Summary

Electroretinogram opptak i larver sebrafisk bruker A Novel koniske svamp-tip elektrode

Published: March 27, 2019
doi:

Summary

Her presenterer vi en protokoll som forenkler måling av lys vakte electroretinogram svar fra larver sebrafisk. En roman koniske svamp-tip elektrode kan bidra til å gjøre studiet av visuell utvikling i larver sebrafisk bruker electroretinogram ERG lettere å oppnå med pålitelige resultater og lavere kostnader.

Abstract

Sebrafisk (Danio rerio) brukes ofte som virveldyr modell i utviklingsmessige studier og er spesielt egnet for visuell nevrovitenskap. For funksjonelle målinger av visuell ytelse er electroretinography (ERG) en ideell ikke-invasiv metode, som er godt etablert i høyere virveldyr arter. Denne fremgangsmåten brukes stadig mer for å undersøke funksjonen visuelle i sebrafisk, inkludert under de tidlige utviklingsmessige larver stadiene. Den mest brukte opptak elektroden for larver sebrafisk ERG hittil er imidlertid glass brønnene elektroden, som krever spesialisert utstyr for fremstillingen, presentere en utfordring for laboratorier med begrensede ressurser. Her presenterer vi en larver sebrafisk ERG protokollen bruker en kjegle-formet svamp-tip elektrode. Romanen elektroden er lettere å produksjon og håndtak, mer økonomisk, og mindre sannsynlig å skade larver øyet enn glass brønnene. Som tidligere publiserte ERG metoder, kan gjeldende protokollen vurdere ytre netthinnefunksjon gjennom photoreceptor og bipolar celle svar, a – og b-bølgen, henholdsvis. Protokollen kan tydelig illustrere avgrensningen av visuelle funksjon i den tidlige utviklingen av sebrafisk larvene, støtter det verktøyet, følsomhet og pålitelig romanen elektroden. Forenklet elektroden er spesielt nyttig når etablere et nytt ERG system eller endre eksisterende liten-dyr ERG apparater for sebrafisk måling, hjelpe forskere i visuelle neurosciences bruke sebrafisk modell organisme.

Introduction

Sebrafisk (Danio rerio) har blitt en brukte genetisk virveldyr modellen, inkludert studier av visuelle neurosciences. Den økende populariteten til denne arten kan tilskrives fordeler inkludert enkel genetisk manipulasjon, høyt konservert virveldyr visuelle systemet (Nevron typer, anatomisk morfologi og organisasjon og underliggende genetikk), høy fruktbarhet og lavere kostnader rettsgrunnlag sammenlignet pattedyr modeller1. Den ikke-invasiv electroretinogram (ERG) har lenge vært brukt klinisk å vurdere menneskelige visuelle funksjon, og i laboratorium innstillingen å kvantifisere visjon i en rekke små og store arter inkludert gnagere og larver sebrafisk2,3 , 4 , 5. oftest analysert ERG komponentene er en bølge og b-bølge, som stammer fra lys-sensing fotoreseptorer og bipolar interneurons, henholdsvis. I larver sebrafisk, forskjellige lag i netthinnen er etablert av 3 dager etter befruktning (dpf) og morfologi av photoreceptor membran terminal synapser modne før 4 dpf6,7. Ytre retinal funksjon av larver sebrafisk er dermed etablert før 4 dpf, betyr at ERG er målbare fra denne tidlig alder og utover. På grunn av korte eksperimentelle syklusen og egenskapene høy gjennomstrømming for modellen, har ERG blitt brukt til larver sebrafisk funksjonelle vurdering av sykdom modeller, analysere fargen syn og retinal utvikling, studere visuelle døgnrytme og testing narkotika8,9,10,11,12.

Gjeldende metoder for larver sebrafisk ERG har imidlertid noen kompleksiteten som kan gjøre det vanskeligere å adoptere. Publisert larver sebrafisk ERG protokoller bruker vanligvis glass brønnene fylt med ledende væske som opptak elektrode3,4,5,13, som krever høy kvalitet brønnene tips3. Spesialisert utstyr, som en brønnene avtrekker og i noen tilfeller en microforge, kreves for TVer. Dette kan være en utfordring for laboratorier med begrensede ressurser og fører til ekstra kostnader selv når tilpasse tilgjengelige liten dyr ERG systemer for måling av larver sebrafisk visuelle funksjon. Selv når glattet kan skarpe brønnene spissen skade overflaten av larver øyet. I tillegg, er kommersiell brønnene holdere for elektrofysiologi bygget med en fast sølv wire. Disse faste ledninger bli paddivert etter repeterende bruk krever kjøp av nye fører til økt vedlikeholdskostnader.

Her beskriver vi en ERG metoden ved hjelp av en kjegle-formet svamp-tip opptak elektrode, som er spesielt nyttig for å tilpasse etablerte liten-dyr ERG oppsett for larver sebrafisk ERG målinger. Elektroden gjøres enkelt ved hjelp av vanlige polyvinylacetat (PVA) svamp og fint sølv wire uten andre spesialiserte utstyr. Våre data viser at denne romanen elektrode sensitiv og pålitelig nok å demonstrere funksjonelle utviklingen av netthinnen nevrale kretser i larver sebrafisk mellom 4 og 7 dpf. Dette økonomisk og praktisk svamp-tip elektrode kan være nyttig for forskerne å etablere nye ERG systemer eller endre eksisterende liten-dyr systemer for sebrafisk studier.

Protocol

Alle electroretinogram (ERG) prosedyrer ble utført i henhold til bestemmelsene i den australske National Health and Medical Research Council anbefaling for omsorg og bruk av dyr og ble godkjent av institusjonelle dyreetikk på den Universitetet i Melbourne. 1. buffer forberedelse Forberede 10 x gullfisk Ringer i bufferen (1,25 M NaCl, 26 mM KCl, 25 mm CaCl2, 10 mM MgCl2, 100 mM glukose, 100 mM HEPES) bruke omvendt osmose (RO) vann. Juster buffer til pH 7,8 og s…

Representative Results

Denne delen gir ERG målinger tatt daglig fra 4 til 7 dpf representant resultater. Fra 4 dpf viser ERG svar robust a – og b-bølge komponenter, som oppstår fra fotoreseptorer og bipolar celler, henholdsvis. I hver alder testet, amplituden til b-bølge økt med lav intensitet (figur 2; Figur 3). Spesielt følsomheten av larver sebrafisk netthinnen til dimmer blinker økt med alderen. A – og b-bølgen var ikke gjenkjennelig på intensiteter la…

Discussion

Funksjonell readouts som ERG har blitt stadig viktigere i suite av verktøy som brukes til å studere larver sebrafisk8,9,12,14. På grunn av den lille størrelsen på larver sebrafisk øyet, har glass Mikropipetter blitt tilpasset som spiller inn elektrodene i mest publiserte protokoller3,4,5,</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finansiering for prosjektet ble levert av en bevilgning fra Melbourne nevrovitenskap Institute (til PTG, PRJ & BVB).

Materials

0.22 µm filter Millex GP SLGP033RS Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio
1-mL syringe Terumo DVR-5175 With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.
30G × ½" needle Terumo NN*3013R For adding saline toteh sopnge tip electrode.
Bioamplifier ADInstruments ML135 For amplifying ERG signals.
Bleach solution  King White 9333441000973 For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.
Circulation water bath Lauda-Königshoffen MGW Lauda Used to make the water-heated platfrom.
Electrode lead Grass Telefactor F-E2-30 Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.
Faraday Cage Photometric Solution International  For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.
Ganzfeld Bowl Photometric Solution International  Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.
Luxeon LEDs Phillips Light Co. For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.
Micromanipulator Harvard Apparatus BS4 50-2625 Holds the recording electrode during experiments.
Microsoft Office Excel Microsoft version 2010 Spreadsheet software for data analysis.
Moisturizing eye gel GenTeal Gel 9319099315560 Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.
Pasteur pipette Copan 200C Used to caredully transfer larval zebrafish.
Powerlab data acquisition system ADInstruments ML785 Controls the LEDs to generate stimuli.
PVA sponge MeiCheLe R-1675 For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti
Saline solution Aaxis Pacific 13317002 For electroplating silver wire electrode.
Scope Software ADInstruments version 3.7.6 Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data
Silver (fine round wire) A&E metal 0.3 mm Used to make recording and reference ERG electrodes.
Stereo microscope  Leica M80 Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.
Tricaine  Sigma-aldrich E10521-50G For anaethetizing larval zebrafish.
Water-heated platform custom-made For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings

References

  1. Roper, C., Tanguay, R. L., Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. . Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). , 143-151 (2018).
  2. Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. , e54158 (2016).
  3. Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae. Journal of visualized expriment: JoVE. (97), (2015).
  4. Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 57-68 (2002).
  5. Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  6. Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C., Kohler, K. Synaptic plasticity and functionality at the cone terminal of the developing zebrafish retina. Developmental Neurobiololgy. 56 (3), 222-236 (2003).
  7. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Developmental Neurobiololgy. 72 (3), 302-327 (2012).
  8. Saszik, S., Bilotta, J., Givin, C. M. ERG assessment of zebrafish retinal development. Visual Neuroscience. 16 (5), 881-888 (1999).
  9. Niklaus, S., et al. Cocaine accumulation in zebrafish eyes leads to augmented amplitudes in the electroretinogram. Matters. 3 (6), e201703000003 (2017).
  10. Tanvir, Z., Nelson, R. F., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic ERG. Disease models & mechanisms. , (2018).
  11. Kakiuchi, D., et al. Oscillatory potentials in electroretinogram as an early marker of visual abnormalities in vitamin A deficiency. Molecular medicine reports. 11 (2), 995-1003 (2015).
  12. Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Zebrafish larvae lose vision at night. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).
  13. Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 205-210 (2004).
  14. Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Developmental Dynamics. 222 (4), 564-570 (2001).
  15. Cameron, M. A., Barnard, A. R., Lucas, R. J. The electroretinogram as a method for studying circadian rhythms in the mammalian retina. Journal of genetics. 87 (5), 459-466 (2008).
  16. Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. Extraction and modelling of oscillatory potentials. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 17-36 (2002).
  17. Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. The Journal of Physiology. 555 (1), 153-173 (2004).

Play Video

Cite This Article
Xie, J., Jusuf, P. R., Goodbourn, P. T., Bui, B. V. Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode. J. Vis. Exp. (145), e59487, doi:10.3791/59487 (2019).

View Video