Summary
Qui, presentiamo un protocollo che semplifica la misurazione della luce dell'elettroretinogramma evocato le risposte dallo zebrafish larvale. Un elettrodo di romanzo spugna a forma di cono-Punta può contribuire a rendere lo studio di sviluppo visivo in zebrafish larvale utilizzando l'elettroretinogramma ERG più facile raggiungere con risultati attendibili e costi inferiori.
Abstract
Il danio zebrato (Danio rerio) è comunemente usato come un modello di vertebrati in studi evolutivi ed è particolarmente adatto per le neuroscienze visual. Per misure funzionali di prestazioni visive, l'elettroretinografia (ERG) è un metodo non invasivo ideale, che è stato affermato in specie di vertebrati superiori. Questo approccio è sempre più utilizzato per l'esame della funzione visiva in zebrafish, inclusi durante le prime fasi dello sviluppo larvale. Tuttavia, l'elettrodo di registrazione più comunemente usati per zebrafish larvale ERG fino ad oggi è l'elettrodo di una micropipetta di vetro, che richiede attrezzature specializzate per la sua fabbricazione, che presenta una sfida per i laboratori con risorse limitate. Qui, presentiamo un protocollo ERG larvale zebrafish utilizzando un elettrodo di spugna-punta a forma di cono. Il romanzo dell'elettrodo è più facile fabbricazione e maniglia, più economico e meno probabilità di danneggiare l'occhio larvale rispetto la micropipetta di vetro. Come metodi ERG precedentemente pubblicati, l'attuale protocollo è in grado di valutare la funzione retinica esterna attraverso dei fotorecettori e risposte delle cellule bipolari, l'a - e b-onda, rispettivamente. Il protocollo può illustrare chiaramente la raffinatezza della funzione visiva in tutto lo sviluppo iniziale delle larve di zebrafish, sostenendo l'utilità, la sensibilità e l'affidabilità dell'elettrodo romanzo. L'elettrodo semplificata è particolarmente utile quando organismo di modello che istituisce un nuovo sistema ERG o modifica esistente apparato ERG di piccoli animali per la misura di zebrafish, aiutando i ricercatori nelle neuroscienze visual utilizzare zebrafish.
Introduction
Il danio zebrato (Danio rerio) è diventato un ampiamente usato modello genetico di vertebrati, compreso gli studi di neuroscienze visual. La crescente popolarità di questa specie può essere attribuita ai vantaggi tra cui la facilità di manipolazione genetica, il sistema visual vertebrati altamente conservato (tipi di neurone, morfologia anatomica e organizzazione e genetica sottostante), alta fecondità e ridurre il costo di allevamento rispetto a modelli mammiferi1. Non invasivo elettroretinogramma (ERG) lungo è stato utilizzato clinicamente per valutare la funzione visiva umana e in ambito di laboratorio per quantificare la visione in una gamma di specie piccole e grandi, tra cui roditori e larvale zebrafish2,3 , 4 , 5. i componenti ERG più comunemente analizzati sono la a onda e b-fluttua, proveniente dalla luce-sensing fotorecettori e bipolare interneuroni, rispettivamente. In zebrafish larvale, strati distinti nella retina sono stabiliti dalla post-fecondazione 3 giorni (dpf) e la morfologia del cono fotorecettore terminale sinapsi maturo prima 4 dpf6,7. Funzione esterna della retina di zebrafish larvale è così stabilita prima 4 dpf, significato che l'ERG è misurabile da questa tenera età in poi. A causa del breve ciclo sperimentale e le proprietà di alto-rendimento del modello, l'ERG è stato applicato a larvale zebrafish per valutazione funzionale dei modelli di malattia, analizzando lo sviluppo di colore, visione e retinico, studiando i ritmi circadiani visual e test farmaci8,9,10,11,12.
Tuttavia, approcci attuali per zebrafish larvale ERG ha alcune complessità che possono rendere più difficile ad adottare. Zebrafish larvale pubblicate ERG protocolli comunemente utilizzano una micropipetta di vetro riempita con liquido conduttivo come la registrazione dell'elettrodo3,4,5,13, che richiede una micropipetta di alta qualità Suggerimento3. Attrezzature specializzate, come ad esempio un estrattore micropipetta e in alcuni casi una microforge, sono necessari per la loro fabbricazione. Questo può essere una sfida per i laboratori con risorse limitate e conduce a un costo aggiuntivo anche quando adattamento disponibili sistemi per ERG piccoli animali per la misurazione della funzione visiva zebrafish larvale. Anche quando levigata, la punta della micropipetta taglienti possa danneggiare la superficie dell'occhio larvale. Inoltre, i titolari delle imprese micropipetta per elettrofisiologia sono costruiti con un filo d'argento fisso. Questi fissi fili diventano passivati dopo uso ripetitivo, che richiede l'acquisto di nuovi supporti di costi di manutenzione maggiore.
Qui descriviamo un metodo ERG utilizzando un elettrodo di registrazione di spugna-punta a forma di cono, che è particolarmente utile per l'adeguamento stabilito piccoli animali ERG configurazioni per le misurazioni di ERG di zebrafish larvale. L'elettrodo è fatta facilmente utilizzando comune spugna di acetato di polivinile (PVA) e filo di argento fine senza qualsiasi altre attrezzature specializzate. I nostri dati indicano che questo romanzo elettrodo è sensibile e affidabile abbastanza per dimostrare lo sviluppo funzionale dei circuiti neurali retinici in zebrafish larvale tra 4 e 7 dpf. Questo elettrodo economico e pratico spugna-suggerimento può essere utile ai ricercatori che istituisce nuovi sistemi di ERG o la modifica di sistemi esistenti di piccoli animali, per gli studi di zebrafish.
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Protocol
Tutte le procedure di elettroretinogramma (ERG) sono state eseguite secondo le disposizioni del codice Australian National Health and Medical Research Council di pratica per la cura e l'uso di animali e sono state approvate dal comitato di etica animale istituzionale presso il Università di Melbourne.
1. preparazione buffer
- Preparare il tampone pesce rosso Ringer 10x (1,25 M di NaCl, KCl di 26 mM, 25 mm CaCl2, 10mm MgCl2, glucosio di 100 mM, 100 mM HEPES) utilizzando acqua ad osmosi inversa (RO). Regolare il tampone a pH 7,8 e sterilizzare il buffer utilizzando il filtro di 0,22 μm. Memorizzare il buffer 10x a 4 ° C come la soluzione stock3.
Nota: Il tampone Ringer 10x deve essere utilizzato entro 3 mesi. - Il giorno dell'esperimento, fanno di goldfish Ringer 1x diluendo il 10x buffer di goldfish Ringer utilizzando acqua ad osmosi inversa.
Nota: 1x buffer di goldfish Ringer è utilizzato per saturare la spugna PVA, tra cui la spugna usata per il posizionamento di zebrafish larvale e la spugna sulla punta dell'elettrodo di registrazione.
2. elettrodo preparazione
-
Preparare l'elettrodo di registrazione di spugna a forma di cono.
- Tagliare l'estremità maschio dall'estensione di piombo per l'elettrodo di platino e rimuovere dall'estremità 10 mm del rivestimento di isolamento esterno politetrafluoroetilene usando un bisturi. Fare attenzione a non per danneggiare il filo interno del cavo dell'elettrodo.
- Tagli una lunghezza di 40 mm di filo d'argento (0,3 mm di diametro) e questo fissare saldamente al cavo elettrodo di intrecciando il filo d'argento con il filo interno esposto. Racchiudere il giunto con nastro isolante, lasciando una lunghezza di ~ 15 mm di filo d'argento esposto (Figura 1A).
- Placcare il filo d'argento esposto con cloruro utilizzando un'origine V DC 9 per 60 s per migliorare la conduzione del segnale. Immergere la punta d'argento esposta in salino normale e collegare l'altra estremità al terminale positivo della batteria. Collegare un altro cavo al terminale negativo della batteria e immergere l'altra estremità del filo nei Salina2.
Nota: In alternativa, cloro il filo d'argento ad immersione per 1 ora in una soluzione di candeggina (ipoclorito di sodio di ingrediente attivo 42 g/L). - Tagliare un quadrato di PVA ~ 20 x 20 mm spugna usando le forbici per fare un cono (Figura 1A). Saturare la spugna utilizzando 1x buffer di Ringer. Sotto un microscopio con una barra di scala sull'oculare, è necessario utilizzare un bisturi per modellare l'apice del cono a ~ 40 µm di diametro. Asciugare all'aria la spugna a forma di cono sul tessuto di carta assorbente fino a quando non è solido.
Nota: La spugna PVA si espande in modo significativo quando satura, quindi è importante che la spugna prima è saturo con soluzione fisiologica prima modellatura all'apice del cono. - Dopo chloriding, asciugare all'aria il filo d'argento su un panno assorbente per 5 min, Inserisci il filo d'argento in spugna di PVA secco, solida, a forma di cono attraverso la base del cono. Isolare qualsiasi metallo esposto in eccesso utilizzando nastro maschera per ridurre gli artefatti di fotovoltaici (Figura 1B-C).
Nota: Dopo ogni sessione sperimentale, togliere la spugna del filo d'argento. Lavare la spugna utilizzando acqua ad osmosi inversa e lasciare asciugare all'aria per il riutilizzo. Per garantire la raccolta di segnale ottimale, è consigliabile monouso di filo d'argento. Spugne PVA non dovrebbero essere riutilizzati più di 5 volte. - Il giorno dell'esperimento, immergere la spugna-punta dell'elettrodo registrazione 1x buffer di Ringer per almeno 15 min saturare completamente la spugna.
- Preparare gli elettrodi di riferimento come descritto sopra, ma senza allegare la punta di spugna.
- Ottenere l'elettrodo di terra commercialmente.
3. Zebrafish preparazione
- Scuro adattare larve di zebrafish durante la notte (> 8 h) prima di registrazioni inserendo zebrafish in una provetta da 15 mL (< 20 larve per tubo) avvolto in carta stagnola in un incubatore scuro. Togliere il coperchio per assicurare un'adeguata ossigenazione.
- Il giorno della registrazione, stringere il coperchio per il tubo di falcon cartoccio contenente larve e assicurarsi che il tubo sia a prova di luce. Larve di trasporto al laboratorio di ERG.
- Versare il pesce nei piatti Petri nel buio con l'aiuto di illuminazione dim rosso da un diodo a emissione luminosa (LED; 17,4 cd.m-2, λmax 600 nm). Coprire di Petri utilizzando gli asciugamani a prova di luce per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.
4. spugna piattaforma preparazione
- Tagliare un rettangolo di spugna PVA asciutta per adattarsi comodamente in una capsula di Petri da 35 mm. Assicurarsi che lo spessore della spugna dovrebbe essere all'incirca uguale alla profondità del piatto petri.
- Fare un piccolo taglio in verticale attraverso un'estremità della spugna per accogliere il filo d'argento dell'elettrodo di riferimento.
- Immergere la spugna PVA in 1x tampone di goldfish Ringer fino alla saturazione. Quindi, posizionare la spugna in una capsula Petri pulito 35 mm. Utilizzare un tovagliolo di carta per assorbire il liquido supplementare fino a quando nessuna soluzione trasuda dalla spugna in risposta ad una pressa di luce dito.
5. animali e posizionamento elettrodi
- Anestetizzare le larve utilizzando tricaina 0,02%, diluito in tampone di goldfish Ringer 1x.
- Utilizzare una pipetta Pasteur da 3 mL per trasferire una larva anestetizzata in un quadratino di carta assorbente (~ 3 cm2).
- Posizionare il tovagliolo di carta contenente la larva sulla piattaforma spugna umida usando il forcipe. Utilizzare un pennello fine imbevuto nel buffer di Ringer per regolare la posizione della larva. Garantire che un occhio rivolta verso l'alto, isolato da qualsiasi liquido vicina sulla Piazza del tovagliolo di carta sotto la larva.
- Smalto del corpo larvale, escludendo la testa, con eye gel per mantenere la larva umido durante la registrazione di ERG idratante.
- Posizionare la capsula di Petri con piattaforma di spugna su una piccola piattaforma di acqua riscaldata fronte il Ganzfeld ciotola stimolo luminoso situato all'interno di una gabbia di Faraday (Figura 1).
Nota: Mantenimento della temperatura del corpo larvale e la spugna garantisce segnale stabile di ERG. - Inserire l'elettrodo di riferimento il taglio effettuato nella spugna piattaforma (Figura 1).
- Collegare l'elettrodo di terra commercialmente ottenuti per la gabbia di Faraday.
- Collegare l'elettrodo di registrazione ad un titolare di elettrodo e fissare il supporto al braccio stereotassica di un micromanipolatore (Figura 1). Utilizzare una pipetta Pasteur da 3 mL per gocciolare una goccia di soluzione di Ringer sulla punta dell'elettrodo per ri-saturazione spugna 1x.
- Posizionare il microscopio nella gabbia di Faraday sopra la piattaforma ERG per il posizionamento dell'elettrodo.
Nota: Illuminazione dovrebbe essere fornita da un LED rosso dim (17,4 cd.m-2, λmax 600 nm) per permettere l'osservazione della larva e il posizionamento dell'elettrodo attivo, pur mantenendo dark-adaptation. - Regolare la posizione della piattaforma spugna per permettere l'osservazione della larva sotto il microscopio. Quindi, utilizzare tessuto assorbente per rimuovere il liquido in eccesso dalla punta di spugna dell'elettrodo.
- Posizionare l'elettrodo attivo unirla delicatamente la superficie corneale centrale dell'occhio zebrafish larvale (Figura 1E).
- Spostare la ciotola Ganzfeld verso la piattaforma di spugna e assicurarsi che la larva è coperto dalla ciotola.
- Chiudere la gabbia di Faraday per ridurre rumore elettromagnetico estraneo.
6. elettroretinogramma registrazione
-
Utilizzare il software per computer del particolare sistema ERG (per dettagli, vedere tabella materiali) per innescare lo stimolo e acquisire dati basato sulle impostazioni consigliate sotto2.
- Impostare la frequenza di campionamento del sistema a 4 KHz sopra un ms 650 registrazione finestra (2.560 punti) del software di acquisizione.
- Impostare il guadagno del sistema a 1.000 ×.
- Impostare il filtro passa-banda del sistema a 1-300 Hz.
- Utilizzare un filtro notch per ridurre 60 Hz (o 50 Hz, a seconda della frequenza della rete locale) rumore.
Nota: Il livello di rumore ideale non dovrebbe essere più di ± 10 µV.
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Inizio raccolta dati utilizzando la procedura descritta di seguito.
- Utilizzare un singolo flash di prova (0.06 registro cd.s/m2) per misurare una risposta di prova dall'occhio per valutare il posizionamento degli elettrodi.
Nota: Questa intensità del lampo di prova dovrebbe provocare un b-fluttua l'ampiezza maggiore di 25 µV a 4-dpf larve. Se una risposta forte non può essere misurata, quindi riposizionare gli elettrodi e fare un altro test flash per confermare che gli elettrodi siano ben posizionati. - Dopo il lampo di prova, permettere all'animale di buio adattare per 3 min in completa oscurità prima di registrazioni.
- Presente lampeggia da dimmer a intensità di luce più luminosa.
- Media segnali attraverso ripetizioni in base al livello di segnale-rumore.
Nota: In generale, media più segnali a livello luce dimmer (non meno di 3 ripetizioni) e meno presso i livelli di luce più luminosi (solitamente 1 ripetizione). Allungare gradualmente l'intervallo Inter-stimolo da 10 a 60 s dal livello di luce più debole alla più chiara. Un protocollo di esempio è illustrato nella tabella 1. - Dopo le registrazioni, umanamente uccidere larve utilizzando tricaina 0,1%.
- Utilizzare un singolo flash di prova (0.06 registro cd.s/m2) per misurare una risposta di prova dall'occhio per valutare il posizionamento degli elettrodi.
7. analisi
- Misurare l'ampiezza di un onda dal basale alla depressione a onda negativa e b-fluttua l'ampiezza dal trogolo di un onda negativo per il picco di b-onda positiva.
- Misurare i tempi di implicita di a - e b-fluttua dall'inizio di stimolo per la depressione a-onda e il picco dell'onda-b, rispettivamente.
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Representative Results
Questa sezione fornisce risultati rappresentativi per ERG misurazioni effettuate ogni giorno da 4 a 7 dpf. Da 4 dpf, ERG risposte mostrano robusti componenti di onde a e b, che derivano da fotorecettori e cellule bipolari, rispettivamente. A ogni età testati, l'ampiezza delle onde b aumentato con intensità della luce (Figura 2; Figura 3). In particolare, la sensibilità della retina larvale zebrafish per dimmer lampi aumentato con l'età. L'a - e b-onda non erano riconoscibile a intensità inferiore-1.61 log cd.s/m2 a 4 dpf, mentre chiari segnali erano rilevabili a queste intensità per larve di età superiore (Figura 2). La risposta di b-fluttua crebbe sostanzialmente tra 4 e 5 dpf (P < 0,0001; Figura 2A -B; Figura 3B). Anche se il b-wave a bassa intensità ha presentato scarse variazioni tra 5 e 7 dpf, il segnale a 2,48 registro cd.s/m2 era maggiore a 7 dpf rispetto con dpf 5 e 6 (P < 0,0001; Figura 2; Figura 3B). Tempi impliciti A - e b-fluttua è diventato significativamente più veloce dopo il dpf 5 (P < 0,0001; Figura 3 -D). Nel complesso, questi risultati dimostrano la maturazione della funzione retinica di zebrafish tra dpf 4 a 7. Interessante, l'ampiezza di un onda è sembrato fare diminuire da 5 a 7 dpf (Figura 3A). Questo può essere perché la maturazione delle connessioni sinaptiche in retina esterna riduce la latenza delle risposte delle cellule bipolari, con conseguente inizio di b-fluttua più veloce che mascheri l'onda a. Coloro che desiderano studiare le onde a-può impiegare il trattamento farmacologico per blocca le risposte post-photoreceptoral (cioè la componente di b-fluttua).
Figura 1: Zebrafish G anzfeld ERG istituito con l'elettrodo di spugna-punta a forma di cono. (A), la spugna a forma di cono Punta e l'elettrodo d'argento clorurato sono essiccato prima di costruire l'elettrodo di spugna-tip. (B-C) Successivamente, il filo d'argento clorurato viene inserito il cono di spugna attraverso la base per formare l'elettrodo completa. (D) nel setup Ganzfeld ERG tipico zebrafish larvale, l'elettrodo di riferimento viene inserito nella piattaforma spugna e la larva di zebrafish è coperto dalla ciotola Ganzfeld. Elettrodo (E), la spugna-punta tocca delicatamente la superficie corneale centrale dell'occhio larvale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: tracce ERG media rappresentativo di selvaggio-tipo larvale zebrafish. Media ERG tracce di zebrafish wildtype al punto (A) 4 dpf (n = 8), (B) 5 dpf (n = 8), (C) 6 dpf (n = 7) e (D) 7 dpf (n = 9). Le risposte sono state suscitate utilizzando Flash a LED bianchi. A ogni età, le tracce mostrano risposte lampi di (dal basso verso l'alto)-2.75,-2.11,-1.61,-0.81, 0,06, 0,72, 1,55, 1.89, 2.18, 2,48 accedere cd.s/m2. Barra della scala = 50 µV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: ERG a - e b-fluttua le ampiezze e tempi impliciti per 4 a 7 dpf zebrafish. (A) media (± errore standard della media) del gruppo a-onda di ampiezza aumentata con intensità del flash, ma è diminuito con l'età nelle larve dpf 4 – 7. (B) b-onda media ampiezza a 4 – 7 dpf larve è aumentato con l'intensità del flash; ampiezza è cresciuta tra il 4 e 5 dpf. (C) a-onda media ora di implicita e (D) b-onda media implicita è diventato più veloce tra dpf 5, 6 e 7. Linee di regressione sono derivati da regressione non lineare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Intensità dello stimolo luminoso (registro cd.s.m-2) | Numero di ripetizioni | Intervallo di Inter-stimolo (s) |
| -2.75 | 3-6 | 10 |
| (30 s prima del prossimo) | ||
| -2.11 | 3-6 | 10 |
| (30 s prima del prossimo) | ||
| -1.61 | 3-6 | 10 |
| (30 s prima del prossimo) | ||
| -0.81 | 3-6 | 10 |
| (60 s prima del prossimo) | ||
| 0,06 | 3-6 | 10 |
| (60 s prima del prossimo) | ||
| 0,72 | 1 a 3 | 60 |
| 1,55 | 1 a 3 | 60 |
| 1,89 | 1 a 3 | 60 |
| 2.18 | 1 a 3 | 60 |
| 2.48 | 1 a 3 | 60 |
Tabella 1: Protocollo di esempio delle registrazioni ERG. Presentazioni di stimolo a partire dal più debole (in alto) e il progresso ai livelli di luce più luminosi (in basso), con progressivamente più inter-stimolo intervalli per garantire che tale adattamento scuro viene mantenuta. Il numero di segnali in media ad ogni intensità dipende il livello di segnale-rumore.
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Discussion
Letture di funzionali quali l'ERG sono diventati sempre più importanti in una suite di strumenti utilizzati per lo studio di zebrafish larvale8,9,12,14. A causa delle piccole dimensioni dell'occhio larvale zebrafish, micropipette di vetro sono state adattate come elettrodi di registrazione pubblicato più protocolli3,4,5,8,9 , 12 , 13 , 14. Qui descriviamo un protocollo ERG larvale zebrafish utilizzando un elettrodo a forma di cono spugna-punta più semplice. L'elettrodo romanzo può essere utilizzato per modificare sistemi ERG piccoli animali standard per misurare la funzione retinica di zebrafish larvale senza apparecchiature aggiuntive. I materiali per la fabbricazione dell'elettrodo di spugna-punta sono semplicemente commerciale spugna di PVA e 0,3 mm argento filo, che lo rende più economico rispetto agli approcci precedenti. Un altro vantaggio è che, in contrasto con la punta della micropipetta duro e tagliente, la punta di spugna più delicata dell'elettrodo è meno probabilità di danneggiare l'occhio larvale. Infine, la spugna PVA aiuta a mantenere l'umidità all'occhio larvale durante la registrazione.
La chiave per la riuscita applicazione dell'elettrodo spugna-punta è garantire la piena saturazione della spugna. Questo normalmente richiede non meno di 15 minuti di ammollo in 1x tampone di goldfish Ringer. Saturazione incompleta della spugna può aumentare il livello di rumore a causa di asciugatura più rapida dell'elettrodo. Per la migliore raccolta di segnale, facendo nuovi elettrodi per ogni sessione sperimentale (generalmente < 8 h) è altamente consigliato. L'uso ripetuto può portare a ridotti segnali ERG, rendendo più difficile il confronto Inter-sessione.
Quando si posiziona il larvale zebrafish sulla piattaforma di spugna, si deve prestare attenzione per assicurarsi che l'occhio da misurare non sia a contatto con qualsiasi soluzione circostante o il tovagliolo di carta sotto il pesce. Tale contatto pantaloncini il circuito elettrico, come l'elettrodo di riferimento è incorporato nella piattaforma spugna e riduce l'ERG.
Anche con suggerimenti di spugna elettrodo ben saturi, essiccazione graduale si verifica, che è evidente come aumento del rumore nei segnali di ERG. In questo caso, gocciolare una goccia di goldfish 1x Ringer sulla base del cono usando la siringa da 1 mL e un ago 30 x ½". Se aggiungendo che la soluzione fino alla punta di spugna non riduce il livello di rumore, controllare che l'occhio non è in contatto con un liquido circostante e assicurarsi che la punta dell'elettrodo è centrata sull'apice cornea.
Le registrazioni nei risultati rappresentativi riportati qui sono state fatte con l'impostazione passa-banda 1 – 300 Hz, che non consente il campionamento dei potenziali oscillatori (OP) — wavelet sul b-wave derivato dai neuroni retinici terzo ordine compreso amacrine e gangliari cellule 15,16,17. Un'impostazione superiore passa-basso (ad es., 500 o 1.000 Hz) potrebbe essere più adatta per la registrazione di OP.
In sintesi, l'elettrodo di spugna-punta a forma di cono consente di semplificare la registrazione ERG zebrafish larvale con sistemi esistenti di ERG di piccoli animali, fornendo risultati affidabili. Risultati rappresentativi dimostrano che ERG ampiezza cresce tra dpf 4 e 5, con ulteriore maturazione tra 5 e 7 dpf che si manifesta come più veloce tempi impliciti. Il nostro protocollo ERG semplice con l'elettrodo economico e pratico a forma di cono spugna-punta possa beneficiare investigatori studiando la funzione retinica di zebrafish. La tecnica può anche essere adattata per valutare zebrafish adulto o altri modelli vertebrati con piccoli occhi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nessuna informazioni integrative relative a questo lavoro.
Acknowledgments
Finanziamento per questo progetto è stato fornito da una sovvenzione dell'Istituto di neuroscienze di Melbourne (di PTG, PRJ & BVB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
| 1 mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
| 30 G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
| Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
| Circulation water bath | Lauda-Ko?nigshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
| Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
| Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
| Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
| Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
| Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
| PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
| Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
| Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
| Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
| Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |
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