Her presenterer vi en protokoll som forenkler måling av lys vakte electroretinogram svar fra larver sebrafisk. En roman koniske svamp-tip elektrode kan bidra til å gjøre studiet av visuell utvikling i larver sebrafisk bruker electroretinogram ERG lettere å oppnå med pålitelige resultater og lavere kostnader.
Sebrafisk (Danio rerio) brukes ofte som virveldyr modell i utviklingsmessige studier og er spesielt egnet for visuell nevrovitenskap. For funksjonelle målinger av visuell ytelse er electroretinography (ERG) en ideell ikke-invasiv metode, som er godt etablert i høyere virveldyr arter. Denne fremgangsmåten brukes stadig mer for å undersøke funksjonen visuelle i sebrafisk, inkludert under de tidlige utviklingsmessige larver stadiene. Den mest brukte opptak elektroden for larver sebrafisk ERG hittil er imidlertid glass brønnene elektroden, som krever spesialisert utstyr for fremstillingen, presentere en utfordring for laboratorier med begrensede ressurser. Her presenterer vi en larver sebrafisk ERG protokollen bruker en kjegle-formet svamp-tip elektrode. Romanen elektroden er lettere å produksjon og håndtak, mer økonomisk, og mindre sannsynlig å skade larver øyet enn glass brønnene. Som tidligere publiserte ERG metoder, kan gjeldende protokollen vurdere ytre netthinnefunksjon gjennom photoreceptor og bipolar celle svar, a – og b-bølgen, henholdsvis. Protokollen kan tydelig illustrere avgrensningen av visuelle funksjon i den tidlige utviklingen av sebrafisk larvene, støtter det verktøyet, følsomhet og pålitelig romanen elektroden. Forenklet elektroden er spesielt nyttig når etablere et nytt ERG system eller endre eksisterende liten-dyr ERG apparater for sebrafisk måling, hjelpe forskere i visuelle neurosciences bruke sebrafisk modell organisme.
Sebrafisk (Danio rerio) har blitt en brukte genetisk virveldyr modellen, inkludert studier av visuelle neurosciences. Den økende populariteten til denne arten kan tilskrives fordeler inkludert enkel genetisk manipulasjon, høyt konservert virveldyr visuelle systemet (Nevron typer, anatomisk morfologi og organisasjon og underliggende genetikk), høy fruktbarhet og lavere kostnader rettsgrunnlag sammenlignet pattedyr modeller1. Den ikke-invasiv electroretinogram (ERG) har lenge vært brukt klinisk å vurdere menneskelige visuelle funksjon, og i laboratorium innstillingen å kvantifisere visjon i en rekke små og store arter inkludert gnagere og larver sebrafisk2,3 , 4 , 5. oftest analysert ERG komponentene er en bølge og b-bølge, som stammer fra lys-sensing fotoreseptorer og bipolar interneurons, henholdsvis. I larver sebrafisk, forskjellige lag i netthinnen er etablert av 3 dager etter befruktning (dpf) og morfologi av photoreceptor membran terminal synapser modne før 4 dpf6,7. Ytre retinal funksjon av larver sebrafisk er dermed etablert før 4 dpf, betyr at ERG er målbare fra denne tidlig alder og utover. På grunn av korte eksperimentelle syklusen og egenskapene høy gjennomstrømming for modellen, har ERG blitt brukt til larver sebrafisk funksjonelle vurdering av sykdom modeller, analysere fargen syn og retinal utvikling, studere visuelle døgnrytme og testing narkotika8,9,10,11,12.
Gjeldende metoder for larver sebrafisk ERG har imidlertid noen kompleksiteten som kan gjøre det vanskeligere å adoptere. Publisert larver sebrafisk ERG protokoller bruker vanligvis glass brønnene fylt med ledende væske som opptak elektrode3,4,5,13, som krever høy kvalitet brønnene tips3. Spesialisert utstyr, som en brønnene avtrekker og i noen tilfeller en microforge, kreves for TVer. Dette kan være en utfordring for laboratorier med begrensede ressurser og fører til ekstra kostnader selv når tilpasse tilgjengelige liten dyr ERG systemer for måling av larver sebrafisk visuelle funksjon. Selv når glattet kan skarpe brønnene spissen skade overflaten av larver øyet. I tillegg, er kommersiell brønnene holdere for elektrofysiologi bygget med en fast sølv wire. Disse faste ledninger bli paddivert etter repeterende bruk krever kjøp av nye fører til økt vedlikeholdskostnader.
Her beskriver vi en ERG metoden ved hjelp av en kjegle-formet svamp-tip opptak elektrode, som er spesielt nyttig for å tilpasse etablerte liten-dyr ERG oppsett for larver sebrafisk ERG målinger. Elektroden gjøres enkelt ved hjelp av vanlige polyvinylacetat (PVA) svamp og fint sølv wire uten andre spesialiserte utstyr. Våre data viser at denne romanen elektrode sensitiv og pålitelig nok å demonstrere funksjonelle utviklingen av netthinnen nevrale kretser i larver sebrafisk mellom 4 og 7 dpf. Dette økonomisk og praktisk svamp-tip elektrode kan være nyttig for forskerne å etablere nye ERG systemer eller endre eksisterende liten-dyr systemer for sebrafisk studier.
Funksjonell readouts som ERG har blitt stadig viktigere i suite av verktøy som brukes til å studere larver sebrafisk8,9,12,14. På grunn av den lille størrelsen på larver sebrafisk øyet, har glass Mikropipetter blitt tilpasset som spiller inn elektrodene i mest publiserte protokoller3,4,5,</s…
The authors have nothing to disclose.
Finansiering for prosjektet ble levert av en bevilgning fra Melbourne nevrovitenskap Institute (til PTG, PRJ & BVB).
0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
1-mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
30G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
Circulation water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |