Summary
בפרוטוקול זה, אנו להפגין ולפרט כיצד להשתמש בתאי גזע המושרה האדם pluripotent לבידול וטיהור, ועוד, על איך לשפר את היעילות השתלת שלה עם Rho-הקשורים החלבון קינאז מעכבי טיפול מקדים במודל אוטם שריר הלב של העכבר.
Abstract
גורם מכריע בשיפור האפקטיביות של הטיפול הסלולארי להתחדשות שריר הלב היא להגדיל בביטחה וביעילות את שיעור התיאום בין התאים. Y-27632 הוא מעכב חזק מאוד של Rho-הקשורים, סליל המכיל חלבון קינאז (RhoA/רוק) והוא משמש כדי למנוע אפופטוזיס המושרה תא (anoikis). אנו מדגימים כי Y-27632 מראש עבור האדם המושרה הנגרמת לתאי גזע שמקורם בגוף (היפנוטית-CMs+ RI) לפני תוצאות השרשה תא שיפור שיעור השיפור במודל העכבר של אוטם שריר הלב חריפה (MI). כאן, אנו מתארים הליך מלא של בידול היפנוסי-CMs, טיהור, תא טיפול מקדים עם Y-27632, כמו גם את התכווצות התאים המתקבל, מדידות חולף סידן, ו השתלת לתוך מודלים MI של העכבר. השיטה המוצעת מספקת שיטה פשוטה, בטוחה, אפקטיבית ובעלות נמוכה אשר מגדילה באופן משמעותי את קצב התיאום בין התאים. שיטה זו לא ניתן להשתמש רק בשילוב עם שיטות אחרות כדי לשפר עוד יותר את יעילות השתלת התא, אך גם מספק בסיס נוח לחקר המנגנונים של מחלות לב אחרות.
Introduction
תאי גזע מבוססי טיפולים הראו פוטנציאל ניכר כטיפול בנזקי לב שנגרמו על ידי MI1. השימוש הבדיל hiPSCs מספק מקור בלתי נדלה של היפנואס-CMs2 ופותח את הדלת להתפתחות מהירה של טיפולים פריצת דרך. עם זאת, נותרו מגבלות רבות לתרגום תרפויטי, כולל האתגר של השיעור הנמוך החמור ביותר של תאים מושתלים.
הנתק תאים עם טריפסין יוזם anoikis3, אשר מואצת רק פעם אחת תאים אלה מוזרק לסביבות קשות כמו שריר הלב, שם הסביבה ארוי מאיצה את הקורס לקראת מוות התאים. מבין התאים הנותרים, מדובר בפרופורציה גדולה החוצה מאתר ההשתלה למחזור הדם ומתפשט ברחבי הפריפריה. אחד המסלולים מפתח השבץ הוא מסלול RhoA/סלע4. בהתבסס על המחקר הקודם, מסלול rhoa/סלע מווסת את ארגון אקטין השלד של הגוף5,6, אשר אחראי על תפקוד התאים7,8. הסלע מעכב Y-27632 נמצא בשימוש נרחב במהלך הדיסוציאציה של תאי גזע ומלא, כדי להגדיל את הדבקה התא ולהפחית אפופטוזיס תא9,10,11. במחקר זה, Y-27632 משמש לטיפול היפרsc-CMs לפני השתלת בניסיון להגדיל את שיעור התא המקביל.
מספר שיטות שמטרתן לשפר את שיעור התיאום בין התאים, כגון שוק חום וציפוי מטריצות ממברדת מרתפים12, הוקמו. מלבד שיטות אלה, טכנולוגיה גנטית יכולה גם לקדם את התפשטות הקרדיוציט13 או תאים שאינם שריר הלב לתוך הקרדיוציטים14. מנקודת המבט הביולוגית, הקרדיוציטים. מתשתלת בתוך ביופיגום כדי לשפר את יעילות ההשתלה15 למרבה הצער, רוב השיטות האלה הן מסובכות ויקרות. להיפך, השיטה המוצעת כאן היא פשוטה, חסכונית ויעילה, והיא יכולה לשמש כטיפול בסיס לפני ההשתלה, כמו גם בקוניוגציה עם טכנולוגיות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים הוועדה השתמש (IACUC) של אוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם התבססו על המכון הלאומי של מעבדת בריאות טיפול בעלי חיים והנחיות להשתמש (NIH פרסום לא 85-23).
1. הכנת לוחות תרבות ומדיה ותרבות
-
הכנה בינונית
- עבור היפנוטית בינונית, לערבב 400 mL של תא גזע האדם pluriפוטנטי (hPSC) בינונית (טבלת חומרים 1) ו 100 mL של תוספת hpsc 5x; מאחסנים את התערובת ב -4 ° c.
- עבור RPMI-B27 מינוס (RB-) בינונית, מערבבים 500 mL של RPMI 1640 ו 10 מ ל של תוספת של B27 מינוס אינסולין.
- עבור RPMI B27 (RB +) בינונית, לערבב 500 mL של RPMI 1640, 10 מ ל של B27 תוספת, ו 5 מ ל של פניצילין-סטרפטומיצין (עט-דלקת) אנטיביוטי.
- עבור טיהור בינוני16, Mix 500 ml של no-גלוקוז RPMI 1640, 10 מ ל של B27 תוספת, 5 מ ל של עט-דלקת אנטיביוטי, ו 1,000 μl של נתרן DL-לקטט פתרון (בריכוז הסופי של 4 מ"מ).
- לנטרול הפתרון, לערבב 200 mL של RPMI 1640, 50 mL של סרום של שור עוברי (FBS), 2.5 mL של עט-דלקת אנטיביוטי, ו-50 μL של Y-27632 (בריכוז הסופי של 10 μM).
- עבור הקפאה בינונית, מערבבים 9 מ ל של FBS, 1 מ ל diמתיל סולפוקסיד (DMSO), ו 10 μL של Y-27632 (בריכוז הסופי של 10 μM).
- עבור פתרון מטריצה מוצר (EMS), הפשרת מטריצה מרוכזת (טבלת חומרים 1) ב-4 ° c עד שהגיעה למצב נוזלי אחיד ועקבי. לפני הפיכת מטריצה מלאה לטיפים וצינורות לפני ביצוע ali, מטריקס של 350 μL כל אחד על הקרח, ולאחסן את הליבטים ב-20 ° c. לפני ציפוי הצלחות, לדלל אחד המהול לתוך 24 מ ל של מדיום הקרח קר/F12 (EMS); לשמור את ה-EMS ב-4 ° צ' למשך עד 2 שבועות.
הערה: לבצע את כל הצעדים ציפוי על קרח כדי למנוע מטריצות קרום המרתף מיצוק. - עבור הפתרון של Tyrode, לקחת 90% של הנפח הנדרש הסופי של התרבות רקמה מים כיתה, להוסיף את הכמות המתאימה של הריאגנטים הבאים, ומערבבים עד התפרקה. לאחר מכן, השתמש ב 1 N NaOH כדי לכוונן את ה-pH ל 7.4. הוסיפו מים נוספים לריכוז הסופי של 140 מ מול/L נתרן כלוריד, 1 ממול/מגנזיום כלוריד, 10 מ מול/L HEPES, 5 ממול/l אשלגן כלוריד, 10 ממול/L גלוקוז, ו 1.8 mmol/L סידן כלוריד. לחטא על ידי סינון, באמצעות קרום מ0.22 יקרומטר.
-
ציפוי לוחית של תרבית תאים
- עבור לוחות התרבות היפנוסי, להחיל 1 מ ל של EMS לכל באר של 6-היטב צלחת ו מודקת את הצלחת עבור לפחות 1 h ב 37 ° c. לפני זריעת התאים, הפתרון המאביק/F12.
- עבור ציפוי ג'לטין, לפזר 0.2 גרם של אבקת ג'לטין בתוך התרבות רקמה מים כיתה לעשות 0.2% (w/v) פתרון. לעקר על ידי אוטוקלינג ב 121 ° c, 15 psi עבור 30 דקות. מעיל כל טוב של 6-היטב צלחת עם 2 מ ל של הפתרון ואת המדגירה עבור 1 h ב 37 ° c. לפני שאתם מפנים את התאים, מייבשים את התמיסה ומאפשרים לצלחת להתייבש לפחות 1 h בטמפרטורת החדר בתוך כיסוי התרבות של הרקמה.
2. תחזוקת ההיסק והקרדיוציט דבידול
- תרבות the hiPSCs ב היפנוסק בינונית (ראה שלב 1.1.1) עם שינוי בינוני יומי עד התאים מגיעים 80% – 90% המפגש בכל טוב.
הערה: לצורכי תחזוקה, hiPSCs מוכנים בדרך כלל למעבר כל 4 ימים. - כדי מעבר hiPSCs, מחית את המדיום ולשטוף את הבאר 1x עם תמיסת מלח 1 x פוספט מאגור (PBS). הוסף 0.5 מ ל של פתרון התנתקות תא גזע (טבלה של חומרים 1) על כל היטב והדגירה ב 37 ° צ' עבור 5 – 7 דקות.
הערה: זמן הדגירה תלוי בצפיפות של התאים ושיעור הדיסוציאציה, אשר ניתן להבחין תחת מיקרוסקופ. - לנטרל את הפתרון התנתקות תא גזע עם 1 מ ל של בינוני היפנואס בתוספת עם 5 μM Y-27632. לאסוף את התערובת בשפופרת צנטריפוגה 15 מ ל. צנטריפוגה את הצינור עבור 5 דקות ב 200 x g, ומכה את supernatant מבלי להפריע את הגלולה התא, ולאחר מכן, להשעות מחדש את התאים ב 1 מ ל של בינוני היפנוטית המכיל 5 Μm Y-27632.
- הזרע את hiPSCs על צלחת חדש מצופה EMS 6-באר ביחס בין 1:6 ל 1:18. לשנות את המדיום כדי היפנוsc בינונית בלי Y27632 אחרי 24 שעות.
- כדי להקפיא את התאים, השהה מחדש את hiPSCs המונתק להקפאה בינונית בריכוז של 0.5 – 1 מיליון/500 μL, מניחים את ההשעיה בקריובקבוקונים, ומאחסנים אותם במקפיא של 80 ° c. העבירו את הבקבוקונים הקפואים. לחנקן נוזלי אחרי 24 שעות
- כדי להבדיל, להחליף את בינונית היפנוsc עם 2 מ ל של RB-בינוני בתוספת 10 μM GSK-3β מעכב CHIR99021 (CHIR) ב 80% – 90% תא הזרימה. החלף את המדיום עם 3 מ ל של RB-בינוני לאחר 24 h ו-דגירה 48 h נוספים (יום 3).
- ביום 3, לשנות את המדיום ל 3 מ ל של RB-בינוני עם 10 μM Wnt מעכבי IWR1 עבור 48 h (יום 5), ולאחר מכן להחליף את המדיום עם 3 מ ל של RB-בינוני ולתחזק עבור 48 h (יום 7).
- ביום 7, להחליף את המדיום עם 3 מ ל של מדיום RB ולשנות את המדיום כל 3 ימים הולך קדימה. יש להקפיד על הכאה ספונטנית של היפראס-CMs בין הימים 7 – 10.
3. טיהור היפנוסי-CMs ומולקולה קטנה טרום טיפול
הערה: מטוהרים מאוד, רקומביננטי תא-לדיסוציאציה אנזימים (טבלה של חומרים 1) שימשו כדי לנתק היפראס-CMs.
- ביום 21 לאחר הבידול בהיסק-ס, מטפי את המדיום ושוטף את התאים 1x עם ה-PBS הסטרילי. דגירה את התאים עם 0.5 mL של אנזימים תא-דיסוציאציה לכל טוב עבור 5 – 7 דקות ב 37 ° c. פיפטה שוב ושוב את ההשעיה של התא באמצעות פיפטה 1 mL כדי לנתק ביסודיות את התאים.
- לאחר התאים אינם מתאימים, להוסיף 1 mL של הפתרון לנטרל כל טוב, לאסוף את התערובת התא לתוך 15 מ ל צנטריפוגה שפופרת ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 3 דקות. להיפטר supernatant ולהשעות את התאים בנטרול הפתרון.
- לשתול מחדש את התאים על מצופה ג'לטין 6-צלחות בצפיפות של 2,000,000 תאים לכל טוב.
- לאחר 24 – 48 h, החליפו את מדיום התרבות באמצעי הטיהור במשך 3 – 5 ימים.
הערה: טיהור מושלם כאשר יותר מ 90% של התאים בכל שדה להציג מיקרוסקופ מכים. כדי למנוע נזק נוסף לקרדיוציטים, אל תרחיב את משך הטיהור מעבר ל -5 ימים. אם הסיבוב הראשון לא להניב את הטוהר הדרוש, להחליף את מדיום טיהור עם RB + מדיום ליום אחד, ולאחר מכן להשלים סיבוב נוסף של טיהור. - לפני השתלת, תרבות התאים בקבוצת הטיפול עבור 12 h ב RB + בינוני בתוספת עם 10 μM Y-27632. באופן דומה, לבצע הטיפול verapamil על התאים של RB + בינוני עם 1 μM verapamil עבור 12 h (היפנוsc-CMs+ VER).
- לאחר הטיפול, לשטוף את היפנוsc-CMs 1x עם PBS ו-דגירה את התאים עם 0.5 mL של אנזימים תא-דיסוציאציה לכל טוב עבור מקסימום של 2 דקות. פיפטה שוב ושוב את השעיית התא, תוך שימוש בפיפטה מ-mL 1, כדי לנתק ביסודיות את התאים. לנטרל את התאים עם הפתרון נטרול, לאסוף את התערובת של התא 15 מ"ל שפופרת צנטריפוגה, ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 3 דקות. השהה את התאים ב-PBS בריכוז של 100,000 תאים/5 μl בהכנה להזרקה.
4. אוטם שריר הלב ואת השתלת התא
הערה: כל המכשירים כירורגי הם טרום עיקור עם אוטוקלב ונשמרים במצב אספטי במהלך ניתוחים מרובים באמצעות מעקר חרוז חם (טבלת חומרים 2).
- הנהון בראש/מזהה עכברים (טבלת חומרים 2) עם השאיפה isofלוריאן (1.5% – 2%). לעקוב אחר רמות ההרדמה על ידי תגובות העכברים על צביטה בבוהן. משחה אופטית לבית וטרינר על העיניים כדי למנוע מהם ייבוש במהלך הניתוח.
- לספק 0.1 mg/kg בופרנורפין תת-עורי עבור ניהול כאב לפני הניתוח.
- מיקום ולאבטח את העכבר במיקום פרקדן על שולחן הפעלה מחומם, להסיר את השיער מאזור הצוואר הגחוני ואת בית החזה השמאלי באמצעות קרם דפילציה לחשוף את העור, ולחטא אותו עם 70% אלכוהול.
- חותכים חתך 0.5 ס מ במרכז הצוואר באמצעות מספריים כירורגיים, להפריד את השומן התת עורי עם מלקחיים סטרילית, ולחשוף את קנה הנשימה. הציגו דרך הפה את צינורית הצנרור לתוך קנה הנשימה, חברו את הצינורית למכונת הנשמה בעלי חיים קטנים, והתאימו את הגדרות האוורור (קבעו את נפח הגאות ב-100 – 150 μL וקצב הנשימה ב-100x – 150x לדקה).
- לאחר העכבר מייצב, לחתוך 0.5 ס מ חתך באמצע העור בחזה השמאלי. השתמש מלקחיים כדי במיומנות להפריד את שכבת השריר ולעשות חתך קטן בחלל האינטרקוסטל החמישי כדי לחשוף את חלל החזה. הניחו את המפסק בחתך כדי לפתוח את חלל בית החזה ולאתר את עורק העורקים השמאלי יורד (LAD). , תחת ניתוח של מיקרוסקופ כירורגי. לישער את הנער עם מ8-0 תפר שאינו נספג.
- מיד לאחר אינדוקציה MI, להזריק 5 μL של היפנוsc-CMs-RI, היפנוsc-Cms+ RI, היפנוsc-cms-ver, היסק-cms+ ver, או כמות שווה של PBS לתוך שריר הלב של העכבר על כל אתר (3 x 105 תאים/בעלי חיים, 1 x 105 תאים/אתר), אחד באזור הסיכונים ושניים באזורים שמסביב לסיכונים.
הערה: מאז 5 μL הוא נפח קטן מאוד, לא קל לשלוט באופן מדויק על העוצמה על ידי מציצת אותו ישירות עם מזרק. המכסה של צלחת פטרי סטרילי יכול להיות מתהפך, ו 5 μL של התאים ניתן להפקיד תחילה על המכסה עם פיפטה. בשל המתח פני השטח, הוא לא יתפשט אלא יכווץ למסה נוזלית קטנה. זה יכול להיות נספג בקלות ומוזרק לתוך שריר הלב של העכבר. - לחסל אוויר שיורית בחלל החזה על ידי מילוי אותו עם תמיסת מלח איזוטוניק חם. לתפור את הצלעות, השרירים והעור ברצף עם תפר הנספג 6-0. . תכבה את הזריקה של ההרדמה שמרו על הניתוח בעלי חיים על כרית החימום והתבוננו בהם באופן הדוק בזמן שהם ממלאים את התודעה המלאה. ואז, מניחים את החיות. בכלוב נקי אל תחזיר את החיות לחברתם של בעלי חיים אחרים עד שהם החלימו לחלוטין.
- לאחר הניתוח, להזריק את העכברים intraperitoneally עם בופרנורפין (0.1 mg/ק"ג) כל 12 h עבור 3 ימים רצופים ולהזריק להם איבופרופן (5 מ"ג/ק"ג) כל 12 h ליום אחד. בצע לימודי ניתוח עוקבות בנקודות זמן שצוינו.
הערה: עקוב אחר ההנחיות המקומיות שלך. לטיפול בחיות משככי כאבים
5. הקלטה ארעית של סידן
- אוטוקלבים בקוטר 15 מ"מ (טבלת חומרים 2) ומלקחיים בגביע זכוכית קטן ב-121 ° c, 15 psi עבור 15 דקות. לצנן את הכיסויים ואת הפינצטה ב 4 ° c.
- באמצעות הפינצטה, למקם את הכיסויים לתוך צלחת 12-היטב ו פיפטה 300 μL של מטריצה המגלותיים על כל שמיכות.
הערה: אין להניח למטריצה לחרוג משולי הכיסויים כדי למנוע צמצום כמות הציפוי של המטריצה. מודקת את הצלחת 12-באר באינקובטור 37 התרבות תאים צלזיוס עבור 1 h. - מנושף את המדיום בצלחת 6-באר מצופה ג'לטין עם מטוהרים היפנוסי-CMs, לשטוף אותו 1x עם PBS, ולאחר מכן לעכל את זה עם 0.5 mL של אנזימים תא-דיסוציאציה עבור 1.5 min. Add 1 מ ל של נטרול הפתרון, פיפטה שוב ושוב עבור לא יותר מ 5x – 10x עם פיפטה 1 מ , ו צנטריפוגה את התערובת ב 200 x g עבור 3 דקות.
- מנושף את מטריצת החילוץ. המצופה מהכיסויים לספור את מספר התא ולהשעות מחדש את התאים בפתרון נטרול לריכוז של 40000/300 μL, ולאחר מכן להוסיף 300 μL של התא ההשעיה על כל שמיכות. תרבות הצלחת בחממה 37 ° c.
- לאחר 24 שעות, בעדינות לבשל את הפתרון המנוטרל, להוסיף 500 μL של RB + מדיום כל טוב של הצלחת, ולהמשיך לתרבות במשך יומיים.
- הוסף Y-27632 (10 μM), רו קינאז activator (RA, 100 nM), verapamil (1 μM), או נפח שווה של PBS לתוך מדיום התרבות של היפנוסי-CMs, 12 h לפני גילוי סידן ארעי וכולקטיסטי.
הערה: בנוסף לזיהוי של התאים הזמניים הסידן וכלה לאחר 12 h של טיפול כימי, הזיהוי של פרמטרים אלה נבדק גם ב 12, 24, 48, ו 72 h לאחר הנסיגה הכימית. - להוציא את הצלחת, למחוק את המדיום, ולשטוף את צלחת 1x עם PBS. לשנות את המדיום ל-חומצה פנול-אדום-חינם המכיל 0.02% (w/v) של הסורפסטנט polyol (הטבלה של חומרים 1), 5 μm סידן אינדיקטור (טבלת חומרים 1), ו-Y-27632 המקביל (10 μm), RA (100 nM), verapamil (1 μm), או נפח ש של ה-PBS, ומודקת את הצלחת 30 דקות ב 37 ° c.
- להיפטר supernatant, לשטוף את התאים 3x עם מדיום DMEM ללא צבע, ולתת את השאר בינונית עבור 30 דקות כדי de-esterify לצבוע את המיפוי.
- מניחים את התא הזרוע שמיכות בחדר אמבטיה פתוח ולהכניס את החדר לתוך מערכת מיקרודגירה השווה 37 ° c עם בקר טמפרטורה אוטומטי (טבלת חומרים 2), מבשם זה עם הפתרון של tyrode, וברציפות להוסיף מעכבי רו קינאז (RI), RA, או PBS לפתרון הפרזיה.
- השתמש מיקרוסקופ הפוכה הפוך (הטבלה של חומרים 2) ואת ראש סריקת לייזר (הטבלה של חומרים 2) כדי להקליט את זמני הסידן הספונטנית על ידי שימוש סריקה x-t קו, באמצעות 488 ננומטר לייזר של ארגון לצביעת עירור ו 515 ± 10 ננומטר מסנן מחסום כדי לאסוף אור פליטה. הקלט את הכיווץ הספונטני של היפרsc-CMs באמצעות הפונקציונליות של ניגוד הפרעות דיפרנציאלי של מיקרוסקופ הקונמוקד (טבלת חומרים 2).
הערה: הקלטות זמניות של סידן עובדו ונותחו באמצעות תוכנת MATLAB R2016A (טבלת חומרים 4). שינוי התכווצות התא מבוצע באמצעות תוכנת ImageJ (טבלת חומרים 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההיסק-CMs המשמש במחקר זה נגזר ממוצא אנושי עם גן כתבת לוציפראז; לכן, שיעור ההישרדות של התאים המושתלים ב vivo זוהה על ידי הדמיה biלומינסנציה (בלי)17 (איור 1a, B). עבור מקטעי לב היסטלוגיים, לבבות בעלי מערכת לב בעלי מטרה מסוימת (מימן) ואנטיגן גרעיני אנושי (חנה) התאים כפולים ומסווגים הוגדרו כ-"היפראס-CMs" (איור 1C). שתי התוצאות מצביעות על כך שטיפול מקדים של Y-27632 השתפר באופן משמעותי בקצב התיאום בין התאים. הפעילות לוציפראז של הקבוצה היפנוסי ס+ RI הוגדלה בערך sixfold בימים 3, 7, ו -28 לאחר ההשתלה, לעומת זה של קבוצת ההיסק-cm-RI (איור 1b). יתר על כן, הביטוי הבאקtnt/חנה מעלה קרוב ל-שבעה בקבוצת היפנוסק-ס+ RI , ביחס לזה בקבוצת ההיסק-ס-רי (איור 1c).
התוצאות הצביעו גם כי Y-27632 הטיפול pretreatment שלד מוסדר שינויים בתאים מושתלים. בימים 7 ו 28 של השתלת, היפנוsc-CMs+ RI הציגה מבנה גדול יותר ומוגדר מוט השלד בצורת, לעומת היפנוsc-CMs-RI (איור 1d).
יתר על כן, Y-27632 pretreatment טיפול יש את הפוטנציאל להפחית המוvivo המושתלים-ס מ אפופטוזיס ב. כתמים TUNEL הראה כי מספר התאים TUNEL-חיוביים ירד באופן משמעותי בקבוצה היפנוסי ס+ RI ביחס לזה בקבוצה היפנוסי ס-רי ביום 2 לאחר ההשתלה (איור 1e).
עיכוב סלע קידם את הדבקה של תאים מושתלים והיה לו את הפוטנציאל להגדיל עוד יותר את השמירה של תאים מושתלים באתרי המינהל. כתמים מערביים ברקמה החיסונית של רקמת הלב הציע Y-27632 הטיפול pretreatment הפיך לקדם את הביטוי המוגבר של אינטגרציה ב ו-N-קדהרין וירד הביטוי של פוספהו-רירן שרשרת אור 2 (p-MLC2) (איור 2A, B ).
שורת תא העכבר HL-1 נבחרה כ-CMs הבקרה עבור ניסויים במערכת הקבצים המצורפים לתא מבחנה. התוצאות הראו כי Y-27632 הטיפול הקדם גדל באופן משמעותי הדבקות היפנוsc-CM ביחס ל-HL-1. כדי לאשר עוד ממצאים אלה, היפנואס-CMs+ RI היו מודלים עם N-קדהרין או אינטגרציה β1 נטרול הנוגדן 1 h, וכתוצאה מכך היעלמות הדבקה משופרת ראה בעבר (איור 2c).
לעומת הקבוצה היפנוסי ס-רי , כוח הקונקטילה בקבוצת היפנוסק-ס+ ri הופחת ב-32%, ובקבוצת ההיסק-ס+ RA (היפרסי-CMs שטופלו בactivator רוק, שולחן חומרים 1), הוגדלה על-ידי 42% ( איור 3A). בינתיים, לעומת הקבוצה היפנוסי ס-רי , שיא סידן פלואורסצנטית חולף (שיא ΔF/F0) עבור הקבוצה היפנוסי ס+ RI הופחת על ידי 41%, ואת המשך חולף הסידן (CaTD50) הופחת 11% (איור 3b , ג). לעומת זאת, שיא ΔF/F0 עבור קבוצת היפנואס ס+ RA הוגדלה על-ידי 48%, ו CaTD50 הוגדלה על-ידי 13% (איור 3b, C).
בנוסף, טיפול טרום הקרדיוציטים עם Y-27632 עבור 12 h לפני ההשתלה הקטינה באופן משמעותי את הביטוי של ctni ו ctnt (איור 3d), שניהם הם טרופונין (Tn) תת יחידות המווסת את התכווצות הקרדיוציט.
בדומה Y-27632, טיפול מקדים (1 μM, 12 h) הגדיל באופן משמעותי את שיעור החרט של היפנוsc-CMs בעכברים MI המושרה. ההשערה אושרה באמצעות התבוננות של אות לוציה מוגברת בשיטת הביולומינסנציה (איור 4A) והגדלת המספר של תאים כפולים חיוביים ליום 7 ו -28 לאחר השתלת תא (איור 4a).
איור 1: Y-27632 הטיפול הקדם הגדיל את שיעור החרט של היפנוsc-CMs בליבם של עכברים MI. (A) העקומה הסטנדרטית של מדידות בלי. (ב) לוציב האות ב הנהון/scid עכברים שטופלו PBS, היפראס-cms-RI, או היפנוsc-cms+ RI בימים 3, 7, ו 28 לאחר הניתוח. n = 6-9 עכברים לכל קבוצה. *P < 0.05 לעומת PBS; מיכל שלמה P < 0.05 לעומת היפנוסק-CMs-רי. (ג) חיסוני של מקטעי לב עבור הימן וחנה. קנה מידה ברים = 100 יקרומטר (תמונות 10x); 20 יקרומטר (תמונות 40x). n = 5 עכברים לכל קבוצה. *P < 0.05 לעומת היפנוsc-CMs-RI. (ד) דמויות מייצגות של קטעי לב מוכתמים בפאלודין ובכצ. סרגל קנה מידה = 20 μm. n = 5 עכברים לכל קבוצה. *P < 0.05 לעומת היפנוsc-CMs-RI. (ה) דמויות מייצגות של מקטעי לב לצביעת ה-tunel. סרגל קנה מידה = 20 μm. n = 4-6 עכברים לכל קבוצה. *P < 0.05 לעומת היפנוsc-CMs-RI. דמות זו שונתה מ-ז'או ואח '18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: Y-27632 משופר הדבקה של היפנוsc-CMs על ידי שמירה על הביטוי של חלבונים הדבקה. (A ו- B) ניתוח אבן הכתם המערבי של הביטוי של אינטאין, N-קדהרין, ו זרחון של MLC2 (p-MLC2) ב היפראס-CMS שטופלו עם RI ו-היפנוsc-cms לא מטופלים. N = 5 משכפל לכל קבוצה. (ג) מימן אימונו, מכתים את האנליזה של-ri ו + Ri-CMs עם וללא טיפול מקדים בנוגדנים נגד n-קדהרין (N-Cad) ואנטי אינטגרציה. סולם ברים = 100 μm. *P < 0.05 לעומת היפנוסק-CMs-RI; מיכל שלמה P < 0.05 לעומת היפנוסק-CMs+ RI. דמות זו שונתה מ-ז'או ואח '18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: טיפול מקדים עם Y-27632 הפחיתה את כתוביות היפנוסי-CMs והוא מוסדר למטה את הביטוי של הטרוביחידות המשנה של הלב. (א) קוונפיקציה של אחוז קיצור של היפנוsc-CMs נחשף לטיפול RI ו RA. *P < 0.05 לעומת היפנוsc-CMs-RI; מיכל שלמה P < 0.05 לעומת היפנוסק-CMs+ RI. (B ו- C) דמויות מייצגות וכימות של מדידות של סידן ארעית של היפנוsc-CMS שטופלו עם RI ו RA וקבוצה לא מטופלת. *P < 0.05 לעומת היפנוsc-CMs-RI; מיכל שלמה P < 0.05 לעומת היפנוסק-CMs+ RI. (ד) ניתוח כתמי מערבי של הביטוי של מערכת המשנה לב טרופונין (ctnc, ctnt, ו-ctnc) ב היפראס-CMs שטופלו עם RI ו RA ובקבוצה לא מטופלת. דמות זו שונתה מ-ז'או ואח '18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הטיפול הקדם שיפור שיעור החרט של היפנוסי-CMs בעכברים MI. (A) האות לוציפראב בהנהון/scid עכברים שטופלו PBS, היפראס-cms-ver, או היפנוsc-cms+ VER בימים 3, 7, ו 28 לאחר הניתוח. n = 8 עכברים לכל קבוצה. *P < 0.05 לעומת PBS; מיכל שלמה P < 0.05 לעומת היפנוסק-CMs-VER. (ב) החיסוני של מקטעי לב עבור הימן וחנה. עבור תמונות 10x, סרגל קנה מידה = 100 יקרומטר (תמונות 10x); 20 יקרומטר (תמונות 40x). n = 5 עכברים לכל קבוצה. *P < 0.05 לעומת היפנוסק-CMs-VER. דמות זו שונתה מ-ז'או ואח '18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים המרכזיים של מחקר זה כוללים השגת היפוך טהור-CMs, שיפור הפעילות של היפרsc-CMs דרך Y-27632 pretreatment טיפול, ולבסוף, שתילת כמות מדויקת של היפנוsc-CMs לתוך מודל MI של העכבר.
הנושאים המרכזיים שנדונו כאן היו כי, תחילה, אנו אופטימיזציה שיטות הטיהור ללא גלוקוז19 והקימו מערכת טיהור הרומן יעיל. הליך המערכת כללה החלת אנזימים תא-דיסוציאציה, לשתול מחדש תאים בצלחות מצופות ג'לטין, culturing את התאים במדיום נטרול עבור 24 שעות לאחר הציפוי, ומזעור זמן העיכול של התאים לפני השתלת, כל מהם בוצעו כדי להשיג את הפעילות הגבוהה ביותר של התאים תוך קבלת הקרדיוציטים טהור.
שנית, אנו פירט על טיפול מקדים של היפנוsc-CMs עם Y-27632 ב 12 לפני הזרקת התאים. האנואיקיס נגרמת בדרך כלל על ידי שינוי של חלבונים הדבקה התאים, כגון אינטגרציה4,20 ו N-קדהרין21, זה להוביל להפעלת מסלול האפוטוטיק. הדגמנו כי Y-27632 טיפול מקדים יכול לקדם את הדבקה של היפרsc-CMs לאתר השתלת באמצעות שמירה על הביטוי של אינטגרציה β1 ו-N-קדהרין, דיכוי הביטוי של p-MLC2, אשר קשורה שינויים השלד הציטוזה אדריכלות22,23. שבעה ימים לאחר השתלת היפנוס-CM, היתה היפנוסי-CMs+ RI הביאה לאזור הבית הגדול יותר של התאים, הצורות מוט מוגדר עדין יותר, וארגון השלד המלא יותר של ציטואס לעומת היפנוסק-CMs-RI (איור 1b-D).
שלישית, הקמנו מערכת הזרקת הרומן תאיים במודלים MI של העכבר, עם 5 μL לכל נקודת הזרקה כדי להזריק במדויק את המספר הנדרש של תאים, תוך הימנעות ירידה בשיעור הישרדות העכבר בשל נפח הזרקה מוגזמת.
רביעית, אנו פירט על איך לקבוע את השינויים התכווצות התא ו סידן ארעי ב-היפנוsc-CMs לאחר טיפול מקדים עם RI או RA. מצאנו ש-Y-27632 יכול להפחית את הקושי הניתן לצמצום התא והסידן הארעי. ההשערה היא כי בשל דרישות האנרגיה הנמוכה יותר של התאים המושתלים, שיעור העפילו עלה. אפקטים דומים ניתן להשיג באמצעות מעכבי תעלת סידן verapamil. המנגנון המוצע וכתוצאה מכך הוא כי Y-27632 מפחית את הביטוי של טרופונין משנה ctnt ו ctni ב היפראס-CMs.
המגבלה העיקרית היא כי Y-27632 רק שיחק תפקיד חולף במהלך ההשתלה. כיצד לעכב את Rho קינאז לתקופה ארוכה יותר, ובכך לשפר את יעילות ההשתלה של היפנוסק-CMs, היא בעיה להיפתר בעתיד. באשר ליישומים יותר של שיטה זו, מעכב רוק לא יכול רק לשפר את הפעילות של הקרדיוציטים במהלך ההשתלה אלא גם לשפר את הפעילות של תאים אחרים; לכן, זה יכול לשמש גם במהלך הטיפול הקדם בתהליכי ההשתלה של תאים אחרים. יתר על כן, הגישה המוצגת כאן מטילה בסיס ניסיוני טוב למחקר נוסף על מחלות לב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים מודים לד ר ג'וזף ג. וו (אוניברסיטת סטנפורד) לספק באדיבות את המבנה Fluc-GFP וד ר יאנון ליו לקבלת סיוע טכני מעולה. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי של בריאות RO1 מענקים HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (כדי J.Z.), ו HL121206A1 (כדי L.Z.), ו R56 מענק HL142627 (כדי W.Z.), מענק האיגוד האמריקני לפיתוח מדען האגודה 16SDG30410018, ואת אוניברסיטת אלבמה ב ברמינגהאם מענק פיתוח הפקולטה (כדי W.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| ImageJ | NIH | 1.52g |
References
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
