Summary
Neste protocolo, podemos demonstrar e elaborar sobre como usar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos para diferenciação e purificação de cardiomiócitos, e ainda, sobre como melhorar sua eficiência de transplante com inibidor de proteína quinase associada a Rho pré-tratamento em um modelo de infarto do miocárdio do camundongo.
Abstract
Um fator crucial na melhoria da eficácia da terapia celular para a regeneração miocárdica é de forma segura e eficiente aumentar a taxa de Engraftment celular. Y-27632 é um inibidor altamente potente da proteína quinase (RhoA/ROCK) associada a Rho, coiled-coil, e é usada para prevenir a apoptose celular induzida por dissociação (anoikis). Nós demonstramos que o pré-tratamento de Y-27632 para os cardiomiócitos pluripotentes induzidos humanos da pilha de haste (hiPSC-CMs+ ri) antes da implantação conduz a uma melhoria da taxa do Engraftment da pilha em um modelo do rato do infarction miocárdico agudo (MI). Aqui, nós descrevemos um procedimento completo da diferenciação, da purificação, e do pré-tratamento da pilha do hiPSC-CMs com Y-27632, assim como a contração resultante da pilha, as medidas transientes do cálcio, e a transplantação em modelos do rato MI. O método proposto fornece um método simples, seguro, eficaz e de baixo custo que aumenta significativamente a taxa de Engraftment celular. Este método não pode somente ser usado conjuntamente com outros métodos para realçar mais a eficiência da transplantação da pilha mas igualmente fornece uma base favorável para o estudo dos mecanismos de outras doenças cardíacas.
Introduction
As terapias baseadas em células-tronco mostraram um potencial considerável como um tratamento para danos cardíacos causados pelo MI1. O uso de hiPSCs diferenciados fornece uma fonte inesgotável de hiPSC-CMs2 e abre a porta para o rápido desenvolvimento de tratamentos inovadores. Entretanto, muitas limitações à tradução terapêutica permanecem, incluindo o desafio da taxa severamente baixa do Engraftment de pilhas implantadas.
Dissociar células com tripsina inicia anoikis3, que só é acelerado uma vez que estas células são injetadas em ambientes agressivos como o miocárdio isquêmico, onde o ambiente hipóxico acelera o curso em direção à morte celular. Das células remanescentes, uma grande proporção é lavada do local de implantação para a corrente sanguínea e se espalhou por toda a periferia. Uma das principais vias apoptóticas é a via RhoA/ROCK4. Com base em pesquisas anteriores, a via Rhoa/rock regula a organização citoesquelética actina5,6, que é responsável pela disfunção celular7,8. O inibidor da rocha Y-27632 é amplamente utilizado durante a dissociação e passaging de células estéticas e somáticas, para aumentar a adesão celular e reduzir a apoptose celular9,10,11. Neste estudo, o Y-27632 é usado para tratar o hiPSC-CMs antes da transplantação na tentativa de aumentar a taxa do Engraftment da pilha.
Vários métodos destinados a melhorar a taxa de Engraftment celular, tais como choque térmico e revestimento da matriz de membrana basal12, foram estabelecidas. Além desses métodos, a tecnologia genética também pode promover a proliferação de cardiomiócitos13 ou células não miocárdicas reversas em cardiomiócitos14. Do ponto de vista da bioengenharia, os cardiomiócitos são semeados em um andaime biomaterial para melhorar a eficiência do transplante15. Infelizmente, a maioria destes métodos são complicados e dispendiosos. Pelo contrário, o método proposto aqui é simples, econômico e efetivo, podendo ser utilizado como tratamento basal antes do transplante, bem como na conjugação com outras tecnologias.
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Protocol
Todos os procedimentos animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade do Alabama em Birmingham e foram baseados nos institutos nacionais de saúde laboratório de cuidados com os animais e diretrizes de uso (NIH publicação não 85-23).
1. preparação de meios de cultura e placas de cultura
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Preparação média
- Para o meio hiPSC, misture 400 mL de meio basal de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) (tabela de materiais 1) e 100 ml de suplemento HPSC 5x; armazenar a mistura a 4 ° c.
- Para RPMI 1640/B27 menos insulina (RB-) médio, misture 500 mL de RPMI 1640 e 10 mL de suplemento B27 menos insulina.
- Para o meio RPMI 1640/B27 (RB +), misture 500 mL de RPMI 1640, 10 mL de suplemento B27 e 5 mL de antibiótico de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep).
- Para o meio de purificação16, misture 500 ml de no-glucose rpmi 1640, 10 ml de suplemento B27, 5 ml de antibiótico Pen-Strep e 1.000 μl de solução de DL-lactato de sódio (a uma concentração final de 4 mm).
- Para solução de neutralização, misture 200 mL de RPMI 1640, 50 mL de soro fetal bovino (FBS), 2,5 mL de antibiótico Pen-Strep e 50 μL de Y-27632 (numa concentração final de 10 μM).
- Para o meio de congelação, misture 9 mL de FBS, 1 mL de dimetil sulfóxido (DMSO) e 10 μL de Y-27632 (numa concentração final de 10 μM).
- Para a solução de matriz extracelular (EMS), descongelar a matriz extracelular concentrada (tabela de materiais 1) a 4 ° c até atingir um estado líquido uniformemente consistente. Precool pontas de pipeta e tubos antes de fazer alíquotas de matriz de 350 μL cada um no gelo, e armazenar as alíquotas em-20 ° c. Antes de revestir as chapas, diluir uma alíquota descongelada em 24 mL de meio DMEM/F12 frio-gelado (EMS); Mantenha o EMS em 4 ° c por até 2 semanas.
Nota: Execute todas as etapas do revestimento no gelo para impedir a solidificação da matriz da membrana do porão. - Para a solução de Tyrode, tome 90% do volume final exigido da água da classe da cultura do tecido, adicione a quantidade apropriada dos seguintes reagentes, e mexa até dissolver. Em seguida, use 1 N NaOH para ajustar o pH para 7,4. Adicione água extra a uma concentração final de 140 mmol/L de cloreto de sódio, 1 mmol/L de cloreto de magnésio, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L de cloreto de potássio, 10 mmol/L de glicose, e 1,8 mmol/L cloreto de cálcio. Esterilizar por filtração, usando uma membrana de 0,22 μm.
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Revestimento da placa da cultura de pilha
- Para placas de cultura hiPSC, aplique 1 mL de EMS a cada poço de uma placa de 6 poços e incubar a placa por pelo menos 1 h a 37 ° c. Aspirar a solução DMEM/F12 antes de semear as células.
- Para o revestimento de gelatina, dissolva 0,2 g de pó de gelatina em água de grau de cultura de tecidos para fazer uma solução de 0,2% (w/v). Esterilizar por autoclavagem a 121 ° c, 15 psi por 30 min. Cubra cada poço de uma placa de 6 poços com 2 mL da solução e incubar por 1 h a 37 ° c. Antes de de as pilhas, aspirar a solução e permitir que a placa seque por pelo menos 1 h na temperatura ambiente dentro da capa da cultura do tecido.
2. manutenção hiPSC e Ddiferenciação de cardiomiócitos
- Cultura os hiPSCs no meio hiPSC (ver passo 1.1.1) com uma mudança média diária até que as células atinjam 80% – 90% de confluência por poço.
Nota: Para fins de manutenção, os hiPSCs estão geralmente prontos para a passagem a cada 4 dias. - Para a passagem de hiPSCs, aspirar o meio e lavar o poço 1x com 1x fosfato-tampão salino (PBS). Adicionar 0,5 mL de solução de descolamento de células estaminais (tabela de materiais 1) a cada poço e incubar a 37 ° c durante 5 – 7 min.
Nota: O tempo de incubação depende da densidade das células e da taxa de dissociação, que pode ser observada um microscópio. - Neutralize a solução de descolamento de células-tronco com 1 mL de meio hiPSC suplementado com 5 μM Y-27632. Colete a mistura em um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugue o tubo durante 5 min a 200 x g, Aspire o sobrenadante sem perturbar o pellet celular e, em seguida, ressuscitem as células em 1 ml de meio hipsc contendo 5 μm Y-27632.
- Semente os hiPSCs em um novo EMS-revestido 6-placa bem em uma relação entre 1:6 a 1:18. Mude o meio ao meio do hiPSC sem Y27632 após 24 h.
- Para congelar as células, Ressuspender os hiPSCs dissociados em meio de congelamento em uma concentração de 0,5 – 1 milhão/500 μL, colocar a suspensão em cryovials e armazená-los em um freezer de-80 ° c. Transferir os frascos congelados para nitrogênio líquido após 24 h.
- Para diferenciar, substitua o meio hiPSC por 2 mL de RB-meio suplementado com 10 μM de inibidor GSK-3β CHIR99021 (CHIR) em 80% – 90% de confluência celular. Substitua o meio por 3 mL de RB-meio após 24 h e incubar por um adicional de 48 h (dia 3).
- No dia 3, mude o meio para 3 mL de RB-meio com 10 μM de inibidor de WNT IWR1 para 48 h (dia 5) e, em seguida, substitua o meio com 3 mL de RB-médio e mantenha por 48 h (dia 7).
- No dia 7, substitua o meio com 3 mL de meio RB e mude o meio a cada 3 dias daqui para frente. A batida espontânea de hiPSC-CMs deve ser observada entre os dias 7 – 10.
3. hiPSC-CMs purificação e pequena molécula pre-tratamento
Nota: Enzimas de dissociação de células recombinantes altamente purificadas (tabela de materiais 1) foram utilizadas para dissociar o hipsc-CMS.
- No dia 21 após a diferenciação hiPSC-CM, aspirar o meio e lavar as células 1x com PBS estéril. Incubar as células com 0,5 mL de enzimas de dissociação celular por poço por 5 – 7 min a 37 ° c. Pipeta repetidamente a suspensão da pilha usando uma pipeta de 1 mL a fim dissociar completamente as pilhas.
- Depois que as células são dissociadas, adicione 1 mL de solução de neutralização a cada poço, colete a mistura de células em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugue a 200 x g por 3 min. descarte o sobrenadante e resuma as células na solução neutralizadora.
- Replantar as células em placas de 6 poços revestidas com gelatina a uma densidade de 2 milhões células por poço.
- Após 24 – 48 h, substitua o meio de cultura por meio de purificação por 3 – 5 dias.
Nota: A purificação está completa quando mais de 90% das células em cada campo de visão do microscópio estão batendo. Para evitar mais danos aos cardiomiócitos, não prolongue a duração da purificação além de 5 dias. Se a primeira rodada não produzir a pureza necessária, substitua o meio de purificação por meio de RB + por 1 dia e, em seguida, conclua uma segunda rodada de purificação. - Antes da transplantação, a cultura as pilhas no grupo do tratamento para 12 h no meio do RB + suplementou com 10 μM Y-27632. Da mesma forma, realizar o tratamento com Verapamil nas células do meio RB + com 1 μM de Verapamil para 12 h (hiPSC-CMs+ Ver).
- Após o tratamento, lave o hiPSC-CMs 1x com PBS e incubar as células com 0,5 mL de enzimas de dissociação de células por poço para um máximo de 2 min. Pipetar repetidamente a suspensão da célula, utilizando uma pipeta de 1 mL, para separar completamente as células. Neutralize as células com solução neutralizante, colete a mistura de células em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugue a 200 x g durante 3 min. ressuscitem as células em PBS em uma concentração de 100.000 células/5 μL em preparação para injeção.
4. infarto do miocárdio e transplante de células
Nota: Todos os instrumentos cirúrgicos são saco com autoclave e são mantidos na condição asséptica durante cirurgias múltiplas através de um esterilizador quente do grânulo (tabela dos materiais 2).
- Anestesiar camundongos NOD/scid (tabela de materiais 2) com isoflurano inalatório (1,5% – 2%). Monitore os níveis de anestesia pelas respostas dos camundongos a uma pitada de dedo do pé. Coloque o veterinário pomada óptica sobre os olhos para impedi-los de secar durante a cirurgia.
- Forneça 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea para o manejo da dor antes da cirurgia.
- Posicione e prenda o rato em uma posição supina em uma tabela de funcionamento aquecida, remova o cabelo da região ventral da garganta e do tórax esquerdo usando um creme depilatórios, exponha a pele, e desinfecte-o com álcool de 70%.
- Corte uma incisão de 0,5 cm no centro do pescoço usando tesouras cirúrgicas, separe a gordura subcutânea com fórceps estéril e exponha a traquéia. Introduzir oralmente a cânula de intubação na traquéia, conectar a cânula a um pequeno ventilador animal e ajustar as configurações de ventilação (ajustar o volume corrente a 100 – 150 μL e a taxa de respiração a 100x – 150x por minuto).
- Depois que o mouse se estabiliza, corte uma incisão de 0,5 cm no meio da pele do tórax esquerdo. Use fórceps para separar sem rodeios a camada muscular e fazer uma pequena incisão no quinto espaço intercostal para expor a cavidade torácica. Coloque o retractor na incisão para abrir a cavidade torácica e localize a artéria coronária descendente esquerda (LAD). um microscópio cirúrgico de dissecação, ligadura o Lad com um 8-0 sutura não absorvível.
- Imediatamente após a indução da MI, injete 5 μL de hiPSC-CMs-ri, hipsc-CMS+ ri, hipsc-CMS-Ver, hipsc-CMS+ Ver, ou um volume igual de PBS no miocárdio do camundongo em cada local (3 x 105 células/animal, 1 x 105 células/local), um na área do enfarte e dois nas áreas em torno do enfarte.
Nota: Desde que 5 μL é volume muito pequeno, não é fácil controlar exatamente o volume sugando-o diretamente com uma seringa. A tampa de um prato de Petri estéril pode ser girado sobre, e 5 μL das pilhas podem primeiramente ser depositados na tampa com uma pipeta. Devido à tensão de superfície, não se espalhará mas condensar-se-á em uma massa líquida pequena. Isso pode ser facilmente absorvido e injetado no miocárdio do mouse. - Elimine o ar residual na cavidade torácica enchendo-o acima com a solução salina isotônica morna. Costurar as costelas, os músculos e a pele em sequência com uma sutura 6-0 absorvível. Desligue a injeção da anestesia do isoflurano. Mantenha os animais da cirurgia na almofada de aquecimento e observá-los pròxima Quando recuperarem a consciência cheia. Em seguida, coloque os animais em uma gaiola limpa. Não devolva os animais à companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados.
- Após a cirurgia, injete os camundongos intraperitonealmente com buprenorfina (0,1 mg/kg) a cada 12 h durante 3 dias consecutivos e injete-os com ibuprofeno (5 mg/kg) a cada 12 h por um dia. Realize estudos de análise subsequentes em pontos de tempo especificados.
Nota: Siga as diretrizes do Comitê de cuidados com animais locais para analgesia.
5. registro transiente do cálcio e da contractilidade
- Autoclave de 15 mm de diâmetro (tabela de materiais 2) e pinças em uma taça de vidro pequeno a 121 ° c, 15 psi por 15 min. precool as lamínulas e pinças a 4 ° c.
- Usando a pinça, coloque a lamínula em uma placa de 12 poços e pipetar 300 μL de matriz extracelular para cada lamínula.
Nota: Não deixe que a matriz exceda a borda da lamínula para evitar a redução da quantidade de revestimento da matriz. Incubar a placa de 12 poços em uma incubadora da cultura de célula de 37 ° c por 1 h. - Aspirar o meio na placa gelatina-revestida de 6 poços com hiPSC-CMs purificado, lave-a 1x com PBS e, em seguida, digerir com 0,5 mL de enzimas de dissociação de células por 1,5 min. Adicione 1 mL de solução de neutralização, pipetar repetidamente para não mais do que 5x – 10x com uma pipeta de 1 mL e centrifugue a mistura a 200 x g durante 3 min.
- Aspirar a matriz extracelular revestida dos lamínulas. Conte o número da célula e ressuscitem as células na solução de neutralização para uma concentração de 40000/300 μL e, em seguida, adicione 300 μL da suspensão da célula em cada lamínula. Cultura da placa em uma incubadora de 37 ° c.
- Após 24 h, aspire suavemente a solução neutralizada, adicione 500 μL de meio RB + a cada poço da placa e continue a cultura por 2 dias.
- Adicionar Y-27632 (10 μM), ativador Rho quinase (RA, 100 nM), verapamil (1 μM), ou um volume igual de PBS no meio de cultura de hiPSC-CMs, 12 h antes de detecção de transiente e contratilidade de cálcio.
Nota: Além da detecção de transientes e contratilidade de cálcio das células após 12 h de tratamento químico, a detecção desses parâmetros também foi testada em 12, 24, 48 e 72 h após a retirada química. - Retire a placa, descarte o meio, e lave a placa 1x com PBS. Mude o meio a um DMEM fenol-vermelho-livre que contem 0, 2% (w/v) do poliol do surfactante (tabela dos materiais 1), do indicador do cálcio de 5 μm (tabela dos materiais 1), e do Y-27632 correspondente (10 μm), ra (100 nanômetro), verapamil (1 μm), ou um volume igual de PBS, e incubar a placa por 30 min a 37 ° c.
- Descarte o sobrenadante, lave as células 3x com meio DMEM livre de corante e deixe o meio descansar por 30 min para desesterificar o corante de mapeamento.
- Coloc o lamela pilha-semeado em uma câmara aberta do banho e insira a câmara em um sistema da microincubação equilibrado a 37 ° c com um controlador de temperatura automático (tabela dos materiais 2), perfuse-o com a solução de Tyrode, e adicione continuamente Inibidor da Rho-quinase (RI), ar ou PBS à solução de perfusão.
- Use um microscópio de fluorescência invertido (tabela de materiais 2) e uma cabeça da exploraçãodo laser (tabela dos materiais 2) para gravar o transiente espontâneo do cálcio empregando uma varredura da linha de x-t, usando um laser do argão de 488 nanômetro para a excitação da tintura e um 515 ± 10 nanômetro filtro de barreira para coletar luz de emissão. Registre a contração espontânea de hiPSC-CMs usando a funcionalidade de contraste de interferência diferencial do microscópio confocal (tabela de materiais 2).
Nota: As gravações transientes de cálcio foram processadas e analisadas com o uso do software MATLAB R2016A (tabela de materiais 4). Os ensaios de mudança de contração celular foram realizados utilizando-se o software ImageJ (tabela de materiais 4).
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Representative Results
O hiPSC-CMs usado neste estudo foi derivado da origem humana com o gene do repórter do luciferase; Conseqüentemente, a taxa de sobrevivência das pilhas transplantadas in vivo foi detectada pela imagem latente do bioluminescência (bli)17 (Figura 1a, B). Para as seções histológicas do coração, a troponina cardíaca humana-específica T (hctnt) e o antígeno nuclear humano (HNA) pilhas dobro-positivas foram classific como o hipsc-CMS enxertado (Figura 1C). Ambos os resultados indicaram que o pré-tratamento de Y-27632 melhorou significativamente a taxa do Engraftment da pilha. A atividade da luciferase do grupo Hisc-CM+ ri foi aumentada aproximadamente seis vezes nos dias 3, 7 e 28 após o transplante, comparado com o do grupo HIPSC-cm-ri (Figura 1b). Além disso, a expressão de hcTnT/HNA aumentou perto de Sevenfold no grupo Hisc-CM+ ri , em relação ao grupo HIPSC-cm-ri (Figura 1C).
Os resultados indicaram também que o pré-tratamento Y-27632 regulou as alterações citoesqueléticas nas células transplantadas. Nos dias 7 e 28 do transplante, o hiPSC-CMs+ ri exibiu uma estrutura citoesquelética em forma de haste maior e mais definida em relação ao Hipsc-CMS-ri (Figura 1D).
Além disso, o pré-tratamento de Y-27632 tem o potencial reduzir o apoptose transplantado do hipsc-cm in vivo. A coloração de TUNEL mostrou que o número de células TUNEL-positivas diminuiu significativamente no grupo Hisc-CM+ ri em relação ao grupo HIPSC-cm-ri no dia 2 após o transplante (Figura 1e).
A inibição do ROCK promoveu a adesão das células transplantadas e teve o potencial de aumentar ainda mais a retenção de células implantadas em sítios de administração. O borrão ocidental e a imunomarcação do tecido cardíaco sugeriram que o pré-tratamento de Y-27632 promoveu reversivelmente a expressão aumentada de integrina β1 e de N-cadherin e diminuiu a expressão da corrente clara 2 do phospho-myosin (p-MLC2) (Figura 2a, B ).
A linha HL-1 da pilha do rato foi selecionada como o CMs do controle para experimentos in vitro do acessório da pilha. Os resultados indicaram que o pré-tratamento Y-27632 aumentou significativamente a aderência do hiPSC-CM em relação à HL-1. Para confirmar ainda mais esses achados, o hiPSC-CMs+ ri foi incubado com anticorpos neutralizantes N-caderina ou integrina β1 por 1 h, resultando em desaparecimento da adesão melhorada observada anteriormente (Figura 2C).
Comparado com o grupo hiPSC-CM-ri , a força contrátil no grupo hisc-cm+ ri foi reduzida em 32%, e no grupo Hipsc-cm+ ra (hipsc-CMS pré-tratado com ativador de rocha, tabela de materiais 1), foi aumentado em 42% ( Figura 3a). Enquanto isso, comparado com o grupo hiPSC-CM-ri , a fluorescência de pico de cálcio transiente (pico ΔF/f0) para o grupo hisc-cm+ ri foi reduzida em 41%, e a duração transitória do cálcio (CaTD50) foi reduzida em 11% (Figura 3B , C). Em contrapartida, o pico ΔF/F0 para o grupo hipsc-cm+ ra foi aumentado em 48%, e o CaTD50 foi aumentado em 13% (Figura 3B, C).
Além disso, um pré-tratamento dos cardiomiócitos com Y-27632 para 12 h antes do transplante reduziu significativamente a expressão de cTnI e cTnT (Figura 3D), sendo que ambas são subunidades de troponina (TN) que regulam a contração dos cardiomiócitos.
Similar a Y-27632, um pré-tratamento do verapamil (1 μM, 12 h) aumentou significativamente a taxa do Engraftment de hiPSC-CMs em ratos induzidos do MI. A hipótese foi confirmada através da observação de um sinal de luciferase aumentado no ensaio de bioluminescência (figura 4a) e aumento do número de células hcTnT/HNA de duplo positivo nos dias 7 e 28 após o transplante celular (Figura 4B).
Figura 1: o pré-tratamento de Y-27632 aumentou a taxa do Engraftment de hiPSC-CMS em corações dos ratos do mi. (A) curva padrão das medições de bli. (B) sinal de luciferina em camundongos Nod/scid tratados com PBS, Hipsc-CMS-riou hipsc-CMS+ ri nos dias 3, 7 e 28 após a cirurgia. n = 6-9 ratos por grupo. *P < 0, 5 vs. PBS; o † P < 0, 5 vs. Hipsc-CMS-ri. (C) imunocoloração de secções cardíacas para hcTnT e HNA. Barras de escala = 100 μm (10x imagens); 20 μm (40x imagens). n = 5 ratos por grupo. *P < 0, 5 vs. Hipsc-CMS-ri. (D) imagens representativas de secções cardíacas coradas com faloidina e hctnt. Barra de escala = 20 μm. n = 5 ratos por grupo. *P < 0, 5 vs. Hipsc-CMS-ri. E) imagens representativas de secções cardíacas para a coloração de tunel. Barra de escala = 20 μm. n = 4-6 ratos por grupo. *P < 0, 5 vs. Hipsc-CMS-ri. Este número foi modificado de Zhao et al.18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Y-27632 melhorou a adesão de hiPSC-CMS, mantendo a expressão de proteínas de adesão. (A e B) análise de Western blot da expressão de integrina ß1, n-caderina e FOSFORILAÇÃO de MLC2 (p-MLC2) em hipsc-CMS tratados com ri e em hipsc-CMS não tratado. n = 5 repetições por grupo. (C) análise de coloração por imunofluorescência de hctnt de-ri e + ri Hipsc-CMS com e sem pré-tratamento de anticorpos anti-n-caderina (n-CAD) e anti-integrina ß1 (integ). Barras de escala = 100 μm. *P < 0, 5 vs. Hipsc-CMS-ri; o † P < 0, 5 vs. hipsc-CMS+ ri. Este número foi modificado de Zhao et al.18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: o pré-tratamento com Y-27632 reduziu a contratilidade do Hisc-CMS e regulou a expressão de subunidades de troponina cardíaca. (A) quantificação da percentagem de encurtamento dos hisc-CMS expostos ao tratamento com ri e ra. *P < 0, 5 vs. Hipsc-CMS-ri; o † P < 0, 5 vs. hipsc-CMS+ ri. (B e C) imagens representativas e quantificação de medições transitórias de cálcio de hipsc-CMS tratadas com ri e ra e de um grupo não tratado. *P < 0, 5 vs. Hipsc-CMS-ri; o † P < 0, 5 vs. hipsc-CMS+ ri. (D) análise de Western blot da expressão de subunidades de troponina cardíaca (ctnc, ctnt e CTNi) em hisc-CMS tratadas com ri e ra e em grupo não tratado. Este número foi modificado de Zhao et al.18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: o pré-tratamento com Verapamil melhorou a taxa de Engraftment de hiPSC-CMS em camundongos mi. (A) sinal de luciferina em camundongos Nod/scid tratados com PBS, Hipsc-CMS-Verou hipsc-CMS+ Ver nos dias 3, 7 e 28 após a cirurgia. n = 8 ratos por grupo. *P < 0, 5 vs. PBS; o † P < 0, 5 vs. Hipsc-CMS-Ver. (B) imunocoloração de secções cardíacas para hcTnT e HNA. Para imagens de 10x, barras de escala = 100 μm (10x imagens); 20 μm (40x imagens). n = 5 ratos por grupo. *P < 0, 5 vs. Hipsc-CMS-Ver. Este número foi modificado de Zhao et al.18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os principais passos deste estudo incluem a obtenção de Hisc-CMs puro, melhorando a atividade do hiPSC-CMs através do pré-tratamento Y-27632 e, finalmente, transplantar uma quantidade exata de hiPSC-CMs em um modelo de MI do mouse.
As principais questões abordadas aqui foram que, primeiro, otimizamos os métodos de purificação sem glicose19 e estabelecemos um novo sistema de purificação eficiente. O procedimento de sistema incluiu a aplicação de enzimas de dissociação celular, replantando células em placas revestidas com gelatina, cultivando as células no meio de neutralização por 24 h após a resposta, e minimizando o tempo de digestão das células antes do transplante, todos os dos quais foram realizados para atingir a maior atividade das células, obtendo cardiomiócitos puros.
Em segundo, Nós elaboramos no pré-tratamento de hiPSC-CMs com Y-27632 em 12 h antes da injeção da pilha. O anoikis é induzido geralmente pela modificação das proteínas da adesão das pilhas, tais como integrinas4,20 e N-cadherin21, que conduzem à ativação do caminho apoptóticas. Nós demonstramos que o pré-tratamento de Y-27632 poderia promover a adesão de hiPSC-CMs ao local da transplantação com a manutenção da expressão do integrina β1 e do N-cadherin, suprimindo a expressão de p-MLC2, que é relacionada às mudanças no cytoesquelético arquitetura22,23. Sete dias após a transplantação de hiPSC-CM, o hiPSC-CMs+ ri conduziu a uma área maior do Engraftment da pilha, umas formas definidas mais finas da haste, e uma organização cytoesquelética mais completa comparada ao Hipsc-CMS-ri (Figura 1b-D).
Em terceiro lugar, estabelecemos um novo sistema de injeção intracelular em modelos de mouse MI, com 5 μL por ponto de injeção para injetar com precisão o número necessário de células, evitando uma diminuição na taxa de sobrevida do mouse devido ao volume excessivo de injeção.
Em quarto lugar, elaboramos como determinar as alterações na contração celular e no cálcio transiente em hiPSC-CMs após o pré-tratamento com RI ou RA. Nós achamos que Y-27632 pode reduzir reversivelmente a contratilidade celular e o cálcio transiente. A hipótese aqui é que devido às exigências mais baixas da energia das pilhas transplantadas, a taxa do Engraftment aumentou. Efeitos semelhantes podem ser alcançados usando o inibidor de canal de cálcio Verapamil. O mecanismo proposto que resulta na inibição da contratilidade é que o Y-27632 reduz a expressão de subunidades de troponina cTnT e cTnI em hiPSC-CMs.
A principal limitação é que o Y-27632 só desempenhou um papel transitório durante o transplante. Como inibir a Rho quinase por um período mais longo, melhorando assim a eficiência do transplante de hiPSC-CMs, é um problema a ser resolvido no futuro. Quanto a mais aplicações deste método, o inibidor da rocha não só pode melhorar a atividade dos cardiomiócitos durante o transplante, mas também melhorar a atividade de outras células; Conseqüentemente, pode igualmente ser usado durante o pré-tratamento nos processos da transplantação de outras pilhas. Além disso, a abordagem aqui apresentada estabelece uma boa base experimental para mais pesquisas sobre doenças cardíacas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Dr. Joseph C. Wu (Universidade de Stanford) por gentilmente fornecer o constructo Fluc-GFP e o Dr. Yanwen Liu para uma excelente assistência técnica. Este estudo é apoiado pelos institutos nacionais de saúde RO1 concede HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (a J.Z.), e HL121206A1 (a L.Z.), e um R56 conceder HL142627 (a W.Z.), uma associação americana de desenvolvimento do cientista do coração Grant 16SDG30410018, e a Universidade de Alabama na concessão do desenvolvimento da faculdade de Birmingham (a W.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| ImageJ | NIH | 1.52g |
References
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