Summary
Nous présentons ici un protocole qui simplifie la mesure de lumière électrorétinogramme évoqués réponses des larve zebrafish. Une électrode roman éponge-pointe conique peut aider à rendre l’étude du développement visuel chez le poisson zèbre larvaire, à l’aide de l’électrorétinogramme ERG plus facile à réaliser avec des résultats fiables et à moindre coût.
Abstract
Le poisson zèbre (Danio rerio) est couramment utilisé comme un modèle de vertébrés dans les études sur le développement et est particulièrement adapté pour la neuroscience visuelle. Pour les mesures fonctionnelles de performance visuelle, électrorétinographie (ERG) est une méthode non invasive idéale, qui a été bien établie dans les espèces de vertébrés supérieurs. Cette approche est plus en plus utilisée pour l’examen de la fonction visuelle chez le poisson zèbre, y compris pendant les premiers stades du développement larvaires. Toutefois, l’électrode d’enregistrement plus couramment utilisés pour les larve zebrafish ERG à ce jour est l’électrode de verre micropipette, qui nécessite un équipement spécialisé pour sa fabrication, présentent un défi pour les laboratoires disposant de ressources limitées. Nous présentons ici un protocole ERG de larves de poisson zèbre à l’aide d’une électrode embout éponge en forme de cône. La nouvelle électrode est plus facile de fabriquer poignée, plus économique et moins susceptible d’endommager l’oeil larvaire que la micropipette de verre. Comme méthodes ERG publiées antérieurement, le protocole actuel peut évaluer la fonction rétinienne externe par le biais de photorécepteur et réponses des cellules bipolaires, l’a - et b-vague, respectivement. Le protocole peut illustrent clairement le raffinement de la fonction visuelle au cours du développement précoce des larves de poisson zèbre, soutenant l’utilitaire, sensibilité et fiabilité de l’électrode de roman. L’électrode simplifiée est particulièrement utile lorsque établissant un nouveau système ERG ou modifier l’existant appareils d’ERG de petits animaux pour mesure de poisson-zèbre, aider des chercheurs en neurosciences visuels à utiliser le poisson-zèbre modèle organisme.
Introduction
Le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un modèle génétique de vertébrés largement utilisé, y compris des études de neurosciences visuels. La popularité croissante de cette espèce peut être attribuée aux avantages dont la facilité de manipulation génétique, hautement conservée vertébré système visuel (types de neurones, la morphologie anatomique et organisation et génétique sous-jacente), forte fécondité et pour un coût de gestion des ressources par rapport aux modèles mammifères1. La non invasif électrorétinogramme (ERG) a longtemps été utilisé sur le plan clinique pour évaluer la fonction visuelle humaine et en laboratoire afin de quantifier la vision dans un éventail d’espèces grandes et petites, y compris les rongeurs et les larves de poisson zèbre2,3 , 4 , 5. les composants ERG plus couramment analysés sont l’une onde et ondes b, originaires de la détection de lumière les photorécepteurs et les interneurones bipolaires, respectivement. Chez le poisson zèbre larvaire, couches distinctes dans la rétine sont établis par la fertilisation après 3 jours (dpf) et la morphologie du cône terminal photorécepteur synapses matures avant 4 dpf6,7. La fonction rétinienne externe du poisson-zèbre larvaire est donc établie avant dpf 4, ce qui signifie que l’ERG est mesurable à partir de cet âge précoce à partir. En raison du cycle court expérimental et les propriétés haut débit du modèle, l’ERG a été appliqué aux larve zebrafish pour évaluation fonctionnelle des modèles de maladies, analyse de vision et la rétine de coloration, l’étude des rythmes circadiens visuels et essai de drogue8,9,10,11,12.
Toutefois, les approches actuelles pour le poisson-zèbre larvaire ERG a certaines complexités qui peuvent rendre plus difficile à adopter. Publié zebrafish larvaire ERG protocoles utilisent généralement une micropipette de verre remplie de liquide conducteur sous l’enregistrement électrode3,4,5,13, qui exige une micropipette de haute qualité Astuce3. Équipement spécialisé, comme un de micropipettes et dans certains cas, une microforge, sont nécessaires à leur fabrication. Cela peut être un défi pour les laboratoires disposant de ressources limitées et entraîne des coûts supplémentaires même lors de l’adaptation des systèmes ERG animaux petits disponibles pour la mesure de la fonction visuelle de larves de poisson zèbre. Même lorsque le lissé, le bout pointu micropipette pouvant endommager la surface de le œil larvaire. En outre, titulaires d’une micropipette commerciale pour l’électrophysiologie sont construits avec un fil d’argent fixe. Ces fixes fils devient passivés après utilisation répétitive, nécessitant l’achat des nouveaux titulaires, entraînant des coûts de maintenance accrus.
Nous décrivons ici une méthode ERG à l’aide d’une électrode d’enregistrement pointe éponge en forme de cône, qui est particulièrement utile pour l’adaptation des configurations d’ERG petits animaux établies pour les larves de poisson zèbre ERG mesures. L’électrode est facilement fait à l’aide de la commune éponge d’acétate de polyvinyle (PVA) et fil d’argent fin sans n’importe quel autre équipement spécialisé. Nos données montrent que cette nouvelle électrode est sensible et assez fiable pour démontrer le développement fonctionnel des circuits neuraux rétiniennes en larve zebrafish entre 4 et 7 dpf. Cette électrode embout éponge économique et pratique peut être utile pour les chercheurs en établissant de nouveaux systèmes ERG ou de modifier les systèmes existants de petits animaux, d’études de poisson-zèbre.
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Protocol
Toutes les procédures de l’électrorétinogramme (ERG) ont été réalisés selon les dispositions du code de pratique pour les soins Australian National Health and Medical Research Council et l’utilisation des animaux et ont été approuvés par le Comité institutionnel d’éthique animale à la Université de Melbourne.
1. préparation de la mémoire tampon
- Préparer le mémoire tampon poisson rouge Ringer 10 x (1,25 M NaCl, KCl 26 mM, 25 mm CaCl2, 10 mM MgCl2, glucose 100 mM, 100 mM HEPES) à l’aide de l’eau par osmose inverse (RO). Ajuster la mémoire tampon à pH 7,8 et stériliser le tampon à l’aide de 0,22 μm filtre. Stocker le tampon de 10 x à 4 ° C comme la solution stock3.
Remarque : La mémoire tampon solution de Ringer 10 x doit être utilisé dans les 3 mois. - Le jour de l’expérience, faire 1 x tampon de goldfish Ringer en diluant le mémoire tampon Cyprin doré Ringer 10 x à l’aide de l’eau osmosée.
Remarque : Le 1 x tampon de goldfish Ringer est utilisé pour saturer l’éponge PVA, y compris l’éponge utilisée pour le positionnement du poisson-zèbre larvaire et l’éponge sur la pointe de l’électrode d’enregistrement.
2. préparation de l’électrode
-
Préparer l’électrode d’enregistrement éponge en forme de cône.
- Couper l’extrémité mâle de l’extension de plomb d’électrode de platine et retirer de l’extrémité de 10 mm de l’enduit d’isolation polytétrafluoroéthylène externe à l’aide d’une lame de bistouri. Prendre soin de ne pas pour endommager le câble intérieur de la tête de l’électrode.
- Couper une longueur de 40 mm de fil d’argent (0,3 mm de diamètre) et fixez-la solidement à la tête de l’électrode par ville le fil d’argent avec le câble intérieur exposé. Envelopper l’articulation à l’aide d’un ruban isolant, laissant une longueur d’environ 15 mm de fil d’argent exposé (Figure 1 a).
- Plaquer le fil d’argent exposé chlorurées utilisant une source de V DC 9 pendant 60 s pour améliorer la conduction du signal. Plonger la pointe d’argent exposée dans une solution saline normale et branchez l’autre extrémité à la borne positive de la batterie. Connecter un autre fil sur la borne négative de la batterie et plonger l’autre extrémité du fil dans la saline2.
Remarque : Alternativement, la chloration du fil d’argent par trempage pendant 1 heure dans une solution d’eau de Javel (hypochlorite de sodium de l’ingrédient actif 42 g/L). - Couper un carré de PVA de ~ 20 x 20 mm à l’éponge avec des ciseaux pour faire un cône (Figure 1 a). Saturer l’éponge à l’aide de 1 x tampon de Ringer. Sous un microscope avec une barre d’échelle sur l’oculaire, utiliser une lame de bistouri pour façonner l’apex du cône ~ 40 µm de diamètre. Sécher à l’air l’éponge en forme de cône sur du papier absorbant jusqu'à ce qu’elle est solide.
Remarque : L’éponge PVA élargit considérablement lorsque saturé, il est donc important que l’éponge est tout d’abord saturé avec du sérum physiologique avant le sommet du cône de mise en forme. - Après chloration, sécher à l’air le fil d’argent sur un tissu absorbant pendant 5 min. insérer le fil d’argent dans l’éponge PVA séchée, solide, en forme de cône dans la base du cône. Isolez tout excès métal exposé à l’aide de ruban masque pour réduire les artefacts photovoltaïques (Figure 1 b-C).
Remarque : Après chaque session expérimentale, retirer le fil d’argent sur l’éponge. Laver l’éponge avec de l’eau osmosée et sécher à l’air pour la réutilisation. Pour assurer la perception de signal optimal, usage unique du fil d’argent est recommandé. PVA éponges ne devraient pas être réutilisés plus de 5 fois. - Le jour de l’expérience, plonger le bout de l’électrode d’enregistrement éponge dans 1 x tampon de Ringer au moins 15 min saturer complètement l’éponge.
- Préparer les électrodes de référence tel que décrit ci-dessus, mais sans y attacher la pointe éponge.
- Obtenir l’électrode de masse sur le marché.
3. préparation de poisson-zèbre
- Obscurité adapter des larves de poisson zèbre du jour au lendemain (> 8 h) avant les enregistrements en plaçant le poisson-zèbre dans un tube de 15 mL (< 20 larves par tube) enveloppé dans du papier d’aluminium dans un incubateur à foncé. Enlever le couvercle afin d’assurer un approvisionnement suffisant d’oxygène.
- Le jour de l’enregistrement, serrer le couvercle au tube falcon papillote contenant des larves, puis assurez-vous que le tube est opaque. Larves de transport vers le laboratoire de l’ERG.
- Verser le poisson dans des boîtes de pétri dans l’obscurité, avec l’aide de dim éclairage rouge par une diode électroluminescente (LED ; 17,4 cd.m-2, λmax 600 nm). Couvrir des boîtes de pétri à l’aide de serviettes opaque afin de minimiser l’exposition à la lumière.
4. préparation de la plate-forme de l’éponge
- Couper un rectangle d’éponge sèche de PVA pour s’adapter confortablement dans une boîte de pétri de 35 mm. Veiller à ce que l’épaisseur de l’éponge doit être à peu près égale à la profondeur de la boîte de pétri.
- Faire une petite incision verticale grâce à une extrémité de l’éponge pour accueillir le fil d’argent de l’électrode de référence.
- Faire tremper l’éponge PVA dans 1 x tampon de goldfish Ringer jusqu'à saturation. Ensuite, placez l’éponge dans une boîte de Petri propre 35 mm. Utilisez une serviette en papier pour absorber le liquide supplémentaire jusqu'à ce qu’aucune solution ne s’échappe de l’éponge en réponse à une pression de doigt léger.
5. animal et le positionnement des électrodes
- Anesthésier les larves à l’aide de tricaïne 0,02 % dilué dans 1 x tampon de goldfish Ringer.
- Utiliser une pipette Pasteur de 3 mL pour transférer une larve anesthésiée sur un carré de papier essuie-tout (~ 3 cm2).
- Placez la serviette en papier contenant la larve sur la plate-forme d’une éponge humide avec une pincette. Utilisez un pinceau trempé dans un tampon de Ringer pour ajuster la position de la larve. Veiller à ce qu’un œil fait face vers le haut, isolé de tout liquide à proximité sur la place du papier essuie-tout sous la larve.
- Nappez le corps larvaire, à l’exception de la tête, avec hydratation gel ophtalmique pour garder la larve humide tout au long de l’enregistrement de l’ERG.
- Placez la boîte de pétri avec la plate-forme de l’éponge sur une petite plate-forme, eau-chaude, devant le stimulus lumineux de Ganzfeld bol, situé à l’intérieur d’une cage de Faraday (Figure 1).
Remarque : Maintien de la température de l’éponge et de l’organe larvaire assure des signaux ERG stables. - Insérer l’électrode de référence dans la coupe faite dans l’éponge de la plate-forme (Figure 1).
- Connecter l’électrode de terre commercialement obtenus à la cage de Faraday.
- Fixer l’électrode d’enregistrement sur un porte-électrode et fixer le support sur le bras stéréotaxique d’un micromanipulateur (Figure 1). Utiliser une pipette Pasteur de 3 mL à s’écouler une goutte de solution de Ringer sur la pointe de l’éponge de l’électrode pour la re-saturation 1 x.
- Positionner le microscope dans la cage de Faraday sur la plate-forme de l’ERG pour le placement de l’électrode.
Remarque : Illumination prévoir par une diode rouge terne (17,4 cd.m-2, λmax 600 nm) pour permettre l’observation de la larve et le placement de l’électrode active, tout en maintenant dark-adaptation. - Ajustez la position de la plate-forme de l’éponge pour permettre l’observation de la larve sous le microscope. Ensuite, utilisez le papier absorbant pour enlever le liquide en excès de la pointe de l’électrode éponge.
- Positionnez l’électrode active de sorte qu’il touche doucement la surface centrale de la cornée de le œil de larves de poisson zèbre (Figure 1E).
- Déplacer le bol Ganzfeld vers la plate-forme de l’éponge et faire en sorte que la larve est couvert par le bol.
- Fermer la cage de Faraday pour réduire les bruits électromagnétiques.
6. enregistrement de l’électrorétinogramme
-
Utiliser le logiciel informatique du système ERG particulière (voir Table des matières pour plus de détails) pour déclencher le stimulus et d’acquisition de données basé sur les paramètres recommandés ci-dessous2.
- Définissez la fréquence d’échantillonnage du système à 4 KHz sur une ms 650 enregistrement fenêtre (2 560 points) dans le logiciel d’acquisition.
- Réglez le gain du système à 1 000 ×.
- La valeur de filtrage passe-bande du système à 1 – 300 Hz.
- Utiliser un filtre pour réduire 60 Hz (ou 50 Hz, en fonction de la fréquence des services publics locaux) bruit.
Remarque : Le niveau de bruit idéal ne doit être aucuns plus de ±10 µV.
-
Commencer la collecte de données à l’aide de la procédure décrite ci-dessous.
- Un seul essai-flash (0.06 log cd.s/m2) permet de mesurer une auscultation de le œil pour évaluer le positionnement des électrodes.
Remarque : Cette intensité du flash test devrait se traduire par une amplitude d’onde b supérieure à 25 µV en larves 4-dpf. Si une réponse fiable ne peut être mesurée, puis repositionner les électrodes et faire un autre test flash pour confirmer que les électrodes sont bien placés. - Après le test-éclair, laisser l’animal à l’obscurité s’adapter pendant 3 min dans l’obscurité complète avant d’enregistrements.
- Présenter des flashes de gradateur à des intensités lumineuses plus lumineuses.
- Moyenne des signaux à travers se répète selon le niveau de signal-bruit.
Remarque : En général, moyenne des signaux plus le variateur intensité lumineuse (pas moins de 3 répétitions) et moins des luminosités plus lumineuses (habituellement 1 motif). Allonger progressivement l’intervalle de inter-relance entre 10 et 60 s depuis le niveau de luminosité plus faible à la plus brillante. Un protocole d’échantillonnage est indiqué dans le tableau 1. - Après les enregistrements, humainement tuer les larves à l’aide de tricaïne 0,1 %.
- Un seul essai-flash (0.06 log cd.s/m2) permet de mesurer une auscultation de le œil pour évaluer le positionnement des électrodes.
7. analyse
- Mesurer l’amplitude d’une onde de base à l’auge a ondes négative et l’amplitude de l’onde b le creux d’une onde négative jusqu’au sommet de l’onde b positif.
- Mesurer les temps implicites d’ondes a et b entre l’apparition du stimulus pour le creux de la vague a et le pic de la vague b, respectivement.
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Representative Results
Cette section fournit des résultats représentatifs pour ERG mesures prises tous les jours de 4 à 7 dpf. 4 dpf, ERG réponses montrent robustes composants ondes a et b, qui résultent des photorécepteurs et les cellules bipolaires, respectivement. À chaque âge testé, l’amplitude de l’onde b augmente avec l’intensité de la lumière (Figure 2; Figure 3). En particulier, la sensibilité de la rétine de larves de poisson zèbre à variateur flashs augmentée avec l’âge. L’a-b-vague et n’étaient pas reconnaissable aux intensités inférieures aux-1.61 connecter cd.s/m2 à 4 dpf, alors que des signaux clairs étaient détectables à ces intensités pour les larves plus âgées (Figure 2). La réponse de b-vague a augmenté sensiblement entre 4 et 5 de dpf (P < 0,0001 ; Figure 2 a -B; Figure 3 b). Bien que la b-vague à des intensités plus faibles ont peu varié entre 5 et 7 dpf, le signal à 2,48 journal cd.s/m2 est plus élevée à 7 dpf comparé avec dpf 5 et 6 (P < 0,0001 ; Figure 2 ; Figure 3 b). Fois implicite A - et b-ondes est devenu beaucoup plus rapides après 5 dpf (P < 0,0001 ; Figure 3 -D). Dans l’ensemble, ces résultats démontrent la maturation de la fonction rétinienne zebrafish entre 4 à 7 dpf. Fait intéressant, l’amplitude de l’onde a semblé diminuer de 5 à 7 dpf (Figure 3 a). C’est peut-être parce que la maturation des connexions synaptiques dans la rétine externe raccourcit le temps de latence des réponses des cellules bipolaires, ayant pour résultat plus rapide apparition de b-vague qui masque l’onde a. Ceux qui souhaitent étudier les ondes a peuvent employer un traitement pharmacologique pour bloc réponses post-photoreceptoral (c'est-à-dire la composante b-vague).
Figure 1 : poisson-zèbre G anzfeld ERG mis en place avec l’électrode embout éponge en forme de cône. Embout (A) l’éponge en forme de cône et l’électrode d’argent chloré sont séchés avant de construire l’électrode embout éponge à l’air. (B-C) Par la suite, le fil d’argent chloré est inséré dans le cône de l’éponge à travers la base pour former l’électrode complète. (D) dans la configuration de Ganzfeld ERG zebrafish larvaire typique, l’électrode de référence est inséré dans la plate-forme de l’éponge et la larve de poisson-zèbre est couvert par le bol de Ganzfeld. (E), le bout de l’éponge électrode touche doucement la surface cornéenne centrale de le œil larvaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : représentative moyenne ERG traces de poissons zèbres larvaire sauvage. Moyenne des traces ERG du poisson-zèbre de type sauvage en (A) 4 dpf (n = 8), (B) 5 dpf (n = 8), (C) 6 dpf (n = 7) et (D), 7 dpf (n = 9). Réponses ont été provoquées à l’aide d’éclairs de LEDs blanches. À chaque âge, les traces présenter des réactions à des éclairs (de bas en haut)-2.75,-2.11,-1.61, -0,81, 0,06, 0,72, 1.55, 1,89, 2.18, 2,48 Connectez-vous cd.s/m2. Echelle = 50 µV. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : amplitudes des ondes a et b ERG et implicite pour 4 à 7 dpf zebrafish. (A) moyenne (± erreur-type de la moyenne) du groupe a-onde amplitude augmente avec l’intensité du flash, mais diminuait avec l’âge chez les larves de dpf 4 – 7. Amplitude moyenne b-vague (B) 4 – 7 dpf larves augmente avec l’intensité du flash ; amplitude a augmenté entre 4 et 5 de dpf. (C) moyenne par ondes temps implicite et (D) b-vague moyenne implicite est devenu plus rapide entre dpf 5, 6 et 7. Lignes de régression sont dérivés de régression non linéaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Intensité lumineuse de stimulus (journal cd.s.m-2) | Nombre de répétitions | Intervalle de relance inter (s) |
| -2.75 | 3 à 6 | 10 |
| (30 s avant prochain) | ||
| -2.11 | 3 à 6 | 10 |
| (30 s avant prochain) | ||
| -1.61 | 3 à 6 | 10 |
| (30 s avant prochain) | ||
| -0,81 | 3 à 6 | 10 |
| (60 s avant prochain) | ||
| 0,06 | 3 à 6 | 10 |
| (60 s avant prochain) | ||
| 0,72 | 1 à 3 | 60 |
| 1.55 | 1 à 3 | 60 |
| 1.89 | 1 à 3 | 60 |
| 2.18 | 1 à 3 | 60 |
| 2.48 | 1 à 3 | 60 |
Tableau 1 : Protocole d’exemple d’enregistrements ERG. Présentations de relance début de niveau minimal (haut) et en progrès à plus brillante luminosité (en bas), avec des intervalles de relance inter progressivement plus à assurer le que maintien de cette adaptation sombre. Le nombre de signaux a chaque intensité moyenne dépend du niveau de signal-bruit.
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Discussion
Affichages fonctionnels tels que l’ERG ont pris une important croissante à la suite d’outils utilisés pour l’étude des larves de poisson zèbre8,9,12,14. En raison de l’exiguïté de le œil de larves de poisson zèbre, micropipettes de verre ont été adaptées comme l’enregistrement des électrodes en plus publiées protocoles3,4,5,8,9 , 12 , 13 , 14. les auteurs décrivent ici un protocole GRE de larves de poisson zèbre utilisant une électrode de pointe éponge en forme de cône plus simple. La nouvelle électrode peut être utilisé pour modifier les systèmes standard de ERG des petits animaux pour évaluer la fonction rétinienne de larves de poisson zèbre sans aucun équipement supplémentaire. Les matériaux pour la fabrication de l’électrode de pointe éponge sont simplement commerciales PVA éponge et fil de 0,3 mm argent, ce qui en fait plus économiques que les approches précédentes. Un autre avantage est que, contrairement à la pointe de la micropipette dures et coupantes, pointe d’éponge de l’électrode plus douce est moins susceptible d’endommager le œil larvaire. Enfin, l’éponge PVA aide à maintenir l’humidité à le œil larve tout au long de l’enregistrement.
La clé pour une application réussie de l’électrode de pointe éponge est d’assurer la saturation complète de l’éponge. Cela prend normalement pas moins de 15 minutes de trempage dans 1 x tampon de goldfish Ringer. Saturation incomplète de l’éponge peut augmenter le niveau de bruit grâce à un séchage plus rapide de l’électrode. Pour améliorer la collecte de signal, faisant de nouvelles électrodes pour chaque session expérimentale (généralement de 8 h <) est fortement recommandée. Recours répété peut entraîner réduite des signaux ERG, complique les comparaisons inter sessions.
Lorsqu’on place le poisson-zèbre larvaire sur la plate-forme de l’éponge, il faut pour s’assurer que le œil à mesurer n’est pas en contact avec n’importe quelle solution environnante ou l’essuie-tout sous le poisson. Un tel contact short circuit électrique, car l’électrode de référence est intégré dans la plate-forme de l’éponge et réduit l’ERG.
Même avec les conseils d’électrodes bien saturée d’éponge, assèchement progressif se produit, qui est évident, comme l’augmentation du bruit dans les signaux de l’ERG. Dans ce cas, laisser couler une goutte de 1 x poisson rouge de sonnerie sur la base du cône à l’aide de la seringue de 1 mL et une aiguille 30 x ½". Si vous ajoutez à que la solution à la pointe de l’éponge ne réduit pas le niveau de bruit, vérifiez que le œil n’est pas en contact avec un fluide environnant et veiller à ce que la pointe de l’électrode est centrée sur l’apex cornéen.
Les enregistrements dans les résultats représentatifs présentés ici ont été faites avec un paramètre de bande passante de 1 à 300 Hz, ce qui ne permet pas d’échantillonnage des potentiels oscillatoires (OP) — ondelettes sur les ondes de b dérivé du tiers-ordre neurones rétiniens y compris les cellules amacrines et ganglion 15,16,17. Un paramètre de filtre passe-bas plus élevé (p. ex., 500 ou 1 000 Hz) peut être mieux adapté pour l’enregistrement de l’OP.
En résumé, l’électrode embout éponge en forme de cône permet de simplifier l’enregistrement ERG de larves de poisson zèbre à des systèmes existants de ERG petits animaux, fournissant des résultats fiables. Résultats représentatifs démontrent que ERG amplitude croît entre 4 et 5 dpf, avec davantage de maturation entre 5 et 7 dpf se manifestant par des temps plus rapides implicites. Notre protocole d’ERG simple avec l’électrode économique et pratique en forme de cône éponge-pointe peut bénéficier les enquêteurs étudient la fonction rétinienne de poisson-zèbre. La technique peut également être adaptée pour évaluer le poisson-zèbre adulte ou autres vertébrés modèles avec petits yeux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucune divulgation pertinente à ce travail.
Acknowledgments
Ce projet a été financé par une subvention de l’Institut de neurosciences de Melbourne (pour PTG, PRJ & BVB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
| 1 mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
| 30 G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
| Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
| Circulation water bath | Lauda-Ko?nigshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
| Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
| Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
| Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
| Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
| Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
| PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
| Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
| Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
| Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
| Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |
References
- Roper, C., Tanguay, R. L. Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. , Academic Press. 143-151 (2018).
- Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. , e54158 (2016).
- Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae. Journal of visualized expriment: JoVE. (97), (2015).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C.
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot4973 (2008).
- Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C., Kohler, K. Synaptic plasticity and functionality at the cone terminal of the developing zebrafish retina. Developmental Neurobiololgy. 56 (3), 222-236 (2003).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Developmental Neurobiololgy. 72 (3), 302-327 (2012).
- Saszik, S., Bilotta, J., Givin, C. M. ERG assessment of zebrafish retinal development. Visual Neuroscience. 16 (5), 881-888 (1999).
- Niklaus, S., et al. Cocaine accumulation in zebrafish eyes leads to augmented amplitudes in the electroretinogram. Matters. 3 (6), e201703000003 (2017).
- Tanvir, Z., Nelson, R. F., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic ERG. Disease models & mechanisms. , dmm. 035220 (2018).
- Kakiuchi, D., et al. Oscillatory potentials in electroretinogram as an early marker of visual abnormalities in vitamin A deficiency. Molecular medicine reports. 11 (2), 995-1003 (2015).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Zebrafish larvae lose vision at night. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 205-210 (2004).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Developmental Dynamics. 222 (4), 564-570 (2001).
- Cameron, M. A., Barnard, A. R., Lucas, R. J. The electroretinogram as a method for studying circadian rhythms in the mammalian retina. Journal of genetics. 87 (5), 459-466 (2008).
- Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. Extraction and modelling of oscillatory potentials. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 17-36 (2002).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. The Journal of Physiology. 555 (1), 153-173 (2004).
