Summary
여기, 선물이 애벌레 zebrafish에서 빛 갖는 electroretinogram 응답의 측정을 간소화 하는 프로토콜. 소설 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극에 electroretinogram를 사용 하 여 신뢰할 수 있는 결과 낮은 비용으로 달성 하기 쉽게 하는 애벌레 zebrafish에 시각적 개발의 연구를 만들기 위해 도울 수 있다.
Abstract
제 브라 (Danio rerio) 발달 연구에서 척추 모형으로 일반적으로 사용 되 고 특히 시각적인 신경 과학에 대 한 적합 합니다. 비주얼 퍼포먼스의 기능 측정, electroretinography (에) 더 높은 척 추가 있는 종에서 잘 설립 되었습니다 이상적인 비-침략 적 방법입니다. 이 접근은 점점 zebrafish, 초기 단계에서 발달 애벌레 포함에 시각적 기능을 검토를 위해 사용 되 고 있습니다. 그러나, 애벌레 zebrafish에 날짜에 대 한 가장 일반적으로 사용 되 기록 전극 유리 제 micropipette 전극 제조, 한정 된 자원을 가진 실험실에 대 한 과제를 제시에 대 한 특수 장비를 필요로 하는. 여기, 선물이 애벌레 zebrafish에 프로토콜 사용 하 여 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극. 새로운 전극 제조 및 핸들, 더 경제적이 고 유리 제 micropipette 보다 애벌레 눈 손상 가능성이 쉽습니다. 이전에 게시에 방법 처럼 현재 프로토콜 각각 포토 리셉터와 양극 세포 응답, a-와 b-파도를 통해 외부 망막 기능을 평가할 수 있습니다. 프로토콜은 zebrafish 애벌레, 지원 유틸리티, 감도, 및 새로운 전극의 신뢰성의 초기 개발을 통해 시각적 기능의 상세를 설명 명확 하 게 수 있습니다. 단순화 된 전극 새로운 르 그 시스템 구축 또는 기존 작은 동물에 장치는 제 브라를 사용 하 여 시각적인 신경 과학 연구자를 돕고 zebrafish 측정에 대 한 수정 모델 유기 체 때 특히 유용 하다.
Introduction
제 브라 (Danio rerio) 시각적인 신경 과학의 연구를 포함 하 여 널리 유전 척추 모델 되고있다. 이 종족의 증가 인기 유전자 조작, 높은 보존된 척추 영상 시스템 (신경, 해부학 적 형태와 조직, 형식과 기본 유전학), 높은 통치의 용이성 등 장점을 표시 될 수 있습니다. 그리고 축산 포유류 모델1에 비해 저렴 한 비용. 비-침략 적 electroretinogram (에) 오래 사용 되었습니다 임상 인간의 시각 기능을 평가 하 고 비전의 크고 작은 설치류 등 애벌레 zebrafish2,3 범위에서 계량을 실험실 속 , 4 , 5. 가장 일반적으로 분석된에 구성 요소는 a 파와 b 파, 빛 감지 대뇌와 바이 폴라 수에서 발생 하는 각각. 애벌레 zebrafish, 망막에 뚜렷한 레이어 3 일 후 수정 (dpf)에 의해 설립 되 고 터미널 포토 리셉터 콘의 형태학 synapses 4 dpf6,7전에 성숙. 애벌레 zebrafish의 외부 망막 기능 따라서 4 dpf는 르 그 이후이 이른 나이에서 측정 가능한 것을 의미 하기 전에 설정 됩니다. 짧은 실험 주기 모델의 높은 처리량 속성 때문에 르 그에 적용 된 애벌레 zebrafish 질환 모델의 기능 평가 위한 컬러 비전 및 망막 개발 분석, 시각적 circadian 리듬 공부 그리고8,,910,,1112마약 테스트.
그러나, 애벌레 zebrafish에 대 한 현재 접근에 채택 하기 어렵게 만들 수 있는 몇 가지 복잡 한 있다. 일반적으로 기록 전극3,,45,13, 고품질 micropipette 필요로 하로 전도성 액체로 채워진 유리 제 micropipette를 사용 하 여 게시 된 애벌레 zebrafish에 프로토콜 팁3. 특수 장비, micropipette 끌어당기는 등 및 microforge, 어떤 경우에는 그들의 제조에 대 한 필요 합니다. 이 한정 된 자원 가진 실험실에 대 한 도전이 될 수 있습니다 그리고 애벌레 zebrafish 시각적 기능의 측정을 위해 사용할 수 있는 작은 동물에 시스템에 적응 하는 경우에 추가 비용을 리드. 부드럽게 하는 경우에 날카로운 micropipette 팁 애벌레 눈의 표면을 손상 수 있습니다. 또한, 전기 생리학에 대 한 상업 micropipette 홀더 고정된 실버 와이어로 구성 됩니다. 이러한 전선 고정 증가 유지 보수 비용을 선도 하는 새로운 소유자의 구입을 요구 하는 반복 사용 후 패 된다.
여기는 원뿔 모양의 스폰지 팁 기록 전극, 애벌레 zebrafish에 측정에 대 한 설립된 작은 동물에 설정을 적응에 특히 유용 합니다을 사용 하 여 르 그 방법에 설명 합니다. 전극 일반적인 폴 리 비닐 아세테이트 (PVA) 스폰지 및 기타 특수 장비 없이 괜 찮 실버 와이어를 사용 하 여 쉽게 이루어집니다. 우리의 데이터는이 새로운 전극 민감하고 안정적 4와 7 dpf 사이 애벌레 zebrafish에 망막 신경 회로의 기능 개발을 설명 하는 보여준다. 이 경제적이 고 실용적인 스폰지 팁 전극 연구원 새로운 르 그 시스템을 구축 또는 기존 작은 동물 시스템, zebrafish 연구에 대 한 수정에 유용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 electroretinogram (에) 절차 동물의 사용 그리고 배려에 대 한 호주 국민 건강 및 의료 연구 위원회 코드의 규정에 따라 수행 했다와 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 된 멜버른의 대학입니다.
1. 버퍼 준비
- 준비 하는 금붕어 벨의 버퍼 (1.25 M NaCl, KCl 26mm, 25mm CaCl2, 10 m m MgCl2, 100 mM 포도 당, 100 mM HEPES) x 10 역삼 투 (RO) 물을 사용 하 여. PH 7.8에 버퍼를 조정 하 고 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 버퍼를 소독. 4 ° C에서 10 배 버퍼 솔루션 주식3으로 저장 합니다.
참고: 벨의 버퍼 x 10은 3 개월 이내에 사용 되어야 한다. - 실험 당일, 역방향 삼 투 물을 사용 하 여 금붕어 벨의 버퍼 x 10을 diluting 하 여 금붕어 벨의 버퍼 x 1을 확인 합니다.
참고: 금붕어 벨의 버퍼 x 1는 PVA 스폰지, 스폰지 애벌레 zebrafish의 배치에 대 한 사용을 포함 하 여 그리고 기록 전극 끝에 스폰지를 포화 하는 데 사용 됩니다.
2. 전극 준비
-
원뿔 모양의 스폰지 기록 전극 준비.
- 백 금 전극 리드 확장에서 남성 끝을 잘라 고 10mm 메스 블레이드를 사용 하 여 외부 소계 절연 코팅의 끝에서 제거 합니다. 알아서 하지 전극 리드의 내부 와이어를 손상.
- 실버 와이어 (0.3 m m 직경)의 40 m m 길이 잘라 하 고 안전 하 게 노출된 내부 와이어와 함께 실버 와이어 entwining 여 이것을 전극 리드에 연결. 실버 와이어 노출 (그림 1A)의 ~ 15 m m 길이 떠나 단 열 테이프를 사용 하 여 관절을 싸는.
- 60 9 V DC 소스를 사용 하 여 염화와 노출된은 와이어를 전기 도금 신호 전도 개선 하기 위해 s. 일반적인 염 분에 노출 된 실버 팁을 담가 그리고 배터리의 긍정적인 터미널에 다른 쪽 끝을 연결. 배터리의 부정적인 터미널에 다른 와이어를 연결 하 고 염 분2로 와이어의 다른 쪽 끝을 담가.
참고: 또는, 표 백제 솔루션 (활성 성분 42 g/L 나트륨도 발견 됐 죠)에 1 시간 동안 그것을 몸을 담글 하 여 실버 와이어 인터네셔널. - PVA의 ~ 20 m m x 20 m m 스퀘어 콘 (그림 1A)를가 위를 사용 하 여 스폰지를 잘라. 벨의 버퍼 x 1를 사용 하 여 스폰지 포화. 접 안 렌즈에 눈금 막대와 현미경, 메스 블레이드 사용 하 여 모양 ~ 40 µ m 직경 원뿔의 꼭대기. 공기 건조 흡수 성 종이 조직에 원뿔 모양의 스폰지까지 고체.
참고: PVA 스폰지 포화 상당히 확장, 따라서 원뿔의 꼭대기를 형성 하기 전에 스폰지 염 분으로 포화 처음은 중요 하다. - Chloriding, 후 공기 건조 5 분 삽입에 대 한 흡수 성 조직에 실버 와이어는 콘의 기지를 통해 건조, 고체, 원뿔 모양의 PVA 스폰지에 실버 와이어. 어떤 과잉 노출된 금속 태양광 아티팩트 (그림 1B-C)을 줄이기 위해 마스크 테이프를 사용 하 여 보 온.
참고: 각 실험 세션 후 실버 와이어에서 스펀지를 제거 합니다. 재사용에 대 한 역방향 삼 투 물 및 건조 공기를 사용 하 여 스폰지를 씻어. 최적의 신호 컬렉션을 보장 하기 위해 실버 와이어의 단일 사용은 권장 된다. PVA 스폰지 5 번 이상 재사용 하지. - 실험의 날, 벨의 버퍼 완전히 스폰지를 포화 하 적어도 15 분 동안 x 1으로 기록 전극의 스폰지 팁을 담가.
- 스폰지 팁을 연결 하지 않고도 하지만, 위에서 설명한 대로 참조 전극을 준비 합니다.
- 접지 전극을 상업적으로 가져옵니다.
3. 제 브라 준비
- 다크 적응 zebrafish 애벌레 하룻밤 (> 8 h) 15 mL 튜브에 zebrafish를 배치 하 여 녹음 전에 (< 튜브 당 20 애벌레) 어두운 인큐베이터에 알루미늄 호 일에 싸여. 충분 한 산소 공급을 보장 하기 위해 뚜껑을 제거 합니다.
- 녹화 당일, 애벌레를 포함 하는 호 일에 싸서 팔 콘 튜브에 뚜껑을 강화 하 고 튜브 빛-증거 인지 확인 합니다. 애벌레에 연구소를 전송 합니다.
- 발광 다이오드 (LED; 17.4 cd.m-2, λ최대 600 nm)에서 희미 한 붉은 조명으로 어둠 속에서 배양 접시에 생선을 붓는 다. 광선이 수건을 사용 하 여 가벼운 노출을 최소화 하기 위해 접시를 커버.
4. 스폰지 플랫폼 준비
- 35 mm 페 트리 접시에 snugly에 맞게 건조 PVA 스폰지의 사각형 컷. 스폰지의 두께 페 트리 접시의 깊이를 대략 동일 해야 확인 하십시오.
- 기준 전극의 실버 와이어에 맞게 스폰지의 한쪽 끝을 통해 수직으로 작은 상처를 확인 하십시오.
- 금붕어 벨의 버퍼 포화 될 때까지 x 1에 PVA 스폰지를 적시 게. 그런 다음, 깨끗 한 35 mm 페 트리 접시에 스폰지를 놓습니다. 솔루션 가벼운 손가락 보도에 대 한 응답에 스폰지에서 발산 될 때까지 여분의 액체를 흡수 하는 종이 타월을 사용 합니다.
5. 동물 및 전극 위치
- 애벌레 금붕어 벨의 버퍼 x 1에 희석 0.02 %tricaine 사용 하 여 anesthetize
- 3 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 전송 종이 타월 (2~ 3 cm)의 광장에는 마 취 유 충.
- 집게를 사용 하 여 촉촉한 스폰지 플랫폼에 유 충을 포함 하는 종이 타월을 놓습니다. 벨의 버퍼에 배어 좋은 브러시를 사용 하 여 유 충의 위치를 조정. 그 한쪽 눈 위쪽으로 직면 유 충 아래 종이 타월의 광장에서 가까운 액체에서 고립 된 확인 합니다.
- 유 충에 녹음을 통해 촉촉한 유지 하 아이 젤 보습과 머리를 제외 하 고 애벌레 몸 유약.
- 패러데이 케이지 (그림 1D) 안에 위치한 Ganzfeld 그릇 빛 자극 앞 작은 물이 열 플랫폼에 스폰지 플랫폼 페 트리 접시를 놓습니다.
참고: 스폰지와 애벌레 시체의 온도의 유지 보수 안정 르 그 신호를 보장합니다. - 플랫폼 스폰지 (그림 1D)에서 만든 컷에 참조 전극을 삽입 합니다.
- 패러데이 케이지를 상업적으로 얻은 접지 전극을 연결 합니다.
- 전극 홀더를 기록 전극 연결 및 보안 stereotaxic 팔 micromanipulator (그림 1D)의 홀더. 3 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 다시 채도 대 한 전극의 스폰지 팁에 벨의 솔루션 x 1의 한 방울을 똑.
- 전극의 배치에 대 한 르 그 플랫폼 위에 패러데이 케이지 현미경을 놓습니다.
참고: 조명은 dark-adaptation를 유지 하면서 dim 적색 LED (17.4 cd.m-2, λ최대 600 nm) 유 충의 관측을 허용 하 고 활성 전극의 배치에 의해 제공 되어야 한다. - 현미경 애벌레의 관찰 수 있도록 스폰지 플랫폼의 위치를 조정 합니다. 다음, 흡수 성 직물을 사용 하 여 전극 스폰지 팁에서 과잉 액체를 제거.
- (그림 1E) 애벌레 zebrafish 눈의 중앙 각 막 표면을 부드럽게 이어지도록 합니다 활성 전극 위치.
- Ganzfeld 그릇 스폰지 플랫폼으로 이동 하 고 유 충은 그릇에 의해 보호 확인 합니다.
- 외부 전자기 소음을 줄이기 위해 패러데이 케이지를 닫습니다.
6. Electroretinogram 기록
-
특정에 시스템의 컴퓨터 소프트웨어를 사용 하 여 자극을 실행 하 고 데이터를2아래 권장 하는 설정에 따라 (자세한 재료의 표 참조).
- 수집 소프트웨어에서 창 (2, 560 점)을 기록 한 650 ms 이상 4 KHz을 시스템의 샘플링 속도 설정 합니다.
- 1000 × 시스템의 이득을 설정 합니다.
- 1-300 hz 시스템의 대역 통과 필터링을 설정 합니다.
- 노치 필터를 사용 하 여 60 Hz (또는 지역 유틸리티 주파수에 따라 50 Hz) 감소 잡음.
참고: 이상적인 소음 수준 ± 10 µ V 보다 더 이상 이어야 한다.
-
아래 설명 된 절차를 사용 하 여 데이터 컬렉션을 시작 합니다.
- 단일 테스트-플래시 (0.06 로그 cd.s/m2)를 사용 하 여 테스트 응답 전극의 위치를 평가 하기 위해 눈을 측정.
참고: B 파 진폭 4 dpf 애벌레에 25 µ V 보다 큰 테스트 플래시의이 강도 발생 한다. 강력한 응답, 측정 될 수 없는 경우 다음 전극 위치 고 다른 전극에 위치 잘 확인 플래시 테스트. - 어두운 동물 허용 다음 테스트-플래시, 녹음 하기 전에 완전 한 어둠 속에 3 분에 대 한 적응.
- 현재 밝은 빛 농도를 주차에서 깜박입니다.
- 전체 평균 신호 신호-잡음 레벨에 따라 반복 됩니다.
참고: 일반적으로, 더 많은 주차 가벼운 수준 (3 개 이상의 반복) 신호와 밝은 가벼운 수준 (일반적으로 반복 1) 적은 평균. 점차적으로 60 10에서 간 자극 간격을 길게 밝은 게 흐릿한 빛이 수준에서 s. 샘플 프로토콜은 표 1에 표시 됩니다. - 녹음 후 고통 없이 0.1 %tricaine 사용 하 여 애벌레를 죽 일.
- 단일 테스트-플래시 (0.06 로그 cd.s/m2)를 사용 하 여 테스트 응답 전극의 위치를 평가 하기 위해 눈을 측정.
7입니다. 분석
- 초기 부정적인 파를 구 유에서 한 파 진폭 및 긍정적인 b-웨이브 피크 부정적인-파 여 물통에서 b 파 진폭 측정 합니다.
- 파의 여 물통을 b 파의 피크 자극 발병에서 a-와 b-웨이브 암시적 시간을 각각 측정.
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Representative Results
이 섹션에 측정 한 매일 4에서 7 dpf에 대 한 대표적인 결과를 제공 합니다. 4 dpf에 응답 강력한 a-와 b-파 구성 요소, 각각 대뇌와 양극 세포에서 발생 하는 표시. 각 나이에 테스트, b 파의 진폭 증가 빛의 강도 (그림 2; 그림 3). 특히, 나 이와 함께 증가 하는 주차 섬광에 애벌레 zebrafish 망막의 감도. A-와 b-웨이브 명확한 신호 했다 더 오래 된 애벌레 (그림 2)에 대 한 이러한 농도에 탐지 하는 반면-1.61 cd.s/m2 4 dpf, 로그 보다 낮은 농도에서 인식할 수 없었다. B 파 응답 4와 5의 dpf 사이 크게 성장 (P < 0.0001; 그림 2A -B; 그림 3B)입니다. 낮은 농도에서 b 파 5 및 7 dpf 사이의 작은 변화를 보여, 비록 2.48 로그 cd.s/m2 신호 5와 6 dpf에 비해 7 dpf에 컸다 (P < 0.0001; 그림 2; 그림 3B)입니다. A와 b 파 암시적 번 5 dpf 후 상당히 빠른 되었다 (P < 0.0001; 그림 3C -D)입니다. 전반적으로, 이러한 결과 4 ~ 7 dpf 사이 zebrafish 망막 기능의 성숙 보여 줍니다. 흥미롭게도, 한 파 진폭 감소 7 dpf (그림 3A)에 5에서 등장. 이 외부 망막에서 시 냅 스 연결의 성숙-파 마스크 빠른 b 파 발병의 결과로 양극 세포 응답의 대기 시간을 단축 하기 때문에 있을 수 있습니다. 그는 파를 공부 하고자 약리 치료 블록 후 photoreceptoral 응답 (즉, b 파 구성 요소)를 고용 수 있습니다.
그림 1: 제 브라 G anzfeld에 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극 설정. (A) 원뿔 모양의 스폰지 팁과 염화은 전극은 스폰지 팁 전극 생성 하기 전에 건조. (B-C) 그 후, 염화은 와이어 기반 전체 전극 형성을 통해 스폰지 콘에 삽입 됩니다. (D) 전형적인 애벌레 zebrafish Ganzfeld 르 그 설치 기준 전극 스폰지 플랫폼 삽입 되 고 제 브라 유 충 Ganzfeld 그릇. (E) 스폰지 팁 전극 부드럽게 애벌레 눈의 중앙 각 막 표면 접촉. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 야생-타입 애벌레 zebrafish의 대표 평균에 흔적. (A) 4 wildtype zebrafish의 르 그 흔적을 평균 dpf (n = 8), (B) 5 dpf (n = 8), (C) 6 dpf (n = 7), 및 (D) 7 dpf (n = 9). 응답 했다 백색 Led에서 섬광을 사용 하 여 elicited. 각 나이에 흔적 표시 (맨 아래)에서 섬광에 대 한 응답-2.75,-2.11,-1.61,-0.81, 0.06, 0.72, 1.55, 1.89, 2.18, 2.48 로그 cd.s/m2. 눈금 막대 = 50 µ V. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 4 ~ 7 dpf zebrafish의 암시적 시간과 르 그 a-와 b-파 진폭. (A) 평균 (± 표준 오차의 의미)를 그룹화 한 파 진폭 플래시 강도 증가 하지만 4-7 dpf 애벌레 나 이와 함께 감소. 4-7 dpf 애벌레에 (B) 평균 b-파 진폭 증가 플래시 강도; 진폭 4와 5의 dpf 사이 성장 했다. (C) 평균 a-파 암시적 시간과 시간 (D) 평균 b-웨이브 암시적 5, 6 및 7 dpf 사이 빠른 되었다. 최적의 선 비-선형 회귀에서 파생 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 자극 빛의 강도 (로그 cd.s.m-2) | 반복의 수 | 간 자극 간격 (s) |
| -2.75 | 3 ~ 6 | 10 |
| (30 다음 전에 s) | ||
| -2.11 | 3 ~ 6 | 10 |
| (30 다음 전에 s) | ||
| -1.61 | 3 ~ 6 | 10 |
| (30 다음 전에 s) | ||
| -0.81 | 3 ~ 6 | 10 |
| (60 다음 전에 s) | ||
| 0.06 | 3 ~ 6 | 10 |
| (60 다음 전에 s) | ||
| 0.72 | 1 ~ 3 | 60 |
| 1.55 | 1 ~ 3 | 60 |
| 1.89 | 1 ~ 3 | 60 |
| 2.18 | 1 ~ 3 | 60 |
| 2.48 | 1 ~ 3 | 60 |
표 1: 르 그 녹음의 예제 프로토콜. 자극 프레 젠 테이 션 밝은 (아래) 가벼운 수준, 그 어두운 적응 유지 되도록 간 자극으로 점진적으로 더 이상 진행 하 고 흐릿한 (맨 위)에서 시작 합니다. 각 강도에서 평균 신호 수가 신호-잡음 레벨에 따라 달라 집니다.
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Discussion
에 르 그 같은 기능 해독 애벌레 zebrafish8,9,,1214를 공부 하는 데 사용 하는 도구 제품군에 점점 더 중요 한 되 고 있습니다. 작은 크기로 인해 애벌레 zebrafish 눈의, 유리 micropipettes 전극 가장 게시 프로토콜3,4,5,,89 에 기록으로 적응 되어 , 12 , 13 , 14. 우리가 사용 하는 간단한 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극 애벌레 zebrafish에 프로토콜을 설명 하는 여기. 새로운 전극 수정 추가 장비 없이 애벌레 zebrafish 망막 기능을 측정 하기 위해 표준 작은 동물에 시스템을 사용할 수 있습니다. 스폰지 팁 전극 만들기 위한 자료는 단순히 상업 PVA 스폰지 및 이전 방법 보다 더 경제적인 게 0.3 m m 실버 와이어. 또 다른 장점은입니다, 하드와 날카로운 micropipette 팁 달리 gentler 전극 스폰지 팁 덜 애벌레 눈을 손상 가능성이 높습니다. 마지막으로, PVA 스폰지 녹음을 통해 애벌레 눈에 수 분을 유지 하는 데 도움이 됩니다.
스폰지 팁 전극의 성공적인 응용 프로그램에 키 하는 스폰지의 전체 채도입니다. 이 일반적으로 금붕어 벨의 버퍼 x 1에 몸을 담글의 15 분 이상 걸립니다. 스폰지의 불완전 한 채도 전극의 빠른 건조 때문에 잡음 레벨을 높일 수 있습니다. 대 한 더 나은 신호 컬렉션, 각 실험 세션 (일반적으로 < 8 h) 사용 하지 않는 것이 좋습니다에 대 한 새로운 전극 만들기. 반복 사용 감소에 신호 간 세션 비교를 더 어렵게 될 수 있습니다.
때 스폰지 플랫폼에 애벌레 zebrafish, 위치 해야 합니다 주의 측정 눈 주변 솔루션 또는 물고기 아래 종이 타월 접촉 하지는 보장 하기 위해. 이러한 연락처 참조 전극 스폰지 플랫폼에 포함 되 고 감소는 전기 회로 반바지.
잘 포화 전극 스폰지 팁도 함께 점진적 건조 발생을 르 그 신호에 노이즈가 증가으로 분명 하다. 이 발생, 1 x 금붕어 벨의 1 mL 주사기와 바늘 30 G x ½ "를 사용 하 여 콘의 기지에의 한 방울 똑. 추가 솔루션 스폰지 팁을 잡음 레벨을 감소 하지 않습니다, 경우 눈 주변 유체와 접촉 하지 인지 확인 하 고 전극 팁은 각 막 정점에 중심으로 확인 합니다.
여기 보고 대표 결과에 기록 1-300 hz, 진동 후보 (OP)의 샘플링을 허용 하지 않는 대역 설정 되었다-포함 한 3 차 망막 신경 세포에서 파생 된 b-웨이브 웨이브 amacrine와 신경 절 세포 15,,1617. 높은 저역 설정 (예를 들어, 500 또는 1000 Hz) OP 녹음에 더 있을 수 있습니다.
요약 하자면, 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극 애벌레 zebrafish에 녹음 신뢰할 수 있는 결과 제공 하는 기존 작은 동물에 시스템을 단순화 하기 위해 도움이 됩니다. 대표 결과 진폭 사이 4 및 5 dpf, dpf 빠른 암시적 번 낸 5와 7 사이 더 성숙으로 성장 하는 방법을 보여 줍니다. 경제적이 고 실용적인 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극와 우리의 간단한에 프로토콜 zebrafish 망막 기능을 공부 하는 수 사관을 활용할 수 있습니다. 기술은 또한 성인 zebrafish 또는 작은 눈을 가진 다른 척 추가 있는 모델을 평가 하기 위해 적응 수 있습니다.
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Disclosures
저자 아무 공개가이 작품에 관련 된 있다.
Acknowledgments
자금이 프로젝트에 대 한 제공 했다 교부 금에 의해 멜버른 신경 과학 연구소에서 (PTG, PRJ & BVB)에.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
| 1 mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
| 30 G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
| Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
| Circulation water bath | Lauda-Ko?nigshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
| Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
| Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
| Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
| Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
| Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
| PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
| Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
| Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
| Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
| Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |
References
- Roper, C., Tanguay, R. L. Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. , Academic Press. 143-151 (2018).
- Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. , e54158 (2016).
- Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae. Journal of visualized expriment: JoVE. (97), (2015).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C.
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot4973 (2008).
- Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C., Kohler, K. Synaptic plasticity and functionality at the cone terminal of the developing zebrafish retina. Developmental Neurobiololgy. 56 (3), 222-236 (2003).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Developmental Neurobiololgy. 72 (3), 302-327 (2012).
- Saszik, S., Bilotta, J., Givin, C. M. ERG assessment of zebrafish retinal development. Visual Neuroscience. 16 (5), 881-888 (1999).
- Niklaus, S., et al. Cocaine accumulation in zebrafish eyes leads to augmented amplitudes in the electroretinogram. Matters. 3 (6), e201703000003 (2017).
- Tanvir, Z., Nelson, R. F., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic ERG. Disease models & mechanisms. , dmm. 035220 (2018).
- Kakiuchi, D., et al. Oscillatory potentials in electroretinogram as an early marker of visual abnormalities in vitamin A deficiency. Molecular medicine reports. 11 (2), 995-1003 (2015).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Zebrafish larvae lose vision at night. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 205-210 (2004).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Developmental Dynamics. 222 (4), 564-570 (2001).
- Cameron, M. A., Barnard, A. R., Lucas, R. J. The electroretinogram as a method for studying circadian rhythms in the mammalian retina. Journal of genetics. 87 (5), 459-466 (2008).
- Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. Extraction and modelling of oscillatory potentials. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 17-36 (2002).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. The Journal of Physiology. 555 (1), 153-173 (2004).
