظة: وقد استخدمت الإنزيمات عالية النقاء، المؤتلفة خلية تفكك (جدولالمواد1) لتفكك hiPSC-CMs.
- في اليوم 21 بعد تمايز hiPSC-CM، يستنشق المتوسط ويغسل الخلايا 1x مع PBS المعقمة. احتضان الخلايا مع 0.5 مل من إنزيمات تفكك الخلايا لكل بئر لمدة 5-7 دقائق عند 37 درجة مئوية. الماصة مرارا وتكرارا تعليق الخلية باستخدام ماصة 1 مل من أجل فصل الخلايا تماما.
- بعد فصل الخلايا، إضافة 1 مل من حل تحييد لكل بئر، وجمع خليط الخلية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل والطرد المركزي في 200 × غرام لمدة 3 دقائق.
- إعادة زرع الخلايا على الجيلاتين المغلفة 6-جيدا لوحات في كثافة 2 مليون خلية في بئر.
- بعد 24-48 ساعة، استبدل الوسيط الثقافي بوسيلة تنقية لمدة 3-5 أيام.
ملاحظة: تنقية كاملة عندما أكثر من 90٪ من الخلايا في كل حقل عرض المجهر هي الضرب. لمنع المزيد من الضرر لخلايا القلب، لا تمدد مدة التنقية إلى ما بعد 5 أيام. إذا كانت الجولة الأولى لا تسفر عن النقاء اللازم، استبدل وسيط التنقية بـ RB+ المتوسطة لمدة يوم واحد، ثم أكمل جولة ثانية من التنقية. - قبل زرع، زراعة الخلايا في مجموعة العلاج لمدة 12 ساعة في RB + المتوسطة تستكمل مع 10 μM Y-27632. وبالمثل، إجراء العلاج فيراباميل على الخلايا في RB + المتوسطة مع 1 ميكروم فيراباميل لمدة 12 ساعة (hiPSC-CMs+VER).
- بعد العلاج، اغسل hiPSC-CMs 1x مع PBS وحضانة الخلايا مع 0.5 مل من إنزيمات تفكك الخلايا لكل بئر كحد أقصى لمدة 2 دقيقة. تحييد الخلايا مع حل تحييد، وجمع خليط الخلية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 3 دقائق.
4. احتشاء عضلة القلب وزرع الخلايا
ملاحظة: يتم تعقيم جميع الأدوات الجراحية مع الأوتوكلاف ويتم الحفاظ عليها في حالة معقمة خلال عمليات جراحية متعددة عن طريق معقم حبة الساخنة (جدولالمواد2).
- التخدير NOD / scid الفئران (جدولالمواد2) مع الايسوفلوران استنشاق (1.5٪-2٪). مراقبة مستويات التخدير من قبل استجابات الفئران لقرصة اصبع القدم. ضع مرهم بصري بيطري على العينين لمنعها من التجفيف أثناء الجراحة.
- توريد 0.1 مغ/كغ بوبرينورفين تحت الجلد لإدارة الألم قبل الجراحة.
- وضع وتأمين الماوس في موقف supine على طاولة تشغيل ساخنة، وإزالة الشعر من منطقة الرقبة البطني والصدر الأيسر باستخدام كريم مزيل الشعر، وفضح الجلد، وتطهيره مع الكحول 70٪.
- قطع شق 0.5 سم في وسط الرقبة باستخدام مقص الجراحية، وفصل الدهون تحت الجلد مع ملقط معقمة، وفضح القصبة الهوائية. أدخل عن طريق الفم قنية التنبيب في القصبة الهوائية، وربط قنية إلى جهاز التنفس الصناعي الحيوان الصغيرة، وضبط إعدادات التهوية (تعيين حجم المد والجزر في 100-150 درجة مئوية ومعدل التنفس في 100x-150x في الدقيقة).
- بعد استقرار الماوس، اقطع شقًا بحجم 0.5 سم في منتصف جلد الصدر الأيسر. استخدام ملقط لفصل طبقة العضلات بصراحة وجعل شق صغير في الفضاء الوربي الخامس لفضح تجويف الصدر. ضع الجرار في الشق لفتح تجويف الصدر وتحديد موقع الشريان التاجي التنازلي الأيسر (LAD). تحت المجهر الجراحي تشريح، ligate LAD مع 8-0 خياطة غير قابلة للامتصاص.
- مباشرة بعد الحث MI، حقن 5 ميكرولتر من hiPSC-CMs-RI،hiPSC-CMs+RI،hiPSC-CMs-VER، hiPSC-CMs+ VER،أو حجم متساو من PBS في عضلة القلب الماوس في كل موقع (3 × 105 خلايا / الحيوان، 1 × 105 الخلايا / الموقع)، واحد في منطقة احتشاء واثنين في المناطق المحيطة احتشاء.
ملاحظة: منذ 5 μL هو حجم صغير جدا، فإنه ليس من السهل السيطرة بدقة على حجم عن طريق مص مباشرة مع حقنة. يمكن تسليم غطاء طبق بيتري العقيم، ويمكن إيداع 5 ميكرولتر من الخلايا أولاً على الغطاء مع ماصة. بسبب التوتر السطحي، فإنه لن ينتشر ولكن سوف تتكثف في كتلة سائلة صغيرة. ويمكن امتصاص هذا بسهولة وحقنه في عضلة القلب الماوس. - القضاء على الهواء المتبقي في تجويف الصدر عن طريق ملء مع حل ملحي متساوي التوتر الدافئ. غرزة الأضلاع والعضلات والجلد في تسلسل مع خياطة 6-0 قابلة للامتصاص. إيقاف حقن التخدير isoflurane. الحفاظ على الحيوانات جراحة على وسادة التدفئة ومراقبة عن كثب لهم في حين أنها استعادة الوعي الكامل. ثم ضع الحيوانات في قفص نظيف. لا تقم بإعادة الحيوانات إلى صحبة الحيوانات الأخرى حتى يتم استردادها بالكامل.
- بعد الجراحة، حقن الفئران داخل اقبولات مع البوبرينورفين (0.1 ملغ / كغ) كل 12 ساعة لمدة 3 أيام متتالية وحقنها مع ايبوبروفين (5 ملغ / كغ) كل 12 ساعة ليوم واحد. إجراء دراسات تحليلية لاحقة في نقاط زمنية محددة.
ملاحظة: اتبع إرشادات لجنة رعاية الحيوانات المحلية الخاصة بك للتسكين.
5. الكالسيوم العابر وتسجيل الانقباض
- الأوتوكلاف 15 مم قطر الأغطية (جدولالمواد2) وملاقط في كوب زجاجي صغير في 121 درجة مئوية، 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 15 دقيقة.
- باستخدام ملاقط، ضع غطاء في لوحة 12 جيدا وماصة 300 ميكرولتر من المصفوفة خارج الخلية على كل غطاء.
ملاحظة: لا تدع المصفوفة تتجاوز حافة غطاء لمنع الحد من كمية طلاء المصفوفة. احتضان لوحة 12 جيدا في حاضنة ثقافة الخلية 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. - قم بإستقثيال الوسيلة في طبق 6-well المطلي بالجيلاتين مع hiPSC-CMs النقي، واغسله 1x مع PBS، ثم هضمه بـ 0.5 مل من إنزيمات انفصال الخلايا لمدة 1.5 دقيقة. ، والطرد المركزي الخليط في 200 × ز لمدة 3 دقائق.
- قم بإستنسخ المصفوفة خارج الخلية المغلفة من الأغطية. عد رقم الخلية وأعد تعليق الخلايا في محلول تحييد إلى تركيز 40،000/300 درجة مئوية، ثم إضافة 300 ميكرولتر من تعليق الخلية على كل غطاء. ثقافة لوحة في حاضنة 37 درجة مئوية.
- بعد 24 ساعة، يستنشق بلطف الحل تحييد، إضافة 500 درجة مئوية من RB + المتوسطة إلى كل بئر من لوحة، والاستمرار في الثقافة لمدة 2 أيام.
- إضافة Y-27632 (10 درجة مئوية)، رو كيناز المنشط (RA، 100 nM)، فيراباميل (1 درجة مئوية)، أو حجم متساو من PBS في وسط الثقافة من hiPSC-CMs، 12 ساعة قبل الكالسيوم العابر وكشف الانقباض.
ملاحظة: بالإضافة إلى الكشف عن الكالسيوم العابر للخلايا وتقلصها بعد 12 ساعة من المعالجة الكيميائية، تم اختبار الكشف عن هذه المعلمات أيضا في 12، 24، 48، و 72 ساعة بعد الانسحاب الكيميائي. - إخراج لوحة، وتجاهل المتوسطة، وغسل لوحة 1X مع PBS. تغيير المتوسط إلى DMEM خالية من الفينول الأحمر تحتوي على 0.02٪ (ث / خمس) من بوليول السطحي (جدولالمواد1)، 5 ميكرومتر مؤشر الكالسيوم (جدولالمواد1)، وما يقابل Y-27632 (10 ميكرومتر)، RA (100 nM)، فيراباميل (1 ميكرومتر)، أو حجم متساو من PBS، واحتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- تخلص من الـ supernatant، واغسل الخلايا 3x مع DMEM متوسطة خالية من الصبغة، واترك الباقي المتوسط لمدة 30 دقيقة لإزالة استريفي صبغة الخرائط.
- ضع غطاء الغطاء ببذور الخلية في غرفة حمام مفتوحة وأدخل الغرفة في نظام microincubation متساوية إلى 37 درجة مئوية مع جهاز تحكم أوتوماتيكي في درجة الحرارة (جدولالمواد2)، وغرسه مع محلول Tyrode، وإضافة باستمرار مثبطات رو كيناز (RI)، RA، أو PBS إلى محلول التسريب.
- استخدام مجهر الفلورة المقلوب (جدولالمواد2) ورأس المسح الضوئي بالليزر (جدولالمواد2) لتسجيل الكالسيوم التلقائي عابر عن طريق استخدام x-t خط المسح الضوئي، وذلك باستخدام ليزر الأرجون 488 نانومتر للإثارة صبغ و 515 ± 10 نانومتر حاجز مرشح لجمع ضوء الانبعاثات. تسجيل الانكماش التلقائي من hiPSC-CMs باستخدام وظيفة التباين التداخل التفاضلي من المجهر البؤري (جدولالمواد2).
ملاحظة: تم معالجة تسجيلات الكالسيوم العابرة وتحليلها باستخدام برنامج MATLAB R2016A (جدولالمواد4). تم إجراء اختبار تغيير تقلص الخلايا باستخدام برنامج ImageJ (جدولالمواد4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استمدت الـ hiPSC-CMs المستخدمة في هذه الدراسة من أصل بشري مع جين مراسل لوسيفيراز؛ لذلك، تم الكشف عن معدل البقاء على قيد الحياة من الخلايا المزروعة في الجسم الحي عن طريق التصوير الإنارة الحيوية (BLI)17 (الشكل1A،B). بالنسبة لأقسام القلب النسيجية، تم تصنيف التروبونين القلبي الخاص بالإنسان T (hcTnT) ومستضد نووي بشري (HNA) الخلايا ذات الإيجابية المزدوجة على أنها خلايا هيسي بك-CMs (الشكل1C). وأشارت كلتا النتيجتين إلى أن المعالجة المسبقة Y-27632 حسنت بشكل كبير معدل تطعيم الخلايا. تم زيادة نشاط لوسيفيراز من مجموعة hiPSC-CM+RI حوالي ستة أضعاف في الأيام 3 و 7 و 28 بعد الزرع، مقارنة بمجموعة hiPSC-CM-RI (الشكل1B). وعلاوة على ذلك، زاد التعبير hcTnT/HNA ما يقرب من سبعة أضعاف في مجموعة hiPSC-CM+RI، بالمقارنة مع ذلك في مجموعة hiPSC-CM-RI (الشكل1C).
وأشارت النتائج أيضا إلى أن Y-27632 المعالجة المسبقة تنظم التغيرات السيتوالهيكلية في الخلايا المزروعة. في اليومين 7 و 28 من زرع، أظهر hiPSC-CMs+RI بنية كبيرة وأكثر تحديدا على شكل قضيب في الهيكل العظمي بالمقارنة مع hiPSC-CMs-RI (الشكل1D).
وعلاوة على ذلك، Y-27632 المعالجة المسبقة لديها القدرة على الحد من زرع hiPSC-CM المبرمج في الجسم الحي. وأظهرت تلطيخ TUNEL أن عدد الخلايا الإيجابية TUNEL انخفض بشكل ملحوظ في مجموعة hiPSC-CM+ RI نسبة إلى ذلك في مجموعة hiPSC-CM-RI في اليوم 2 بعد زرع (الشكل1E).
تعزيز تثبيط ROCK التصاق الخلايا المزروعة وكان لديه القدرة على زيادة الاحتفاظ بالخلايا المزروعة في مواقع الإدارة. اللطخة الغربية وأنسجة القلب مناعة اقترح أن Y-27632 المعالجة المسبقة عززت عكس التعبير عن integrin β1 و N-الكادرين وانخفضت التعبير عن سلسلة الضوء فوسفو ميوسين 2 (P-MLC2) (الشكل2A،B ).
تم اختيار خط خلية الماوس HL-1 كالتحكم CMs لتجارب مرفق الخلية في المختبر. وأشارت النتائج إلى أن المعالجة المسبقة Y-27632 زادت بشكل كبير من الالتزام بـ HIPSC-CM بالنسبة إلى HL-1. لمزيد من التأكيد على هذه النتائج، تم احتضان hiPSC-CMs+ RI مع N-الكادهيرين أو integrin β1 تحييد الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة، مما أدى إلى تلاشي التصاق محسنة ينظر سابقا (الشكل2C).
بالمقارنة مع مجموعة hiPSC-CM-RI، تم تخفيض القوة العقدية في مجموعة hiPSC-CM+RI بنسبة 32٪، وفي مجموعة hiPSC-CM+RA (hiPSC-CMs المعالجة مسبقا مع المنشط روك، جدول المواد1)، تم زيادتها بنسبة 42٪ ( الشكل 3ألف). وفي الوقت نفسه، بالمقارنة مع مجموعة hiPSC-CM-RI، تم تخفيض ذروة الفلورة العابرة الكالسيوم (ذروة ΔF /F0)لمجموعة hiPSC-CM+RI بنسبة 41٪، وتم تخفيض مدة الكالسيوم العابرة (CaTD50) بنسبة 11٪ (الشكل 3B C). وعلى النقيض من ذلك، تم زيادة ذروة ΔF /F0 لمجموعة hiPSC-CM+RA بنسبة 48٪، وCaTD50 بنسبة 13٪ (الشكل3B،C).
وبالإضافة إلى ذلك، فإن المعالجة المسبقة لخلايا القلب مع Y-27632 لمدة 12 ساعة قبل زرع خفضت بشكل كبير التعبير عن cTnI وcTnT (الشكل3D)،وكلاهما هي وحدات فرعية تروبونين (Tn) التي تنظم تقلص عضلة القلب.
على غرار Y-27632، المعالجة المسبقة فيراباميل (1 μM، 12 ح) زيادة كبيرة في معدل الطعوم من hiPSC-CMs في الفئران MI المستحثة. وقد تأكدت الفرضية من خلال مراقبة زيادة إشارة لوسيفيراز في اختبار الإنارة الحيوية (الشكل4A)وزيادة أعداد الخلايا الإيجابية المزدوجة hcTnT/HNA في اليومين 7 و 28 بعد زرع الخلايا (الشكل4B).
الشكل 1: زادت المعالجة المسبقة Y-27632 معدل الطعوم من الـ hiPSC-CMs في قلوب فئران MI. (أ) منحنى قياسي من قياسات BLI. (B) إشارة لوسيفيرين في الفئران NOD / scid تعامل مع PBS، hiPSC-CMs-RI،أو hiPSC-CMs+RI في الأيام 3 و 7 و 28 بعد الجراحة. n = 6-9 فئران لكل مجموعة. *P < 0.05 vs. PBS; † P < 0.05 vs. hiPSC-CMs-RI . (C) تلطيخ المناعة من أقسام القلب لhcTnT وHNA. قضبان مقياس = 100 ميكرومتر (10X الصور)؛ 20 ميكرومتر (40x الصور). n = 5 فئران لكل مجموعة. *P < 0.05 vs. hiPSC-CMs-RI . (D) الصور التمثيلية لأقسام القلب ملطخة بالفيلويدين وhcTnT. شريط مقياس = 20 درجة مئوية ن = 5 فئران لكل مجموعة. *P < 0.05 vs. hiPSC-CMs-RI . (E) صور تمثيلية لأقسام القلب لتلطيخ TUNEL. شريط مقياس = 20 درجة مئوية ن = 4-6 فئران لكل مجموعة. *P < 0.05 vs. hiPSC-CMs-RI . تم تعديل هذا الرقم من تشاو وآخرون18. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عززت Y-27632 التصاق hiPSC-CMs من خلال الحفاظ على التعبير عن بروتينات التصاق. (A و B)تحليل اللطخة الغربية للتعبير عن integrin ß1، N-كادرين، والفوسفور من MLC2 (p-MLC2) في hiPSC-CMs تعامل مع RI وفي hiPSC-CMs غير المعالجة. (C) hcTnT تحليل تلطيخ المناعة من -RI و + RI hiPSC-CMs مع وبدون المعالجة المسبقة لمكافحة N-الكادرين (N-Cad) والمضادة للintegrin ß1 (Integ) الأجسام المضادة. قضبان المقياس = 100 درجة مئوية *P < 0.05 مقابل hiPSC-CMs-RI; † P < 0.05 vs. hiPSC-CMs+RI. تم تعديل هذا الرقم من تشاو وآخرون18. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المعالجة المسبقة مع Y-27632 خفضت من انقباض hiPSC-CMs وخفضت تنظيم التعبير عن الوحدات الفرعية تروبونين القلب. (أ) التحديد الكمي للنسبة المئوية لتقصير الـ hiPSC-CMs المعرضة لعلاج RI وRA. *P < 0.05 vs. hiPSC-CMs-RI; † P < 0.05 vs. hiPSC-CMs+RI. (B و C)الصور التمثيلية والقياس الكمي للقياسات العابرة للكالسيوم من hiPSC-CMs تعامل مع RI وRA ومجموعة غير المعالجة. *P < 0.05 vs. hiPSC-CMs-RI; † P < 0.05 vs. hiPSC-CMs+RI. (D) تحليل وصمة عار الغربية للتعبير عن الوحدات الفرعية تروبونين القلب (cTnC، cTnT، وcTnI) في hiPSC-CMs تعامل مع RI وRA وفي مجموعة غير المعالجة. تم تعديل هذا الرقم من تشاو وآخرون18. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: أدى العلاج المسبق في فيراباميل إلى تحسين معدل الطعوم من الـ hiPSC-CMs في فئران MI. (أ) إشارة لوسيفيرين في الفئران NOD / scid تعامل مع PBS، hiPSC-CMs-VER،أو hiPSC-CMs+ VER في الأيام 3 و 7 و 28 بعد الجراحة. n = 8 فئران لكل مجموعة. *P < 0.05 vs. PBS; † P < 0.05 vs. hiPSC-CMs-VER . (B) تلطيخ المناعة من أقسام القلب لhcTnT وHNA. بالنسبة للصور التي تبلغ 10 x، أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (صور 10x)؛ 20 ميكرومتر (40x الصور). n = 5 فئران لكل مجموعة. *P < 0.05 vs. hiPSC-CMs-VER . تم تعديل هذا الرقم من تشاو وآخرون18. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتشمل الخطوات الرئيسية لهذه الدراسة الحصول على hiPSC-CMs نقية، وتحسين نشاط hiPSC-CMs من خلال Y-27632 المعالجة المسبقة، وأخيرا، زرع كمية دقيقة من hiPSC-CMs في نموذج MI الماوس.
وكانت القضايا الرئيسية التي تم تناولها هنا هي أننا، أولاً، قمنا بتحسين أساليب التنقية الخالية من الجلوكوز19 وأنشأنا نظاماً جديداً فعالاً للتنقية. وشملت إجراءات النظام تطبيق إنزيمات تفكك الخلايا، وإعادة زرع الخلايا في لوحات مغلفة بالجيلاتين، وزراعة الخلايا في وسط التحييد لمدة 24 ساعة بعد إعادة الطلاء، وتقليل وقت هضم الخلايا قبل الزرع، كل ذلك منها أجريت لتحقيق أعلى نشاط من الخلايا في حين الحصول على خلايا القلب النقية.
ثانيا، وضعنا بالتفصيل على المعالجة المسبقة لhiPSC-CMs مع Y-27632 في 12 ح قبل حقن الخلية. عادة ما يتم حث anoikis عن طريق تعديل بروتينات التصاق الخلايا ، مثل integrins4،20 و N-cadherin21، التي تؤدي إلى تنشيط المسار المبرمج. أظهرنا أن المعالجة المسبقة Y-27632 يمكن أن تعزز التصاق hiPSC-CMs إلى موقع زرع من خلال الحفاظ على التعبير عن integrin β1 و N-cadherin، وقمع التعبير عن P-MLC2، الذي يرتبط بالتغيرات في الخلايا الهيكلية الهندسة المعمارية22,23. بعد سبعة أيام من زرع hiPSC-CM، أدى hiPSC-CMs+RI إلى زيادة مساحة تطعيم الخلايا، وأدق أشكال قضبان محددة، وتنظيم أُوسيتوووووووووووجي أكثر اكتمالاً مقارنة بـ hiPSC-CMs-RIMs (الشكل1B-D).
ثالثا، أنشأنا نظام حقن داخل الخلايا جديدة في نماذج MI الماوس، مع 5 ميكرولتر لكل نقطة حقن لحقن بدقة العدد المطلوب من الخلايا، مع تجنب انخفاض في معدل بقاء الماوس بسبب حجم الحقن المفرط.
رابعا، وضعنا بالتفصيل حول كيفية تحديد التغيرات في تقلص الخلايا والكالسيوم عابرة في hiPSC-CMs بعد المعالجة المسبقة مع RI أو RA. وجدنا أن Y-27632 يمكن أن تقلل بشكل عكسي من انقباض الخلايا والكالسيوم عابر. الفرضية هنا هي أنه بسبب انخفاض متطلبات الطاقة من الخلايا المزروعة، ارتفع معدل الطعوم. ويمكن تحقيق آثار مماثلة باستخدام مثبطات قناة الكالسيوم فيراباميل. الآلية المقترحة التي تؤدي إلى تثبيط الانقباض هو أن Y-27632 يقلل من التعبير عن وحدات فرعية تروبونين cTnT وcTnI في hiPSC-CMs.
القيد الرئيسي هو أن Y-27632 لعبت فقط دورا عابرا خلال عملية الزرع. كيفية تثبيط رو كيناز لفترة أطول، وبالتالي زيادة تحسين كفاءة زرع hiPSC-CMs، هي مشكلة يجب حلها في المستقبل. أما بالنسبة لمزيد من التطبيقات من هذا الأسلوب، لا يمكن لمثبطات ROCK فقط تحسين نشاط خلايا القلب أثناء الزرع ولكن أيضا تعزيز نشاط الخلايا الأخرى. لذلك، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم أثناء المعالجة المسبقة في عمليات زرع الخلايا الأخرى. وعلاوة على ذلك، فإن النهج المعروض هنا يضع أساسا تجريبيا جيدا لمزيد من البحوث بشأن أمراض القلب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ويشكر المؤلفان الدكتور جوزيف وو (جامعة ستانفورد) على التكرم بتقديم بناء شركة Fluc-GFP والدكتور يانوين ليو على المساعدة التقنية الممتازة. ويدعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة RO1 المنح HL95077، HL114120، HL131017، HL138023، UO1 HL134764 (إلى J.Z.)، وHL121206A1 (إلى L.Z.)، وR56 منحة HL142627 (إلى W.Z.)، وهو جمعية القلب الأمريكية منحة العالم 16SDG30410018، وجامعة ألاباما في برمنغهام كلية منحة التنمية (إلى W.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| ImageJ | NIH | 1.52g |
References
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
