Summary
Aquí, presentamos un protocolo que simplifica la medición de respuestas de luz electroretinograma evocados de pez cebra larval. Un electrodo de punta de esponja novela en forma de cono puede ayudar a hacer el estudio de desarrollo visual en el pez cebra larvas usando el electrorretinograma ERG más fácil de lograr con resultados confiables y de menor costo.
Abstract
El pez cebra (Danio rerio) es comúnmente usado como un modelo vertebrado en estudios del desarrollo y es particularmente conveniente para Neurociencia visual. Para la medición funcional de rendimiento visual, electroretinografía (ERG) es un método no invasivo ideal, que se ha establecido en especies de vertebrados superiores. Este enfoque se está utilizando cada vez más para examinar la función visual en el pez cebra, incluso durante las primeras etapas del desarrollo larvarias. Sin embargo, el electrodo de la grabación más comúnmente utilizado para larval pez cebra ERG hasta la fecha es el electrodo de la micropipeta de vidrio, que requiere equipo especializado para su fabricación, que presenta un desafío para los laboratorios con limitados recursos. Aquí, presentamos un protocolo ERG de larvas de pez cebra con un electrodo de punta de esponja en forma de cono. El nuevo electrodo es más fácil de fabricación y la manija, más económica y menos propensas a dañar el ojo larval de la micropipeta de vidrio. Como métodos previamente publicados de ERG, el protocolo actual puede evaluar la función retiniana externa a través de fotorreceptores y células bipolares respuestas, el a - y b-agita, respectivamente. El protocolo puede ilustrar claramente el perfeccionamiento de la función visual durante el desarrollo temprano de las larvas de pez cebra, apoyando la utilidad, sensibilidad y fiabilidad del electrodo nuevo. El electrodo simplificado es particularmente útil al establecer un nuevo sistema ERG o modificar aparatos ERG pequeño animal existentes para la medida del pez cebra, ayudando a los investigadores de la neurociencia visual con el pez cebra modelo de organismo.
Introduction
El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo ampliamente utilizado vertebrado genético, incluidos los estudios de la neurociencia visual. La creciente popularidad de esta especie puede ser atribuida a ventajas como la facilidad de manipulación genética, el sistema visual vertebrado altamente conservado (tipos de neurona anatomía morfología y organización y genética subyacente), la alta fecundidad y un menor coste de explotación en comparación con modelos mamíferos1. El no invasiva electroretinograma (ERGIO) ha sido utilizado clínicamente para evaluar la función visual humana y en el entorno de laboratorio para cuantificar la visión en una gama de grandes y pequeñas especies como roedores y larvas de pez cebra2,3 , 4 , 5. los componentes ERG más comúnmente analizados son la b-onda, originarios de fotorreceptores sensibles a la luz los interneurons bipolares, respectivamente y una onda. En el pez cebra larval, se establecen distintas capas en la retina por la fertilización después de 3 días (PD) y la morfología del cono fotorreceptores terminal sinapsis madura antes 4 PD6,7. Función retiniana externa del pez cebra larval es establecida antes PD 4, lo que significa que el ERG es medible desde esta temprana edad a partir. Debido al corto ciclo experimental y las propiedades de alto rendimiento del modelo, el ERG se ha aplicado a larvas peces cebra para evaluación funcional de modelos de la enfermedad, análisis de desarrollo de visión y retina de color, estudio de ritmos circadianos visuales y las pruebas de drogas8,9,10,11,12.
Sin embargo, enfoques actuales de pez cebra larvas ERG tiene algunas complejidades que pueden hacer más difícil de adoptar. Pez cebra larvas publicado ERG protocolos suelen utilizan una micropipeta de vidrio llenada de líquido conductor como la grabación de electrodo3,4,5,13, que requiere de una micropipeta de alta calidad Consejo3. Equipo especializado, como un tirador de la micropipeta y en algunos casos a microforge, se requieren para su fabricación. Esto puede ser un desafío para los laboratorios con limitados recursos y conduce a costos adicionales incluso cuando la adaptación de los sistemas ERG animales pequeños disponibles para la medición de la función visual de larvas de pez cebra. Incluso cuando alisó, la punta de la micropipeta fuerte puede dañar la superficie de las larvas. Además, los titulares comercial micropipeta para electrofisiología se construyen con un alambre de plata fijado. Estos fijos los cables a ser apaciguados después de uso repetitivo, que requiere la compra de nuevos titulares a los costos de mantenimiento mayor.
Aquí describimos un método ERG usando un electrodo de la grabación de punta de esponja en forma de cono, que es particularmente útil para la adaptación establecidos pequeños animales ERG configuraciones para larvas de pez cebra ERG medidas. El electrodo se hace fácilmente usando esponja de acetato de polivinilo (PVA) común y fino hilo de plata sin necesidad de otros equipos especializado. Nuestros datos muestran que este nuevo electrodo es sensible y lo suficientemente confiable para demostrar el desarrollo funcional de circuitos neuronales retinianos en el pez cebra de larvas entre 4 y 7 PD. Este electrodo de punta de esponja económico y práctico puede ser útil a los investigadores establecer nuevos sistemas ERG o modificación de sistemas existentes de pequeños animales, estudios de pez cebra.
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Protocol
Electroretinograma (ERGIO) todos los procedimientos fueron realizados según las disposiciones del código nacional australiano de salud y Consejo de investigación médica de la práctica para el cuidado y uso de animales y fueron aprobados por el Comité institucional de ética animal en los Universidad de Melbourne.
1. preparación de buffer
- Preparar 10 x buffer de goldfish Ringer (1.25 M de NaCl, KCl de 26 mM, 25 mm CaCl2, 10 mM MgCl2, 100 mM de glucosa, 100 mM HEPES) con agua de ósmosis inversa (RO). Ajustar el tampón de pH 7,8 y esterilizar el búfer de 0.22 μm filtro. Almacenar el buffer 10 x a 4 ° C como la solución stock3.
Nota: 10 x buffer de Ringer puede usarse dentro de 3 meses. - En el día del experimento, hacer 1 x buffer de goldfish Ringer diluyendo 10 x buffer de goldfish Ringer con agua de ósmosis inversa.
Nota: 1 x buffer de goldfish Ringer se utiliza para saturar la esponja PVA, incluyendo la esponja usada para la colocación de larvas peces cebra y la esponja en la punta del electrodo de registro.
2. preparación del electrodo
-
Prepare el electrodo de la grabación de esponja en forma de cono.
- Corte el extremo macho de la extensión del cable de electrodo de platino y retire el extremo 10 mm de la capa de aislamiento de politetrafluoroetileno externo utilizando una hoja de bisturí. Tenga cuidado de no para dañar el cable interior del plomo del electrodo.
- Corte una longitud de 40 mm de alambre de plata (0,3 mm de diámetro) y fije esto a la punta del electrodo por entrelazar el alambre de plata con el alambre interior expuesto. Fije el empalme con cinta aislante, dejando una longitud de ~ 15 m m de alambre de plata expuesto (figura 1A).
- Electrochape el alambre de plata expuesto con cloro usando una fuente de Vcc 9 de 60 s para mejorar la conducción de la señal. Sumerja la punta de plata expuesta en solución salina normal y conecte el otro extremo al terminal positivo de la batería. Conectar otro cable al terminal negativo de la batería y sumerja el otro extremo del hilo en la salina2.
Nota: Cloro, el alambre de plata remojando durante 1 hora en una solución de blanqueador (hipoclorito de sodio de 42 g/L de ingrediente activo). - Corte un cuadrado 20 x 20 mm de PVA esponja con unas tijeras para hacer un cono (figura 1A). Saturar la esponja con 1 x buffer de Ringer. Bajo un microscopio con una barra de escala en el ocular, utilice una hoja de bisturí para forma el ápice del cono a 40 μm de diámetro. Secar la esponja en forma de cono en papel absorbente hasta que esté sólido.
Nota: La esponja PVA se expande considerablemente cuando se satura, por lo tanto es importante que la esponja se satura primero con solución salina antes de formar el ápice del cono. - Después de chloriding, secar el alambre de plata sobre un tejido absorbente para 5 minutos insertar el alambre de plata en la esponja PVA seco, sólido, en forma de cono a través de la base del cono. Aísle cualquier exceso del metal expuesto con cinta de la máscara para reducir artefactos fotovoltaicos (Figura 1B-C).
Nota: Después de cada sesión experimental, quite la esponja de alambre de plata. Lave la esponja con aire seco y agua de ósmosis inversa para su reutilización. Para asegurar la colección óptima de la señal, se recomienda utilizar solo de alambre de plata. Esponjas PVA no deben utilizarse más de 5 veces. - En el día del experimento, sumerja la esponja-punta de los electrodos de la grabación en 1 x buffer de Ringer durante al menos 15 min saturar completamente la esponja.
- Preparar electrodos de referencia como se describe arriba, pero sin colocar la punta de la esponja.
- Obtener comercialmente el electrodo de tierra.
3. pez cebra preparación
- Dark adaptar las larvas de pez cebra durante la noche (> 8 h) antes de las grabaciones mediante la colocación de pez cebra en un tubo de 15 mL (< 20 larvas por tubo) envuelto en papel de aluminio en una incubadora de oscuro. Retire la tapa para garantizar un suministro adecuado de oxígeno.
- En el día de grabación, apriete la tapa al tubo falcon envueltas en papel aluminio conteniendo larvas y asegurarse de que el tubo es resistente a la luz. Transporte de larvas en el laboratorio ERG.
- Verter el pescado en platos de Petri en la oscuridad con la ayuda de iluminación rojo tenue de un diodo emisor de luz (LED; 17,4 cd.m-2, λmax 600 nm). Cubrir los platos de Petri utilizando toallas resistente a la luz para minimizar la exposición a la luz.
4. preparación de la plataforma de la esponja
- Cortar un rectángulo de esponja PVA seco para caber cómodamente en una caja de Petri de 35 mm. Asegúrese de que el espesor de la esponja debe ser aproximadamente igual a la profundidad de la caja Petri.
- Hacer un pequeño corte vertical por un extremo de la esponja para acomodar el alambre de plata del electrodo de referencia.
- Sumerja la esponja PVA en 1 x buffer de goldfish Ringer hasta saturado. Luego, coloque la esponja en un plato de petri limpia 35 mm. Use una toalla de papel para absorber líquido adicional hasta que no hay solución emana de la esponja en respuesta a una pulsación de luz dedo.
5. animales y colocación del electrodo
- Anestesiar las larvas con Metanosulfonato de 0.02% diluido en 1 x buffer de goldfish Ringer.
- Utilizar una pipeta Pasteur de 3 mL para transferir una larva anestesia en un cuadrado de papel de cocina (~ 3 cm2).
- Coloque la toalla de papel que contiene la larva en la plataforma de esponja húmeda con unas pinzas. Utilizar un pincel fino embebido en buffer de Ringer para ajustar la posición de la larva. Asegúrese de que un ojo esté orientada hacia arriba, aislado de cualquier líquido cerca de la Plaza de toalla de papel debajo de la larva.
- El cuerpo larval, excluyendo la cabeza, con hidratante gel de ojos para mantener húmedas a lo largo de la grabación de ERG la larva del esmalte.
- Coloque el plato Petri con la plataforma de esponja sobre una pequeña plataforma agua caliente ante el estímulo de luz de tazón de fuente de Ganzfeld situado dentro de una jaula de Faraday (figura 1).
Nota: Mantenimiento de la temperatura de la esponja y el cuerpo larval asegura estables señales ERG. - Insertar el electrodo de referencia en el corte en la esponja de la plataforma (figura 1).
- Conectar el electrodo de tierra obtenidos comercialmente a la jaula de Faraday.
- Conectar el electrodo de la grabación a un portaelectrodo y asegure el soporte al brazo estereotáctica de un micromanipulador (figura 1). Utilice una pipeta Pasteur de 3 mL a goteo una gota de solución de Ringer en la punta de la esponja del electrodo para la saturación a 1 x.
- Coloque el microscopio en la jaula de Faraday sobre la plataforma ERG para la colocación del electrodo.
Nota: Iluminación debe ser proporcionada por un LED rojo tenue (17,4 cd.m-2, λmax 600 nm) para permitir una observación de la larva y la colocación del electrodo activo, manteniendo dark-adaptation. - Ajustar la posición de la plataforma de esponja para permitir una observación de la larva al microscopio. A continuación, utilice tejido absorbente para quitar exceso de líquido de la punta del electrodo esponja.
- Colocar el electrodo activo toca suavemente la superficie corneal central de las larvas de pez cebra (Figura 1E).
- Mover el recipiente de Ganzfeld hacia la plataforma de esponja y asegúrese de que la larva está cubierta por el tazón de fuente.
- Cerca de la jaula de Faraday para reducir los ruidos electromagnéticos extraños.
6. Electrorretinograma registro
-
Utilizar el software de la computadora del sistema particular de ERG (para detalles, véase tabla de materiales) provocar el estímulo y adquisición de datos basado en la configuración recomendada a continuación2.
- Establecer la frecuencia de muestreo del sistema a 4 KHz en un ms 650 grabación ventana (2.560 puntos) en el software de adquisición.
- Ajuste la ganancia del sistema × 1.000.
- Configurar el filtrado de paso de banda del sistema 1 – 300 Hz.
- Utilice un filtro para reducir 60 Hz (o 50 Hz, dependiendo de la frecuencia de utilidad local) ruido.
Nota: El nivel de ruido ideal no debe ser más de ± 10 μV.
-
Iniciar la recolección de datos usando el procedimiento descrito a continuación.
- Utilice un solo destello de prueba (0,06 log cd.s/m2) para medir una respuesta de la prueba del ojo para evaluar el posicionamiento de los electrodos.
Nota: Esta intensidad de destello de prueba debe resultar en una b-agita amplitud mayor que 25 μV en larvas de 4 PD. Si no se puede medir una respuesta robusta, entonces vuelva a colocar los electrodos y hacer otra prueba flash para confirmar que los electrodos están bien posicionados. - Después del destello de prueba, permitir el animal oscuro adaptarse por 3 min en oscuridad completa antes de las grabaciones.
- Presentan destellos de atenuador a intensidades de luz más brillantes.
- Promedio de las señales a través de repeticiones según el nivel de señal a ruido.
Nota: En general, promedio de señales más en los niveles de luz dimmer (no menos de 3 repeticiones) y menos en los niveles de luz más brillantes (generalmente 1 repetición). Poco a poco alargar el intervalo inter-estímulo de 10 a 60 s del nivel de luz más tenue a más brillante. Un protocolo de ejemplo se muestra en la tabla 1. - Después de las grabaciones, humanamente matar larvas usando Metanosulfonato de 0.1%.
- Utilice un solo destello de prueba (0,06 log cd.s/m2) para medir una respuesta de la prueba del ojo para evaluar el posicionamiento de los electrodos.
7. Análisis
- Medir la amplitud de una onda de línea de base para el negativo a través de una onda y la amplitud de la onda b desde el negativo a través de una onda hasta el pico de la onda b positiva.
- Medir los tiempos implícitos de onda a y b desde Inicio estímulo al a través de la onda a y el pico de la onda b, respectivamente.
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Representative Results
Esta sección proporciona resultados representativos para ERG las mediciones diariamente de 4 a 7 PD. De PD 4, ERG respuestas muestran robustos componentes de la onda a y b, que surgen de fotorreceptores y células bipolares, respectivamente. A cada edad de prueba, la amplitud de la onda b aumentó con la intensidad de la luz (figura 2; Figura 3). En particular, la sensibilidad de la retina de pez cebra larvas a flashes dimmer aumentado con la edad. El a - y b-agita no eran reconocible a intensidades inferiores a-1.61 log cd.s/m2 a 4 PD, mientras que señales claras eran perceptibles en estas intensidades de larvas más viejas (figura 2). La respuesta de b-agita creció substancialmente entre 4 y 5 PD (P < 0.0001; Figura 2A -B; Figura 3B). Aunque la onda b intensidades inferiores mostraron poco cambio entre 5 y 7 dpf, la señal en el registro 2.48 cd.s/m2 fue mayor en el dpf 7 en comparación con dpf 5 y 6 (P < 0.0001; Figura 2; Figura 3B). Veces implícito una y b ola se convirtió en mucho más rápidos después de PD 5 (P < 0.0001; Figura 3 -D). En general, estos resultados demuestran la maduración de la función de retina de pez cebra entre 4 a 7 PD. Curiosamente, la amplitud de una onda parece disminuir de 5 a 7 dpf (Figura 3A). Esto puede ser debido a la maduración de las conexiones sinápticas en la retina externa acorta la latencia de las respuestas de células bipolares, dando por resultado más rápido inicio de b-agita que enmascara la onda a. Aquellos que deseen estudiar la onda a pueden emplear tratamiento farmacológico a las respuestas post-photoreceptoral de bloque (es decir, la componente de b-agita).
Figura 1: pez cebra G anzfeld ERG configura con el electrodo de punta de esponja en forma de cono. (A) la esponja en forma de cono de punta y el electrodo de plata clorado son secado antes de construir el electrodo de punta de esponja. (B-C) Posteriormente, el alambre de plata clorado se inserta en el cono de la esponja a través de la base para formar el electrodo completo. (D) en la configuración de Ganzfeld ERG típico pez cebra larval, el electrodo de referencia se inserta en la plataforma de la esponja y la larva de pez cebra está cubierta por el tazón de fuente de Ganzfeld. (E) la esponja-punta electrodo toca suavemente la superficie corneal central de las larvas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: rastros ERG promedio representativo del pez cebra larvas de tipo salvaje. Promedio de ERG rastros de pez cebra de tipo salvaje en (A) 4 PD (n = 8), (B) 5 PD (n = 8), (C) 6 PD (n = 7) y (D) 7 dpf (n = 9). Las respuestas fueron sacadas utilizando flashes de LEDs blancos. En cada época, las huellas muestran respuestas a destellos (de abajo hacia arriba)-2.75,-2.11,-1.61, -0,81, 0.06, 0.72, 1.55, 1.89, 2.18, 2.48 log cd.s/m2. Barra de escala = 50 μV. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: ERG a - y b-agita amplitudes y tiempos implícitos de pez cebra de PRD de 4 a 7. (A) promedio (± error estándar de la media) del grupo a-agita amplitud aumentó con la intensidad del flash pero disminuyó con la edad de 4 – 7 PD larvas. (B) promedio de b-agita amplitud en 4 – 7 PD larvas aumentó con la intensidad del flash; amplitud creció entre el 4 y 5 PD. (C) medio una onda implícito y (D) b-onda media implícita se convirtió en más rápida entre PD 5, 6 y 7. Líneas de mejor ajuste se derivan de regresión no lineal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Intensidad luminosa del estímulo (registro cd.s.m-2) | Número de repeticiones | Intervalo inter-estímulo (s) |
| -2.75 | 3 a 6 | 10 |
| (30 s antes de siguiente) | ||
| -2.11 | 3 a 6 | 10 |
| (30 s antes de siguiente) | ||
| -1.61 | 3 a 6 | 10 |
| (30 s antes de siguiente) | ||
| -0,81 | 3 a 6 | 10 |
| (60 s antes de siguiente) | ||
| 0.06 | 3 a 6 | 10 |
| (60 s antes de siguiente) | ||
| 0,72 | 1 a 3 | 60 |
| 1.55 | 1 a 3 | 60 |
| 1.89 | 1 a 3 | 60 |
| 2.18 | 1 a 3 | 60 |
| 2.48 | 1 a 3 | 60 |
Tabla 1: Protocolo de ejemplo de grabaciones ERG. Presentaciones del estímulo comienzan desde el más tenue (arriba) y el progreso a más brillante (abajo) los niveles de luz, con intervalos de progresivamente más tiempo inter-estímulos para garantizar esa adaptación oscura. El número de señales promediadas en cada intensidad depende del nivel de señal a ruido.
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Discussion
Lecturas funcionales como el ERG se han vuelto cada vez más importantes en la suite de herramientas que se utilizan para el estudio de larvas de pez cebra8,9,12,14. Debido al pequeño tamaño del ojo de larvas de pez cebra, Micropipetas de vidrio se han adaptado como electrodos de grabación en más publicados protocolos3,4,5,8,9 , 12 , 13 , 14. aquí se describe un protocolo ERG de larvas de pez cebra con un electrodo de punta de esponja en forma de cono más simple. El nuevo electrodo puede utilizarse para modificar los sistemas de ERG pequeño animal estándar para medir la función retiniana de larvas de pez cebra sin cualquier equipo adicional. Los materiales para hacer el electrodo de punta de esponja son simplemente comercial esponja de PVA y alambre de plata 0,3 mm, que lo hace más económico que los enfoques anteriores. Otra ventaja es que, en contraste con la punta de la micropipeta duros y afilados, es menos probable dañar el ojo larval la punta suave de la esponja del electrodo. Por último, la esponja PVA ayuda a mantener la humedad al ojo larvas a lo largo de la grabación.
La clave para la exitosa aplicación del electrodo de punta de esponja es asegurar una saturación completa de la esponja. Esto normalmente toma no menos de 15 minutos de remojo en 1 x buffer de goldfish Ringer. Saturación incompleta de la esponja puede aumentar el nivel de ruido debido a un secado más rápido del electrodo. Para la mejor colección de señal, haciendo nuevos electrodos para cada sesión experimental (generalmente de < 8 h) es muy recomendable. Uso repetido puede conducir a reducido las señales ERG, dificultando las comparaciones inter-sesión.
Al colocar el pez cebra larval en la plataforma de la esponja, se debe tener cuidado para que el ojo a medir no esté en contacto con cualquier solución circundante o la toalla de papel por debajo de los peces. Tales contactos cortos el circuito eléctrico, como el electrodo de referencia está integrado en la plataforma de esponja y reduce el ERG.
Incluso con puntas de esponja los electrodos bien saturado, secado gradual se produce, que es evidente como mayor ruido en las señales de la ERG. Si esto ocurriera, deje escurrir una gota de goldfish de 1 x de timbre en la base del cono usando jeringa de 1 mL y una aguja de 30 x ½". Si añadiendo que la solución a la punta de la esponja no reduce el nivel de ruido, compruebe que el ojo no está en contacto con un fluido circundante y asegúrese de que la punta del electrodo se centra en el apex corneal.
Las grabaciones en los representativos reportados aquí se hicieron con un ajuste de banda de 1-300 Hz, que no permite el muestreo de los potenciales oscilatorios (OP), wavelets en la onda b derivan de las neuronas retinianas de tercer orden como amacrinas y ganglionares células 15,16,17. Un valor más alto de paso bajo (por ejemplo, 500 o 1.000 Hz) puede ser mejor adaptado para la grabación de OP.
En Resumen, el electrodo de punta de esponja en forma de cono ayuda a simplificar la grabación de ERG de larvas de pez cebra con sistemas existentes de la ERG del pequeño animal, proporcionando resultados confiables. Resultados representativos demuestran que ERG amplitud crece entre el PRD 4 y 5, con mayor maduración entre 5 y 7 dpf que manifiesta más rápido implícito veces. Nuestro protocolo simple del ERG con el electrodo de esponja-punta en forma de cono económico y práctico puede beneficiar a los investigadores estudiar la función de retina de pez cebra. La técnica también puede ser adaptada para evaluar otros modelos vertebrados con ojos pequeños o pez cebra adulto.
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Disclosures
Los autores no tienen ninguna divulgación pertinentes a este trabajo.
Acknowledgments
Financiamiento para este proyecto fue proveído por una beca del Instituto de Neurociencia de Melbourne (a PTG, PRJ & BVB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
| 1 mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
| 30 G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
| Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
| Circulation water bath | Lauda-Ko?nigshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
| Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
| Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
| Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
| Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
| Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
| PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
| Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
| Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
| Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
| Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |
References
- Roper, C., Tanguay, R. L. Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. , Academic Press. 143-151 (2018).
- Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. , e54158 (2016).
- Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae. Journal of visualized expriment: JoVE. (97), (2015).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C.
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot4973 (2008).
- Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C., Kohler, K. Synaptic plasticity and functionality at the cone terminal of the developing zebrafish retina. Developmental Neurobiololgy. 56 (3), 222-236 (2003).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Developmental Neurobiololgy. 72 (3), 302-327 (2012).
- Saszik, S., Bilotta, J., Givin, C. M. ERG assessment of zebrafish retinal development. Visual Neuroscience. 16 (5), 881-888 (1999).
- Niklaus, S., et al. Cocaine accumulation in zebrafish eyes leads to augmented amplitudes in the electroretinogram. Matters. 3 (6), e201703000003 (2017).
- Tanvir, Z., Nelson, R. F., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic ERG. Disease models & mechanisms. , dmm. 035220 (2018).
- Kakiuchi, D., et al. Oscillatory potentials in electroretinogram as an early marker of visual abnormalities in vitamin A deficiency. Molecular medicine reports. 11 (2), 995-1003 (2015).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Zebrafish larvae lose vision at night. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 205-210 (2004).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Developmental Dynamics. 222 (4), 564-570 (2001).
- Cameron, M. A., Barnard, A. R., Lucas, R. J. The electroretinogram as a method for studying circadian rhythms in the mammalian retina. Journal of genetics. 87 (5), 459-466 (2008).
- Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. Extraction and modelling of oscillatory potentials. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 17-36 (2002).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. The Journal of Physiology. 555 (1), 153-173 (2004).
