스폰지 팁 전극 A 소설 원추형을 사용 하 여 애벌레 Zebrafish에 기록 하는 Electroretinogram

Summary

여기, 선물이 애벌레 zebrafish에서 빛 갖는 electroretinogram 응답의 측정을 간소화 하는 프로토콜. 소설 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극에 electroretinogram를 사용 하 여 신뢰할 수 있는 결과 낮은 비용으로 달성 하기 쉽게 하는 애벌레 zebrafish에 시각적 개발의 연구를 만들기 위해 도울 수 있다.

Abstract

제 브라 (Danio rerio) 발달 연구에서 척추 모형으로 일반적으로 사용 되 고 특히 시각적인 신경 과학에 대 한 적합 합니다. 비주얼 퍼포먼스의 기능 측정, electroretinography (에) 더 높은 척 추가 있는 종에서 잘 설립 되었습니다 이상적인 비-침략 적 방법입니다. 이 접근은 점점 zebrafish, 초기 단계에서 발달 애벌레 포함에 시각적 기능을 검토를 위해 사용 되 고 있습니다. 그러나, 애벌레 zebrafish에 날짜에 대 한 가장 일반적으로 사용 되 기록 전극 유리 제 micropipette 전극 제조, 한정 된 자원을 가진 실험실에 대 한 과제를 제시에 대 한 특수 장비를 필요로 하는. 여기, 선물이 애벌레 zebrafish에 프로토콜 사용 하 여 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극. 새로운 전극 제조 및 핸들, 더 경제적이 고 유리 제 micropipette 보다 애벌레 눈 손상 가능성이 쉽습니다. 이전에 게시에 방법 처럼 현재 프로토콜 각각 포토 리셉터와 양극 세포 응답, a-와 b-파도를 통해 외부 망막 기능을 평가할 수 있습니다. 프로토콜은 zebrafish 애벌레, 지원 유틸리티, 감도, 및 새로운 전극의 신뢰성의 초기 개발을 통해 시각적 기능의 상세를 설명 명확 하 게 수 있습니다. 단순화 된 전극 새로운 르 그 시스템 구축 또는 기존 작은 동물에 장치는 제 브라를 사용 하 여 시각적인 신경 과학 연구자를 돕고 zebrafish 측정에 대 한 수정 모델 유기 체 때 특히 유용 하다.

Introduction

제 브라 (Danio rerio) 시각적인 신경 과학의 연구를 포함 하 여 널리 유전 척추 모델 되고있다. 이 종족의 증가 인기 유전자 조작, 높은 보존된 척추 영상 시스템 (신경, 해부학 적 형태와 조직, 형식과 기본 유전학), 높은 통치의 용이성 등 장점을 표시 될 수 있습니다. 그리고 축산 포유류 모델¹에 비해 저렴 한 비용. 비-침략 적 electroretinogram (에) 오래 사용 되었습니다 임상 인간의 시각 기능을 평가 하 고 비전의 크고 작은 설치류 등 애벌레 zebrafish^2,3 범위에서 계량을 실험실 속 ^{, 4 , 5}. 가장 일반적으로 분석된에 구성 요소는 a 파와 b 파, 빛 감지 대뇌와 바이 폴라 수에서 발생 하는 각각. 애벌레 zebrafish, 망막에 뚜렷한 레이어 3 일 후 수정 (dpf)에 의해 설립 되 고 터미널 포토 리셉터 콘의 형태학 synapses 4 dpf^6,7전....

Protocol

모든 electroretinogram (에) 절차 동물의 사용 그리고 배려에 대 한 호주 국민 건강 및 의료 연구 위원회 코드의 규정에 따라 수행 했다와 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 된 멜버른의 대학입니다.

1. 버퍼 준비

1. 준비 하는 금붕어 벨의 버퍼 (1.25 M NaCl, KCl 26mm, 25mm CaCl₂, 10 m m MgCl₂, 100 mM 포도 당, 100 mM HEPES) x 10 역삼 투 (RO) 물을 사용 하 여. PH 7.8에 버퍼를 조정 하 고 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 버퍼를 소독. 4 ° C에서 10 배 버퍼 솔루션 주식³으로 저장 합니다.
   참고: 벨의 버퍼 x 10은 3 개월 이내에 사용 되어야 한다.
2. 실험 당일, 역방향 삼 투 물을 사용 하 여 금붕어 벨의 버퍼 x 10을 diluting 하 여 금붕어 벨의 버퍼 x 1을 확인 합니다.
   참고: 금붕어 벨의 버퍼 x 1는 PVA 스폰지, 스폰지 애벌레 zebrafish의 배치에 대 한 사용을 포함 하 여 그리고 기록 전극 끝에 스폰지를 포화 하는 데 사용 됩니다.<....

Results

이 섹션에 측정 한 매일 4에서 7 dpf에 대 한 대표적인 결과를 제공 합니다. 4 dpf에 응답 강력한 a-와 b-파 구성 요소, 각각 대뇌와 양극 세포에서 발생 하는 표시. 각 나이에 테스트, b 파의 진폭 증가 빛의 강도 (그림 2; 그림 3). 특히, 나 이와 함께 증가 하는 주차 섬광에 애벌레 zebrafish 망막의 감도. A-와 b-웨이브 명확한 신호 했다 더 오래 된 애벌레 (그림 2)에 대 한 이러한 농도에 탐지 하는 반면-1.61 cd.s/m² 4 dpf, 로그 보다 낮은 농도에서 인식할 수 없었다. B 파 응답 4와 5의 dpf 사이 크게 성장 (P < 0.0001; 그림 2A -B;

Discussion

에 르 그 같은 기능 해독 애벌레 zebrafish^8,9,,1214를 공부 하는 데 사용 하는 도구 제품군에 점점 더 중요 한 되 고 있습니다. 작은 크기로 인해 애벌레 zebrafish 눈의, 유리 micropipettes 전극 가장 게시 프로토콜^3,4,5,,89 에 기록으로 적응 되어 ^{, 12 , .......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 & 마이크로; m 필터	Millex GP	SLGP033RS	필터 10× 살균 용 금붕어 링거의 버퍼
1 mL 주사기	Terumo	DVR-5175	30G × ½ " 바늘을 사용하여 전극 스폰지 팁에 식염수 방울을 추가하여 ERG 신호의 건조 및 노이즈 증가를 방지합니다.
30 G &시간; ½ " 바늘	Terumo	NN*3013R	식염수 toteh sopnge 팁 전극을 추가합니다.
바이오앰프	ADInstruments	ML135ERG	신호 증폭용.
표백제 솔루션	King White	9333441000973	은색 전극 염소화의 대체 방법. 활성 성분 : 42g / L 차아 염소산 나트륨.
순환 수조	Lauda-Ko?nigshoffen	MGW Lauda	온수 플랫폼을 만드는 데 사용됩니다.
전극 리드	Grass Telefactor	F-E2-30	은선 전극을 증폭기에 연결하기 위한 백금 케이블.
패러데이 케이지	측광 솔루션 국제		신호 대 잡음비를 개선하기 위해 어두운 적응을 유지하고 Ganzfeld 설정을 포함합니다.
Ganzfeld Bowl	광도 측정 솔루션 International		맞춤형으로 설계된 광 자극기: 직경 36mm, 조리개 크기 13cm.
Luxeon LED	필립스 라이트 Co.		광 자극용: 20개의 5W 및 1개의 1W LED.
Micromanipulator	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	실험 중 기록 전극을 잡습니다.
Microsoft Office Excel	Microsoft	버전 2010	데이터 분석을 위한 스프레드시트 소프트웨어.
모이스처라이징 아이 젤	GenTeal Gel	9319099315560	탈수를 방지하기 위해 녹음 중 제브라피쉬 유충을 덮는 데 사용됩니다. 활성 성분 : 0.3 % Hypromellose 및 0.22 % carbomer 980.
파스퇴르 피펫	Copan	200C	유충 제브라피쉬를 조심스럽게 옮기는 데 사용됩니다.
파워랩 데이터 수집 시스템	ADInstruments	ML785	LED를 제어하여 자극을 생성합니다.
PVA 스폰지	MeiCheLe	R-1675	유충 제브라 피쉬의 배치 및 원뿔 모양의 전극 ti
식염수 용액	Aaxis Pacific	13317002	은선 전극 전기 도금을 위해.
Scope Software	ADInstruments	버전 3.7.6	Powerlab 시스템을 통해 자극을 동시에 트리거하고 데이터
Silver (가는 원형 와이어)	A& E 금속	0.3mm	ERG 전극을 기록하고 참조하기 위해 사용됩니다.
실체 현미경	라이카	M80	원뿔 모양의 스폰지 정점(접안렌즈에 눈금 막대 포함)의 모양을 만들고 측정하는 데 사용됩니다. 전극 배치를 위해 패러데이 케이지에 배치됩니다.
트리카인	시그마-알드리치	E10521-50G	제브라피쉬 유충 마취용.
수온식 플랫폼	맞춤 제작		ERG 기록 중 스폰지 플랫폼과 유충 몸체의 온도를 유지하기 위해