Summary
В этом протоколе мы демонстрируем и подробно о том, как использовать искусственные плюрипотентные стволовые клетки человека для диффериоцитной дифференциации и очистки, и далее, о том, как улучшить его эффективность трансплантации с ингибитором родо-синазы, связанных с Ро-ассоциированным предварительной обработки в модели инфаркта миокарда мыши.
Abstract
Решающим фактором в повышении эффективности клеточной терапии для регенерации миокарда является безопасное и эффективное увеличение скорости прививок клеток. Y-27632 является очень мощным ингибитором Rho-связанных, скручивания,содержащих белок киназы (RhoA/ ROCK) и используется для предотвращения диссоциации индуцированной клеточной апоптозы (anoikis). Мы демонстрируем, что Y-27632 предлечения для человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов (hiPSC-CMsЗРИ) до имплантации приводит к улучшению скорости клеток при в мышиной модели острого инфаркта миокарда (MI). Здесь мы описываем полную процедуру дифференциации hiPSC-CMs, очищения и клеточной предобработки с помощью Y-27632, а также результирующее сокращение клеток, временные измерения кальция и трансплантацию в мышиные модели MI. Предлагаемый метод обеспечивает простой, безопасный, эффективный и недорогой метод, который значительно увеличивает скорость прививок клеток. Этот метод не может быть использован только в сочетании с другими методами для дальнейшего повышения эффективности трансплантации клеток, но и обеспечивает благоприятную основу для изучения механизмов других сердечных заболеваний.
Introduction
Стволовые клетки на основе терапии показали значительный потенциал в качестве лечения сердечного повреждения, вызванного MI1. Использование дифференцированных HIPSCs обеспечивает неисчерпаемый источник hiPSC-CMs2 и открывает двери для быстрого развития прорыв лечения. Тем не менее, многие ограничения на терапевтический перевод остаются, в том числе проблема сильно низкой скорости прививок имплантированных клеток.
Диссоциирующая клетка с трипсином инициирует anoikis3, который только ускоряется, как только эти клетки вводят сявок в суровые среды, такие как ишемический миокард, где гипоксическая среда ускоряет курс к смерти клеток. Из оставшихся клеток значительная часть вымывается из места имплантации в кровоток и распространяется по всей периферии. Одним из ключевых апоптотических путей является путьRhoA/ROCK 4. Основываясь на предыдущих исследованиях, RhoA / ROCK путь регулирует актина цитоскелетной организации5,6, который отвечает за дисфункцию клеток7,8. Ингибитор ROCK Y-27632 широко используется при соматической и стволовой клетке диссоциации и прохода, чтобы увеличить слипания клеток и уменьшить апоптоз клеток9,10,11. В этом исследовании, Y-27632 используется для лечения hiPSC-CMs до трансплантации в попытке увеличить скорость прививования клеток.
Было установлено несколько методов, направленных на улучшение скорости прививок клеток, таких как тепловой шок и мембранное матримальное покрытие подвала12. Помимо этих методов, генетические технологии могут также способствовать пролиферации кардиомиоцитов13 или обратить вспять немиокардиальные клетки в кардиомиоциты14. С точки зрения биоинженерии, кардиомиоциты посеяны на биоматериал эшафот для повышения эффективности трансплантации15. К сожалению, большинство из этих методов являются сложными и дорогостоящими. Напротив, предложенный здесь метод прост, экономичен и эффективен, и его можно использовать как базальное лечение до трансплантации, так и в спряжении с другими технологиями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных в этом исследовании были одобрены Институциональным Комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Университета Алабамы в Бирмингеме и были основаны на Национальных институтах здравоохранения лабораторных животных уход и использование Руководящих принципов (NIH Публикация Нет 85-23).
1. Подготовка культурных медиа- и культурных плит
-
Средняя подготовка
- Для hiPSC среды, смешать 400 мл человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) базальной среде(Таблица материалов 1) и 100 мл hPSC 5x дополнения; хранить смесь при 4 градусах По Цельсию.
- Для RPMI 1640/B27 минус инсулин (RB-) средний, смесь 500 мл RPMI 1640 и 10 мл B27 дополнения минус инсулин.
- Для RPMI 1640/B27 (RB) среднего, смесь 500 мл RPMI 1640, 10 мл B27 дополнения, и 5 мл пенициллина-стрептомицина (пер-стреп), антибиотик.
- Для очистки среднего16, смешать 500 мл без глюкозы RPMI 1640, 10 мл B27 дополнения, 5 мл пера-стрептококк антибиотика, и 1000 л натрия DL-лактата раствора (при окончательной концентрации 4 мМ).
- Для нейтрализации раствора смешайте 200 мл RPMI 1640, 50 мл сыворотки плода (FBS), 2,5 мл антибиотика перстреп-стрептококка и 50 л Y-27632 (при конечной концентрации 10 мкм).
- Для замораживания среды, смешать 9 мл FBS, 1 мл диметилсульксида (DMSO), и 10 л Y-27632 (при окончательной концентрации 10 мкм).
- Для внеклеточного матричного раствора (EMS) оттепель концентрированная внеклеточная матрица(Таблица материалов 1) при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока она не достигнет равномерно согласованного жидкого состояния. Precool пипетки советы и трубки до принятия матрицы aliquots по 350 л каждый на льду, и хранить aliquots на -20 градусов по Цельсию. Перед покрытием пластинразите один оттаяв в 24 мл ледяной среды DMEM/F12 (EMS); держать EMS в 4 градусах Цельсия в течение 2 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги покрытия на льду, чтобы предотвратить затвердевание мембранной матрицы подвала. - Для раствора Tyrode, принять 90% от конечного необходимого объема воды культуры ткани, добавить соответствующее количество следующих реагентов, и перемешать до растворения. Затем используйте 1 N NaOH, чтобы настроить рН до 7,4. Добавьте дополнительную воду к конечной концентрации 140 ммоль/л хлорида натрия, 1 ммоль/л хлорида магния, 10 ммоль/L HEPES, 5 ммоль/л хлористого калия, 10 ммоль/л глюкозы и 1,8 ммоль/л хлорида кальция. Стерилизовать путем фильтрации, используя мембрану 0,22 мкм.
-
Покрытие плиты культуры клетки
- Для плит культуры hiPSC, принесите 1 mL EMS к каждому колодцу пластины 6-наилучшим образом и инкубировать плиту для по крайней мере 1 h на 37 c. Аспирируя раствор DMEM/F12 перед посевными клетками.
- Для желатина покрытие, растворить 0,2 г желатина порошок в ткани культуры класса воды, чтобы сделать 0,2% (w/v) раствор. Стерилизовать путем автоклавирования при 121 кв с, 15 пси в течение 30 мин. Пальто каждый из 6-колодец пластины с 2 мл раствора и инкубировать в течение 1 ч при 37 градусов по Цельсию. Перед прохождением клеток, аспирировать раствор и дайте пластине высохнуть, по крайней мере 1 ч при комнатной температуре внутри ткани культуры капота.
2. HiPSC обслуживание и КардиомиоцитНая Дифферициация
- Культура hiPSCs в среде hiPSC (см. шаг 1.1.1) с ежедневным средним изменением до тех пор пока клетки не достигнут 80%-90% слив в наилучшим образом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей технического обслуживания, hiPSCs, как правило, готовы к прохождению каждые 4 дня. - Для прохождения hiPSCs, аспирировать среду и мыть хорошо 1x с 1x фосфат-буфера сольник (PBS). Добавьте 0,5 мл раствора отслоения стволовых клеток(Таблица Материалов1) к каждой скважине и инкубировать при 37 градусах По 5–7 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от плотности клеток и скорости диссоциации, которую можно наблюдать под микроскопом. - Нейтрализуйте раствор отслоения стволовых клеток с 1 мл среды hiPSC, дополненной 5 МКм Y-27632. Соберите смесь в 15 мл центрифуги трубки. Centrifuge трубки в течение 5 минут при 200 х г, аспирируйте супернатант, не нарушая клеточной гранулы, а затем, resuspend клетки в 1 мл среды hiPSC, содержащей 5 мКМ Y-27632.
- Семя hiPSCs на новый EMS покрытием 6-колодная пластина в соотношении между 1:6 до 1:18. Измените среду на среду hiPSC без Y27632 после 24 ч.
- Чтобы заморозить клетки, повторно приостановить диссоциированные hiPSCs в замораживании среды в концентрации 0,5-1 млн/500 qL, поместите подвеску в криовиалы, и хранить их в морозильной камере -80 градусов. Перенесите замороженные флаконы в жидкий азот через 24 ч.
- Чтобы дифференцировать, замените среду hiPSC 2 мл RB-среднего, дополненного ингибитором 10 ММ ГСК-3 , CHIR99021 (CHIR) при 80%-90% клеточном слиянии. Замените среду 3 мл РБ-среды после 24 ч и инкубировать еще на 48 ч (день 3).
- На 3-й день измените средний до 3 мл RB-среды с ингибитором IWR1 10 мкм на 48 ч (день 5), а затем замените среду на 3 мл РБ-среды и сохраняйте 48 ч (день 7).
- На 7-й день замените среду на 3 мл носителя и измените среду каждые 3 дня в будущем. Спонтанное избиение hiPSC-CMs следует наблюдать между днями 7-10.
3. чистка hiPSC-CMs и предобработка малых молекул
ПРИМЕЧАНИЕ: Высокоочищенные, рекомбинантные клеточные диссоциационные ферменты(Таблица Материалов 1) были использованы для диссоциации hiPSC-CMs.
- На 21 день после дифференциации hiPSC-CM, аспирируй среду и промойте клетки 1x со стерильным PBS. Инкубировать клетки с 0,5 мл клеточных диссоциационных ферментов на скважину в течение 5-7 мин при 37 градусах Цельсия. Неоднократно pipette клеточной подвески с помощью 1 мл пипетки для того, чтобы тщательно разъединить клетки.
- После того, как клетки будут разобщены, добавьте 1 мл нейтрализующего раствора к каждой скважине, соберите клеточную смесь в центрифужную трубку 15 мл и центрифугу при 200 х г в течение 3 мин. Отбросьте супернатант и отбросите клетки в нейтрализации раствора.
- Пересадите клетки на 6-пуговую пластину с покрытием, с плотностью 2 миллиона клеток на скважину.
- После 24-48 ч замените культурную среду на очищаемую среду на 3-5 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка завершена, когда более 90% клеток в каждом поле обзора микроскопа бьются. Чтобы предотвратить дальнейшее повреждение кардиомиоцитов, не продлевайте срок очистки более чем на 5 дней. Если первый раунд не дает необходимой чистоты, замените среду очищения на среду РБЗ на 1 день, а затем завершите второй раунд очищения. - До трансплантации, культура клеток в группе лечения для 12 ч в СРЕДе РБЗ дополнили 10 МКм Y-27632. Аналогичным образом, выполнять верапамил лечения на клетках в среде РБЗ с 1 мкм верапамил для 12 ч (hiPSC-CMsЗВЕР).
- После лечения промойте hiPSC-CMs 1x с PBS и инкубировать клетки с 0,5 мл клеточных диссоциационных ферментов на скважину в течение максимум 2 мин. Неоднократно пипетка клеточной подвески, используя 1 мл пипетку, чтобы тщательно разъединить клетки. Нейтрализуйте клетки нейтрализующим раствором, соберите клеточную смесь в центрифужную трубку 15 мл и центрифугу при 200 х г в течение 3 мин. Перенапрягайте клетки в ПБС в концентрации 0,1 млн клеток/5 л в рамках подготовки к инъекциям.
4. Инфаркт миокарда и трансплантация клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты предварительно престерилизируется с автоклавом и поддерживаются в асептической состоянии во время нескольких операций через горячий стерилизатор из бисера(Таблица Материалов 2).
- Анестезия NOD/scid мышей (Таблица Материалов 2) с ингаляционным изофлюраном (1,5%-2%). Мониторинг уровня анестезии по реакции мышей на щепотку ног. Поместите ветеринар оптическую мазь на глаза, чтобы предотвратить их от высыхания во время операции.
- Поставка 0,1 мг/кг бупренорфин подкожно для управления болью до операции.
- Позиция и закрепите мышь в положении на спине на нагретом операционном столе, удалите волосы из области брюшной шеи и левой грудной клетки с помощью крема для депиляции, разоблачите кожу и дезинфицируют ее 70% алкоголя.
- Вырежьте 0,5 см разрез в центре шеи с помощью хирургических ножниц, отделить подкожный жир стерильными щипками, и разоблачить трахеи. Введите устно канюлю интубации в трахею, соедините канюлю с небольшим вентилятором животных и отрегулируйте настройки вентиляции (установите объем прилива на уровне 100–150 л и частоту дыхания в 100х-150x на мин).
- После того, как мышь стабилизируется, вырежьте 0,5 см разрез в середине левой кожи грудной клетки. Используйте щипцы, чтобы прямо отделить мышечный слой и сделать небольшой разрез в пятом межреберном пространстве, чтобы разоблачить грудную полость. Поместите втягивающий в разрез, чтобы открыть грудную полость и найти левую нисходящей коронарной артерии (LAD). Под рассекающим хирургическим микроскопом, ligate LAD с 8-0 неабсорбируемый шов.
- Сразу же после индукции MI, вводить 5 л hiPSC-CMs-RI, hiPSC-CMs,hiPSC-CMs-VER, hiPSC-CMsзВЕР, или равный объем PBS в миокард мыши на каждом участке (3 х 105 клеток / животных, 1 х 105 клетки/сайт), один в инфарктной области и два в районах вокруг инфаркта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Так как 5 ЗЛ очень небольшой объем, это не легко точно контролировать объем, непосредственно сосание его со шприцем. Крышка стерильной чашки Петри может быть перевернута, и 5 л клеток можно сначала оседать на крышке пипеткой. Из-за поверхностного натяжения он не будет распространяться, а конденсируется в небольшую жидкую массу. Это может быть легко всасывается и вводят в миокард мыши. - Устраните остаточный воздух в грудной полости, заполнив его теплым изотоническим сольственным раствором. Вышивать ребра, мышцы и кожу в последовательности с 6-0 поглощаемых шов. Выключите инъекцию изофларанской анестезии. Держите хирургии животных на грелке и внимательно наблюдать за ними, пока они находятся в полном сознании. Затем поместите животных в чистую клетку. Не возвращайте животных в компанию других животных до тех пор, пока они полностью не выздоровеют.
- После операции вводят мышам интраперитонеально бупренорфин (0,1 мг/кг) каждые 12 ч в течение 3 дней подряд и вводят им ибупрофен (5 мг/кг) каждые 12 ч в течение одного дня. Выполните последующие аналитические исследования в указанные временные точки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте вашим местным рекомендациям комитета по уходу за животными для обезболивающее.
5. Запись переходного и контрактного стыковки кальция
- Автоклав 15 мм-диаметр охватывает(Таблица материалов 2) и пинцет в небольшом стеклянном стакане при 121 кв.с. 15 пси в течение 15 мин. Precool крышки и пинцет при 4 c.
- Используя пинцет, поместите крышку в 12-ну хорошую пластину и пипетку 300 зл и внеклеточной матрицы на каждый coverslip.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте матрице превышать край крышки, чтобы предотвратить уменьшение количества матричного покрытия. Инкубировать 12-колодец пластины в 37 C кс культуры инкубатора для 1 ч. - Аспирировать среду в желатиновой покрытием 6-наилучшим пластины с очищенной hiPSC-CMs, мыть его 1x с PBS, а затем переварить его с 0,5 мл клеточной диссоциации ферментов в течение 1,5 мин. Добавить 1 мл нейтрализации раствора, пипетка неоднократно не более 5x-10x с 1 мЛ пипетка , и центрифуга смесь на 200 х г в течение 3 мин.
- Аспирируй покрытую внеклеточной матрицей из чехлов. Подсчитайте номер ячейки и повторно подтяните клетки в нейтрализуя растворе до концентрации 40,000/300 qL, а затем добавьте 300 кЛ суспензии клетки на каждый coverslip. Культура пластины в инкубаторе 37 градусов по Цельсию.
- После 24 ч, осторожно аспирировать нейтрализованный раствор, добавить 500 л среды РБЗ к каждой скважине пластины, и продолжать культуру в течение 2 дней.
- Добавьте Y-27632 (10 мкм), активатор Ро киназы (РА, 100 нМ), верапамил (1 мкм), или равный объем PBS в культурную среду hiPSC-CMs, 12 ч до обнаружения переходного кальция и сократимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к обнаружению преходящего и сократителимости кальция клеток после 12 ч химической обработки, обнаружение этих параметров было также протестировано на 12, 24, 48 и 72 ч после химического вывода. - Выньте пластины, отбросить среды, и мыть пластины 1x с PBS. Изменение среды на фенол-красный DMEM, содержащий 0,02% (w/v) сурфактантного полиола(Таблица Материалов 1), 5 МКм индикатор кальция (Таблица Материалов1), и соответствующий Y-27632 (10 мкм), РА (100 нм), верапамил (1 мкм), или равный объем PBS, и инкубировать пластину в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.
- Откажитесь от супернатанта, вымойте клетки 3x с красителем свободной DMEM среды, и пусть средний отдых в течение 30 минут, чтобы де-эстерифицировать картографический краситель.
- Поместите посеянный клеткой coverslip в открытую камеру ванны и вставьте камеру в систему микроинкубации, уравновешленную до 37 градусов по Цельсию с автоматическим контроллером температуры(Таблица Материалов2), наполнить его раствором Tyrode, и постоянно добавлять Ингибитор родообразной (RI), РА, или PBS к перфузионному раствору.
- Используйте перевернутый флуоресценционный микроскоп(Таблица Материалов 2) и лазерное сканирование головы (Таблица Материалов 2) для записи спонтанного кальция переходных с помощью X-t сканирование линии, используя 488 нм аргона лазер для возбуждения красителя и 515 и 10 нм барьерный фильтр для сбора света выбросов. Запись спонтанного сокращения hiPSC-CMs с использованием дифференциального интерференции Контрастная функциональность конфокального микроскопа (Таблица материалов 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Переходные записи кальция были обработаны и проанализированы с помощью программного обеспечения MATLAB R2016A(Таблица Материалов 4). Анализы изменения клеток были выполнены с помощью программного обеспечения ImageJ(Таблица Материалов 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HIPSC-CMs, используемые в этом исследовании, были получены из человеческого происхождения с геном репортера люциферазы; Таким образом, выживаемость пересаженных клеток in vivo была обнаружена с помощью биолюминесценционной визуализации (BLI)17 (рисунок 1A,B). Для гистологических секций сердца, человека конкретных сердечных тропонина T (hcTnT) и человека ядерного антигена (HNA) двойные положительные клетки были классифицированы как привитые hiPSC-CMs(Рисунок 1C). Оба результата показали, что предобработка Y-27632 значительно улучшила частоту прививов клеток. Активность люциферазы группы hiPSC-CMбыла увеличена примерно в шесть раз в 3, 7 и 28 дней после трансплантации, по сравнению с активностью группы hiPSC-CM (рисунок1B). Кроме того, выражение hcTnT/HNA увеличилось почти в семь раз в группе hiPSC-CM, по сравнению с тем, что в группе hiPSC-CM-RI (рисунок1C).
Результаты также показали, что Y-27632 предварительной обработки регулируется цитоскелет изменения в пересаженных клеток. В дни 7 и 28 трансплантации, hiPSC-CMsЗРИ выставлены большие и более определенные стержня формы цитоскелетной структуры по сравнению с hiPSC-CMs-RI (Рисунок 1D).
Кроме того, предобработка Y-27632 имеет потенциал для снижения пересаженного hiPSC-CM апоптоза in vivo. TuneL окрашивание показало, что количество TUNEL-положительных клеток было значительно сокращено в группе hiPSC-CMзРИ по сравнению с группой hiPSC-CM-RI на второй день после трансплантации ( Рисунок 1E).
Ингибирование ROCK способствовало адгезии пересаженных клеток и имело потенциал для дальнейшего увеличения удержания имплантированных клеток в административных участках. Западная поместье и иммуно-пятно сердечной ткани предположили, что предобработка Y-27632 реверсивно способствовала повышению экспрессии интегрина No1 и N-кадерин и уменьшила экспрессию фосфо-миозина световой цепи 2 (p-MLC2) (Рисунок 2A,B ).
Линия клеток мыши HL-1 была выбрана в качестве контрольного КМ для экспериментов по вложению клеток in vitro. Результаты показали, что Предобработка Y-27632 значительно увеличила присоединение hiPSC-CM по отношению к HL-1. Для дальнейшего подтверждения этих выводов, hiPSC-CMs зРИ были инкубированы с N-кадерин или истегрин No 1 нейтрализующих антитела в течение 1 ч, в результате чего исчезновение улучшенной сцепения видели ранее (Рисунок 2C).
По сравнению с группой hiPSC-CM-RI, контрактная сила в группе hiPSC-CMбыла снижена на 32%, а в группе hiPSC-CM(hiPSC-CMs, предварительно обработанных активатором ROCK, Таблица материалов1), она была увеличена на 42% ( Рисунок 3A). Между тем, по сравнению с группой hiPSC-CM-RI, пиковой переходной флуоресценции кальция (Пик ЗФ/Ф0) для группы hiPSC-CMбыла снижена на 41%, а преходящая продолжительность кальция (CaTD50) была снижена на 11% (рисунок 3B ,C). В отличие от этого, пик NoF/F0 для группы hiPSC-CMЗРА был увеличен на 48%, а CaTD50 был увеличен на 13% (рисунок3B, C).
Кроме того, предварительное лечение кардиомиоцитов СМ-27632 на 12 ч до трансплантации значительно снизило экспрессию цТНИ и цТНТ(рисунок 3D),оба из которых являются тропонин (Tn) подразделения, которые регулируют сокращение кардиомиоцитов.
Подобно Y-27632, преобработка верапамил (1 ММ, 12 ч) значительно увеличила скорость прививок hiPSC-CMs у индуцированных МИ мышей. Гипотеза была подтверждена путем наблюдения за повышенным сигналом люциферазы в анализе биолюминесценции(рисунок 4A) и увеличение числа hcTnT/HNA двойных положительных клеток в дни 7 и 28 после трансплантации клеток (Рисунок 4B).
Рисунок 1: Y-27632 предварительной обработки увеличилась скорость прививок hiPSC-CMs в сердцах мышей MI. (A) Стандартная кривая измерений BLI. (B) Люциферин сигнала в NOD / научно-мышей, обработанных PBS, hiPSC-CMs-или hiPSC-CMsЗРИ в дни 3, 7 и 28 после операции. n - 6-9 мышей на группу. -П Злт; 0,05 против PBS; В P Злт; 0,05 против hiPSC-CMs-RI . (C) Иммуностогирование секций сердца для hcTnT и HNA. Шкала баров - 100 мкм (10x изображений); 20 мкм (40x изображений). n 5 мышей на группу. -П Злт; 0,05 против hiPSC-CMs-RI. (D) Представитель изображения сердечных секций окрашенных фаллоидина и hcTnT. Шкала бар No 20 мкм. n 5 мышей на группу. -П Злт; 0,05 против hiPSC-CMs-RI. (E) Представитель изображения сердца разделов для tuneL окрашивания. Шкала бар No 20 мкм. н 4-6 мышей на группу. -П Злт; 0,05 против hiPSC-CMs-RI. Эта цифра была изменена из Чжао и др.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Y-27632 усилил сцепление hiPSC-CMs, поддерживая экспрессию белков сцепноза. (A и B) Западный анализ поблужки выражения интегрина No1, N-кадерин, и фосфорилирование MLC2 (p-MLC2) в hiPSC-CMs, обработанных с RI и в необработанных hiPSC-CMs. n no 5 репликирует в группу. (C) hcTnT иммунофлуоресценции окрашивания анализа -RI и RI hiPSC-CMs с и без предварительной обработки анти-N-cad (N-Cad) и анти-инегерин No 1 (Integ) антител. Шкала баров - 100 мкм. В P Злт; 0,05 против hiPSC-CMsЗРИ. Эта цифра была изменена из Чжао и др.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Предварительная обработка Y-27632 снизила сократимость hiPSC-CMs и снизила регулирование выражения сердечных субъединиц тропонина. (A) Количественная оценка процентной доли сокращения HIPSC-CMs подвергаются лечению RI и РА. -П Злт; 0,05 против hiPSC-CMs-RI; В P Злт; 0,05 против hiPSC-CMsЗРИ. (B и C) Репрезентативные изображения и количественные измерения переходных измерений кальция hiPSC-CMs, обработанных с RI и RA и необработанной группы. -П Злт; 0,05 против hiPSC-CMs-RI; В P Злт; 0,05 против hiPSC-CMsЗРИ. (D) Западный анализ подлицания сердечных субъединиц тропонина (cTnC, cTnT, и cTnI) в hiPSC-CMs, обработанных с RI и RA и в необработанной группе. Эта цифра была изменена из Чжао и др.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Verapamil предварительной обработки улучшилась скорость прививок hiPSC-CMs у MI мышей. (A) Люциферин сигнала в NOD / научно-мышей, обработанных PBS, hiPSC-CMs-VER, или hiPSC-CMsзВЕР в дни 3, 7 и 28 после операции. n 8 мышей на группу. -П Злт; 0,05 против PBS; В P Злт; 0,05 против hiPSC-CMs-VER. (B) Иммуностогирование секций сердца для hcTnT и HNA. Для 10x изображений, шкала баров 100 мкм (10x изображений); 20 мкм (40x изображений). n 5 мышей на группу. -П Злт; 0,05 против hiPSC-CMs-VER. Эта цифра была изменена из Чжао и др.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ключевыми шагами этого исследования являются получение чистого hiPSC-CMs, повышение активности hiPSC-CMs через предварительное лечение Y-27632 и, наконец, пересадка точного количества hiPSC-CMs в модель мыши MI.
Ключевые вопросы, которые были рассмотрены здесь, были в том, что, во-первых, мы оптимизировали методы очистки, свободные от глюкозы19, и создали новую эффективную систему очистки. Система процедуры включала применение клеточных диссоциационных ферментов, пересадку клеток в пластинах с покрытием желатина, культивирование клеток в среде нейтрализации в течение 24 ч после переплатывания и минимизацию времени пищеварения клеток до трансплантации, все из которых были выполнены для достижения наивысшей активности клеток при получении чистых кардиомиоцитов.
Во-вторых, мы подробно остановились на предварительной обработке hiPSC-CMs с Y-27632 на 12 ч до инъекции клетки. Anoikis, как правило, индуцированных модификации клеток адгезионныхбелков, таких как integrins 4,20 и N-cadherin21, которые приводят к активации апоптотический путь. Мы продемонстрировали, что предобработка Y-27632 может способствовать привязке hiPSC-CMs к месту трансплантации путем поддержания экспрессии интегрина No1 и N-кадерин, подавляя выражение p-MLC2, что связано с изменениями в цитоскелете архитектура22,23. Через семь дней после трансплантации hiPSC-CM, hiPSC-CMs зРИ привело к большей области прививок клеток, более тонкой определенной формы стержня, и более полной цитоскелетной организации по сравнению с hiPSC-CMs-RI (Рисунок1B-D).
В-третьих, мы создали новую систему внутриклеточного впрыска в моделях мыши MI, с 5 ЗЛ на точку инъекции, чтобы точно вводить необходимое количество клеток, избегая при этом снижения выживаемости мыши из-за чрезмерного объема инъекций.
В-четвертых, мы подробно остановились на том, как определить изменения в сокращении клеток и кальция переходных в hiPSC-CMs после предварительной обработки с RI или РА. Мы обнаружили, что Y-27632 может обратимо уменьшить сократимость клеток и переходный кальций. Гипотеза здесь заключается в том, что из-за более низких энергетических потребностей пересаженных клеток, скорость прививок увеличилась. Аналогичные эффекты могут быть достигнуты с помощью ингибитора кальциевых каналов верапамил. Предлагаемый механизм, приводящий к торможению контрактности, заключается в том, что Y-27632 уменьшает экспрессию субъединиц тропонина cTnT и cTnI в hiPSC-CMs.
Основное ограничение заключается в том, что Y-27632 играл лишь преходящую роль во время трансплантации. Как ингибировать Ро киназы в течение более длительного периода, тем самым дальнейшее повышение эффективности трансплантации hiPSC-CMs, является проблемой, которая должна быть решена в будущем. Что касается большего применения этого метода, ингибитор ROCK может не только улучшить активность кардиомиоцитов во время трансплантации, но и повысить активность других клеток; поэтому он также может быть использован во время предварительного лечения в процессах трансплантации других клеток. Кроме того, представленный здесь подход закладывает хорошую экспериментальную основу для проведения дополнительных исследований в области сердечных заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят д-ра Джозефа К. Ву (Стэнфордский университет) за любезное предоставление конструкции Fluc-GFP и д-ра Янвена Лю за отличную техническую помощь. Это исследование поддерживается Национальными институтами здравоохранения RO1 грантов HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (до J. З.), и HL121206A1 (в Л.З.), и R56 грант 16SDG30410018, и Университет Алабамы в Бирмингеме факультета развития Грант (до В.З.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| ImageJ | NIH | 1.52g |
References
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
