Styrking av engraftment av humant indusert pluripotent Stem Cell-avledet Cardiomyocytes via en forbigående hemming av Rho kinase aktivitet
Summary
I denne protokollen, viser vi og utdype hvordan du bruker humant indusert Pluripotent stamceller for cardiomyocyte differensiering og rensing, og videre, om hvordan å forbedre sin transplantasjon effektivitet med Rho-assosiert protein kinase inhibitor forbehandling i en mus hjerteinfarkt modell.
Abstract
En avgjørende faktor i å forbedre cellulær terapi effektivitet for hjerteinfarkt regenerering er å trygt og effektivt øke celle engraftment rate. Y-27632 er en svært potent hemmer av Rho-assosiert, spiral-spiral-inneholdende protein kinase (RhoA/ROCK) og brukes til å forebygge dissosiasjon celle apoptose (anoikis). Vi viser at Y-27632 forbehandling for humant indusert pluripotent stilk cellen-avledet cardiomyocytes (hiPSC-CMs+ ri) før implantation resulterer i en celle engraftment rate forbedring i en musemodell av akutt hjerteinfarkt (mi). Her beskriver vi en komplett prosedyre av hiPSC-CMs differensiering, rensing, og celle forbehandling med Y-27632, samt den resulterende celle sammentrekning, kalsium forbigående målinger, og transplantasjon i mus MI modeller. Den foreslåtte metoden gir en enkel, sikker, effektiv og rimelig metode som i betydelig grad øker celle engraftment rate. Denne metoden kan ikke bare brukes sammen med andre metoder for å ytterligere forbedre celle transplantasjon effektivitet, men gir også et gunstig grunnlag for studiet av mekanismene for andre hjertesykdommer.
Introduction
Stilk cellen-basert terapeut ha vist betydelig muligheter som behandling for CARDIAC skade forårsaket av MI1. Bruken av differensiert hiPSCs gir en uuttømmelig kilde til hiPSC-CMs2 og åpner døren for den raske utviklingen av banebrytende behandlinger. Men mange begrensninger på terapeutisk oversettelse gjenstår, inkludert utfordringen med alvorlig lav engraftment rate av implantert celler.
Dissociating celler med Trypsin initierer anoikis3, som bare er akselerert når disse cellene injiseres i tøffe miljøer som iskemiske myokard, der hypoxic miljøet akselererer kursen mot celle død. Av de resterende cellene, er en stor andel vasket ut fra implantation området i blodet og spredt over hele periferien. En av de viktigste apoptotisk trasé er RhoA/ROCK Pathway4. Basert på tidligere forskning, RhoA/rock Pathway regulerer utgangen cytoskjelettkomponenter Organization5,6, som er ansvarlig for celle dysfunksjon7,8. The Rock inhibitor Y-27632 er mye brukt under somatiske og stilk cellen dissosiasjon og passaging, for å øke celle vedheft og redusere celle apoptose9,10,11. I denne studien, Y-27632 brukes til å behandle hiPSC-CMs før transplantasjon i et forsøk på å øke celle engraftment rate.
Flere metoder for å forbedre celle engraftment hastighet, slik som varme sjokk og kjeller membran matrise belegg12, er etablert. Bortsett fra disse metodene, kan genetisk teknologi også fremme cardiomyocyte spredning13 eller reversere nonmyocardial celler til cardiomyocytes14. Fra bioteknologi perspektiv, cardiomyocytes er sådd på en biomaterialet stillas for å forbedre transplantasjon effektivitet15. Dessverre, de fleste av disse metodene er kompliserte og kostbare. Tvert imot, metoden foreslås her er enkel, kostnadseffektiv og effektiv, og den kan brukes som en basal behandling før transplantasjon, så vel som i Bøyning med andre teknologier.
Protocol
Representative Results
Discussion
De viktigste trinnene i denne studien er å skaffe ren hiPSC-CMs, forbedre aktiviteten til hiPSC-CMs gjennom Y-27632 forbehandling, og til slutt, transplantere en presis mengde hiPSC-CMs i en mus MI modell.
De viktigste spørsmålene som er omtalt her var at først, vi optimalisert glukose-fri rensing metoder19 og etablerte en roman effektiv rensing system. Systemet prosedyren inkluderte å bruke celle-dissosiasjon enzymer, nyplanting celler i gelatin-belagt plater, dyr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Joseph C. WU (Stanford University) for vennlig å gi svingninger-GFP konstruere og Dr. Yanwen Liu for utmerket teknisk assistanse. Denne studien er støttet av National Institutes of Health RO1 tilskudd HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (til J.Z.), og HL121206A1 (til L.Z.), og en R56 stipend HL142627 (til W.Z.), en amerikansk hjerteforeningen forsker Development Grant 16SDG30410018, og University of Alabama i Birmingham fakultet Development Grant (til W.Z.).
Materials
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| Image J | NIH | 1.52g |
References
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
