Summary
نقدم هنا، بروتوكول أن يبسط قياس الاستجابات اليكتروريتينوجرام مقولة الخفيفة من الزرد اليرقات. يمكن أن تساعد مسرى رواية على شكل مخروط الأسفنج-تلميح جعل دراسة التنمية البصرية في الزرد اليرقات باستخدام اليكتروريتينوجرام أرج أسهل تحقيقا مع نتائج موثوق بها، وانخفاض التكلفة.
Abstract
الزرد (دانيو rerio) يستخدم عادة كنموذج فقاريات في الدراسات الإنمائية، وهو مناسبة خاصة لعلم الأعصاب البصرية. للقياسات الوظيفية للأداء البصري، اليكتروريتينوجرافي (ERG) هو أسلوب غير الغازية مثالية، التي ظلت راسخة في الأنواع الفقارية أعلى. يتزايد استخدام هذا النهج لدراسة الدالة البصرية في الزرد، بما في ذلك أثناء مرحلة اليرقات المبكر. بيد أن مسرى التسجيل الأكثر استخداماً لليرقات الزرد أرج حتى الآن هو مسرى ميكروبيبيتي الزجاج، الأمر الذي يتطلب معدات متخصصة لصناعتها، يقدم تحديا للمختبرات ذات الموارد المحدودة. نقدم هنا، بروتوكول أرج الزرد يرقات باستخدام قطب نصيحة الأسفنج على شكل مخروط. مسرى الرواية أسهل لتصنيع والتعامل، أكثر اقتصادا، وأقل احتمالاً لتلف العين اليرقات من ميكروبيبيتي الزجاج. مثل أساليب أرج المنشورة سابقا، يمكن تقييم البروتوكول الحالي وظيفة الشبكية الخارجي عن طريق مستقبله واستجابات الخلية القطبين،-وب-موجه، على التوالي. البروتوكول يمكن أن تبين بوضوح صقل الدالة البصرية في جميع أنحاء التطور المبكر لليرقات الزرد، تدعم الأداة المساعدة وحساسية، وموثوقية مسرى الرواية. قطب كهربائي تبسيط مفيد بشكل خاص عند إنشاء نظام جديد لارج أو تعديل جهاز أرج الحيوانات الصغيرة الموجودة لقياس الزرد، ومساعدة الباحثين في علوم الأعصاب البصرية استخدامها في الزرد نموذج الكائن.
Introduction
وقد أصبح الزرد (دانيو rerio) نموذج فقاريات وراثية مستخدمة على نطاق واسع، بما في ذلك الدراسات المتعلقة بعلوم الأعصاب البصرية. ازدياد شعبية من هذا النوع يمكن أن يعزى إلى المزايا بما في ذلك سهولة التلاعب بالجينات، عاليا يحافظ النظام المرئي الفقاريات (أنواع الخلايا العصبية ومورفولوجية تشريحية والمنظمة، وعلم الوراثة الكامنة)، وخصوبة عالية وانخفاض تكاليف تربية مقارنة بنماذج الثدييات1. اليكتروريتينوجرام غير الغازية (ERG) منذ فترة طويلة تستخدم سريرياً لتقييم دالة visual البشرية، وفي إنشاء مختبر التحديد الكمي للرؤية في مجموعة من الأنواع الكبيرة والصغيرة بما فيها القوارض واليرقات الزرد2،3 , 4 , 5-مكونات أرج تحليل الأكثر شيوعاً هي موجه والموجه ب، التي تنشأ من استشعار الضوء photoreceptors وإينتيرنيورونس بين القطبين، على التوالي. في الزرد اليرقات، تنشأ طبقات متميزة في الشبكية قبل 3 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) ومورفولوجية المخروط مستقبله المحطة الطرفية synapses ناضجة قبل6،إدارة الشرطة الاتحادية 47. وبالتالي إنشاء وظيفة الشبكية الخارجي من الزرد اليرقات قبل 4 إدارة الشرطة الاتحادية، مما يعني أن أرج قابل للقياس من هذا العمر المبكر فصاعدا. بسبب دورة تجريبية قصيرة وخصائص الطراز الفائق، طبق أرج على الزرد اليرقات للتقييم الوظيفي لنماذج المرض، وتحليل التنمية لون الرؤية والشبكية، ودراسة البصرية circadian إيقاعات واختبار المخدرات8،،من910،،من1112.
بيد أن النهج الحالي لليرقات الزرد أرج له بعض التعقيدات التي قد تجعل من الصعب على اعتماد. الزرد اليرقات المنشورة أرج البروتوكولات تستخدم بشكل شائع ميكروبيبيتي زجاج مليئة بسائل موصل كتسجيل القطب3،4،5،13، الأمر الذي يتطلب من ميكروبيبيتي عالية الجودة تلميح3. معدات متخصصة، مثل ساحبة ميكروبيبيتي، وفي بعض الحالات ميكروفورجي، مطلوبة من أجل تصنيعها. وهذا يمكن أن يشكل تحديا للمختبرات ذات الموارد المحدودة، ويؤدي إلى تكاليف إضافية حتى عند تكييف النظم أرج الحيوانات الصغيرة المتاحة لقياس دالة visual الزرد اليرقات. وحتى عندما ممهدة، نصيحة ميكروبيبيتي حادة يمكن أن تلحق الضرر سطح العين اليرقات. بالإضافة إلى ذلك، يتم بناء أصحاب ميكروبيبيتي التجارية للكهربية بسلك فضة ثابتة. تصبح هذه ثابتة أسلاك تخمل بعد الاستخدام المتكرر، التي تتطلب شراء أصحاب جديدة مما يؤدي إلى زيادة تكاليف الصيانة.
هنا يصف لنا أسلوب أرج استخدام قطب تسجيل نصيحة الأسفنج على شكل مخروط، التي مفيدة بشكل خاص لتكييف الأجهزة أرج الحيوانات الصغيرة المنشأة للقياسات أرج الزرد اليرقات. الكهربائي بسهولة باستخدام المشتركة اسيتات البولي فينيل (PVA) الأسفنج والأسلاك الفضية الجميلة دون أي معدات متخصصة أخرى. البيانات المتوفرة لدينا تظهر أن هذا القطب رواية حساسة ويمكن الاعتماد عليها ما يكفي لإثبات التنمية الوظيفية للدوائر العصبية الشبكية في الزرد اليرقات بين 4 و 7 في إدارة الشرطة الاتحادية. هذا القطب نصيحة الأسفنج اقتصادا والعملية قد تكون مفيدة للباحثين وضع نظم جديدة لارج أو تعديل النظم القائمة في الحيوانات الصغيرة، للدراسات الزرد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع اليكتروريتينوجرام (ERG) إجراءات أجريت وفقا لأحكام القانون الوطني الأسترالي للصحة ومجلس البحوث الطبية في الممارسة لرعاية واستخدام الحيوانات ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات المؤسسية الحيوان في جامعة ملبورن.
1. إعداد المخزن المؤقت
- إعداد 10 × المخزن المؤقت ذهبية المسابقة (1.25 م كلوريد الصوديوم، 26 مم بوكل، كاكل 25 مم2، 10 مم مجكل2، الجلوكوز 100 مم، 100 مم هيبيس) باستخدام مياه التناضح العكسي (RO). ضبط المخزن المؤقت للأس الهيدروجيني 7.8 وتعقيم المخزن المؤقت باستخدام 0.22 ميكرومتر التصفية. المخزن المؤقت لتخزين 10 x في 4 درجات مئوية ك حل الأسهم3.
ملاحظة: وينبغي استخدام 10 × المخزن المؤقت للمسابقة في غضون 3 أشهر. - في يوم التجربة، جعل 1 × العازلة ذهبية المسابقة بتمييع 10 × ذهبية المسابقة المخزن المؤقت باستخدام مياه التناضح العكسي.
ملاحظة: 1 × المخزن المؤقت ذهبية المسابقة يستخدم تشبع الأسفنج بولي، بما في ذلك الأسفنج المستخدمة لوضع اليرقات الزرد، والإسفنج على طرف القطب التسجيل.
2. إعداد قطب كهربائي
-
إعداد مسرى تسجيل الأسفنج على شكل مخروط.
- قطع نهاية الذكور من ملحق الرصاص قطب البلاتين وإزالة من نهاية 10 ملم للطلاء العازلة تترافلوروايثيلين الخارجي باستخدام شفرة المبضع. الحرص على عدم إتلاف الأسلاك الداخلية لقيادة القطب.
- قص بطول 40 مم من أسلاك الفضة (0.3 مم) وأمن إرفاق هذا الرصاص قطب كهربائي انتوينينج السلك الفضي مع الأسلاك الداخلية المكشوفة. يغلف المشترك باستخدام الشريط العازلة، ترك طول ~ 15 ملم من أسلاك الفضة مكشوف (الشكل 1A).
- لبالكهرباء أسلاك فضية مكشوفة مع كلوريد استخدام مصدر V DC 9 60 ثانية لتحسين التوصيل إشارة. تزج تلميح الفضة المكشوفة في المحلول الملحي العادي وتوصيل الطرف الآخر إلى محطة إيجابية للبطارية. توصيل سلك آخر للمحطة السلبية للبطارية وتزج في الطرف الآخر من السلك في المالحة2.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، تشلوريناتي الأسلاك الفضية التي نقع عليه لمدة 1 ساعة في محلول التبييض (العنصر النشط 42 غرام/لتر تحت كلوريت الصوديوم). - قص ساحة ~ 20 ملم × 20 ملم من بولي الأسفنج باستخدام مقص جعل مخروط (الشكل 1A). تشبع الأسفنج باستخدام 1 × المخزن المؤقت في المسابقة. تحت مجهر مع شريط مقياس في العدسة، تستخدم شفرة المبضع لتشكل قمة المخروط للقطر ~ 40 ميكرومتر. الهواء الجاف الأسفنج على شكل مخروط على ورقة ماصة والأنسجة حتى تصبح صلبة.
ملاحظة: الأسفنج بولي يوسع إلى حد كبير عندما مشبعة، وبالتالي من المهم أن الأسفنج أولاً المشبعة بالمياه المالحة قبل تشكيل قمة المخروط. - بعد تشلوريدينج، الهواء الجاف الأسلاك الفضية الأنسجة ماصة لأدنى 5 إدراج الأسلاك الفضية في الأسفنج بولي المجففة، وصلبة، وعلى شكل مخروط من خلال قاعدة المخروط. عزل أي المعادن المكشوفة الزائدة باستخدام الشريط قناع للحد من التحف الضوئية (الشكل 1B-ج).
ملاحظة: وبعد كل دورة تجريبية، إزالة الاسفنجة من سلك الفضة. أغسل الاسفنجة باستخدام التناضح العكسي الماء والهواء الجاف لإعادة استخدامها. لضمان جمع الإشارات الأمثل، ينصح باستخدام واحد من الأسلاك الفضية. وينبغي أن لا يتم استخدامها الأسفنج بولي أكثر من 5 مرات. - في يوم التجربة، تزج الأسفنج-غيض مسرى التسجيل في 1 × المخزن المؤقت في المسابقة لمدة 15 دقيقة على الأقل تشبع تماما الأسفنج.
- تحضير أقطاب المرجعية كما هو موضح أعلاه، ولكن دون إرفاق نصيحة الأسفنج.
- الحصول على أرض مسرى تجارياً.
3. إعداد الزرد
- الظلام تكييف الزرد اليرقات بين عشية وضحاها (> ح 8) قبل التسجيلات عن طريق وضع الزرد في أنبوب 15 مل (< 20 يرقات كل أنبوب) مغلفة برقائق الألومنيوم في حاضنة الظلام. قم بإزالة غطاء لضمان إمدادات كافية من الأكسجين.
- في يوم التسجيل، تشديد الغطاء للأنبوب مكسوة بإحباط فالكون الذي يحتوي على اليرقات والتأكد من أن الأنبوب واقية من الضوء. نقل اليرقات إلى مختبر أرج.
- صب السمك في أطباق بتري في الظلام بمساعدة الإضاءة حمراء قاتمة من أدى (الصمام؛ 17.4 cd.m-2، λmax 600 nm). تغطية أطباق بيتري استخدام المناشف واقية من الضوء لتقليل التعرض للضوء.
4-الأسفنج منصة إعداد
- قص مستطيل الأسفنج بولي الجافة لتناسب شكل مريح في 35 مم طبق بيتري. ضمان أن يكون سمك الاسفنجة مساوية تقريبا لعمق طبق بيتري.
- قم بقطع صغيرة عمودياً من خلال نهاية واحد من الأسفنج لاستيعاب سلك الفضة القطب مرجعية.
- نقع الأسفنج بولي في 1 × العازلة ذهبية المسابقة حتى المشبعة. ثم، ضع الاسفنجة في طبق بتري نظيفة 35 ملم. استخدم منشفة ورقية لامتصاص سائل إضافي حتى ينضح أي حل من الأسفنج ردا على بيان صحفي إصبع خفيفة.
5-الحيوان وقطب كهربائي لتحديد المواقع
- تخدير اليرقات تريكيني 0.02% المخفف في 1 × المخزن المؤقت ذهبية المسابقة باستخدام.
- استخدام 3 مل ماصة باستور لنقل يرقة أنيسثيتيزيد على ساحة من منشفة ورقية (~ 3 سم2).
- ضع منشفة ورقية تحتوي على اليرقة على منصة اسفنجة رطبة باستخدام الملقط. استخدام فرشاة غرامة غارقة في المخزن المؤقت للمسابقة لضبط موضع اليرقة. ضمان أن عين واحدة تواجه صعودا، معزولة عن أي سائل قريب في ساحة منشفة ورقية تحت اليرقة.
- الصقيل الجسم اليرقات، باستثناء الرأس، مع ترطيب هلام العين أن تبقى اليرقة رطبة طوال تسجيل أرج.
- ضع طبق بيتري مع منصة الأسفنج على منصة تسخين المياه صغيرة أمام جانزفيلد وعاء الخفيفة الحافز الذي يقع داخل قفص فاراداي (الشكل 1).
ملاحظة: ويضمن الحفاظ على درجة الحرارة من الأسفنج والجسم اليرقات مستقرة أرج الإشارات. - إدراج مسرى إشارة إلى الخفض في الأسفنج منصة (الشكل 1).
- قم بتوصيل القطب الأرضي التي تم الحصول عليها تجارياً قفص فاراداي.
- إرفاق مسرى التسجيل لحائز قطب وآمنة لحاملها بذراع ستيريوتاكسيك ميكرومانيبولاتور (الشكل 1). استخدام 3 مل ماصة باستور بالتنقيط قطره واحدة من 1 × الحل للمسابقة على الحافة الأسفنج القطب لإعادة تشبع.
- ضع المجهر في قفص فاراداي على منهاج موضع القطب أرج.
ملاحظة: ينبغي توفير الإضاءة LED الحمراء قاتمة (17.4 cd.m-2، λmax 600 nm) للسماح لمراقبة اليرقة وموضع القطب النشط، مع الحفاظ على داركادابتيشن. - ضبط وضع منهاج الأسفنج للسماح بمراقبة اليرقة تحت المجهر. ثم، استخدم الأنسجة الماصة لإزالة السائل الزائد من طرف الأسفنج القطب.
- ضع القطب النشط بحيث أنها تمس بلطف وسط سطح القرنية العين الزرد اليرقات (الشكل 1E).
- نقل وعاء جانزفيلد نحو منصة الأسفنج وضمان أن اليرقة مغطى بالوعاء.
- إغلاق قفص فاراداي للحد من الضوضاء الكهرومغناطيسية دخيلة.
6-اليكتروريتينوجرام التسجيل
-
استخدام برامج الكمبيوتر نظام أرج خاص (انظر "الجدول للمواد" لمزيد من التفاصيل) يؤدي الحافز والحصول على البيانات استناداً إلى الإعدادات الموصى بها أدناه2.
- تعيين معدل أخذ العينات من النظام إلى 4 كيلو هرتز على مرض التصلب العصبي المتعدد 650 تسجيل النافذة (2,560 نقطة) في اقتناء البرمجيات.
- تعيين كسب النظام إلى 1,000 ×.
- تعيين شريط تمرير تصفية النظام إلى 1 – 300 هرتز.
- استخدام عامل تصفية الشق للحد من 60 هرتز (أو 50 هرتز، اعتماداً على التردد المرافق المحلية) الضوضاء.
ملاحظة: ينبغي أن يكون مستوى الضوضاء مثالية لا يزيد عن ± 10 µV.
-
البدء في جمع البيانات باستخدام الإجراء الموضح أدناه.
- استخدم اختبار-فلاش واحد (سجل 0.06 cd.s/m2) لقياس استجابة اختبار من العين لتقييم وضع أقطاب كهربائية.
ملاحظة: ينبغي أن تؤدي هذه الكثافة فلاش اختبار مطال ب-موجه أكبر من 25 µV في اليرقات 4-إدارة الشرطة الاتحادية. إذا كان لا يمكن أن يقاس ردا قويا، ثم قم بتغيير موضع الأقطاب وتفعل شيئا آخر اختبار فلاش للتأكد من أن يتم وضع أقطاب جيدا. - بعد الاختبار-الفلاش، السماح للحيوان للظلام تكييف لمدة 3 دقائق في الظلام الدامس قبل التسجيلات.
- يقدم ومضات من باهتة لكثافة الضوء أكثر إشراقا.
- ويكرر إشارات متوسط عبر وفقا لمستوى الإشارات إلى الضجيج.
ملاحظة: وبصفة عامة، متوسط إشارات أكثر في مستويات الضوء الخافت (يكرر لا يقل عن 3) وعدد أقل في ضوء المستويات أكثر إشراقا (عادة 1 تكرار). تدريجيا إطالة فترة التحفيز بين الوكالات من 10 إلى 60 ثانية من مستوى الضوء الأكثر خفوت لالمع. ويرد في الجدول 1بروتوكول عينة. - بعد التسجيلات، معاملة إنسانية تقتل اليرقات باستخدام تريكيني 0.1%.
- استخدم اختبار-فلاش واحد (سجل 0.06 cd.s/m2) لقياس استجابة اختبار من العين لتقييم وضع أقطاب كهربائية.
7-تحليل
- قياس السعة في موجه من خط الأساس للحوض الموجات السلبية والسعة ب-موجه من الحوض الموجات السلبية إلى ذروة الموجه ب الإيجابية.
- قياس الأوقات الضمني موجه وب من بداية التحفيز للحوض الصغير في الموجه وذروة ب-الموجه، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوفر هذا القسم نتائج تمثيلية لارج القياسات تؤخذ يوميا من 4 إلى 7 إدارة الشرطة الاتحادية. من 4 إدارة الشرطة الاتحادية، تظهر الردود أرج قوية موجه وب المكونات، التي تنشأ من photoreceptors وخلايا ثنائية القطب، على التوالي. زيادة السعة ب-الموجه في سن كل اختبار، مع شدة الضوء (الشكل 2؛ 3 الشكل). جدير بالذكر أن حساسية الشبكية الزرد اليرقات إلى ومضات باهتة زادت مع تقدم العمر. -وب-موجه لم يمكن التعرف على كثافة أقل من تسجيل-1.61 cd.s/m2 في 4 إدارة الشرطة الاتحادية، بينما كانت إشارات واضحة يمكن اكتشافها في هذه الشدة لليرقات الأكبر سنا (الشكل 2). رد ب-موجه نمت إلى حد كبير بين إدارة الشرطة الاتحادية 4 و 5 (ف < 0.0001؛ الشكل 2 ألف --ب؛ الشكل 3). على الرغم من أن أظهر ب-الموجه في كثافة أقل تغيير طفيف بين 5 و 7 إدارة الشرطة الاتحادية، الإشارة في سجل 2.48 cd.s/m2 كان أكبر في إدارة الشرطة الاتحادية 7 بالمقارنة مع إدارة الشرطة الاتحادية 5 و 6 (ف < 0.0001؛ الشكل 2؛ الشكل 3). مرات الضمني الموجه A وب أصبحت أسرع بشكل ملحوظ بعد 5 إدارة الشرطة الاتحادية (ف < 0.0001؛ الشكل 3 -د). عموما، هذه النتائج تظهر نضوج الزرد وظيفة الشبكية بين 4 إلى 7 إدارة الشرطة الاتحادية. من المثير للاهتمام، يبدو السعة موجه إلى إنقاص من 5 إلى 7 إدارة الشرطة الاتحادية (الشكل 3A). قد يرجع السبب في ذلك إلى نضوج الاتصالات متشابك في شبكية العين الخارجي إلى تقصير زمن الوصول لاستجابات الخلايا ثنائية القطب، أدى إلى أسرع من بداية الموجه ب أن أقنعة الموجه. أولئك الذين يرغبون في الدراسة في الموجه يمكن أن تستخدم العلاج الدوائي لكتلة فوتوريسيبتورال بعد الردود (أي عنصر ب-الموجه).
رقم 1: الزرد ز إعداد أنزفيلد أرج مع مسرى نصيحة الأسفنج على شكل مخروط. نصيحة (A) الأسفنج على شكل مخروط ومسرى الفضة المكلورة هي تجفف قبل تشييد مسرى الأسفنج-نصيحة في الهواء. (ب-ج) فيما بعد، يتم إدراج سلك الفضة المكلورة في المخروط الأسفنج عن طريق قاعدة لتشكيل قطب كاملة. (د) في إعداد "أرج جانزفيلد" الزرد اليرقات نموذجي، يتم إدراج مسرى مرجع في منهاج الأسفنج واليرقه الزرد مغطى بوعاء جانزفيلد. بلطف يمس القطب (ﻫ) الأسفنج-التلميح وسط سطح القرنية العين اليرقات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: آثار أرج متوسط الممثل الزرد اليرقات البرية من نوع- متوسط أرج آثار الزرد wildtype في (أ) 4 إدارة الشرطة الاتحادية (n = 8)، (ب) 5 إدارة الشرطة الاتحادية (n = 8)، (ج) 6 إدارة الشرطة الاتحادية (n = 7)، و (د) 7 إدارة الشرطة الاتحادية (ن = 9). وقد أثارت الردود استخدام ومضات من المصابيح البيضاء. في كل سن، وتظهر الآثار ردود على ومضات من (من أسفل إلى أعلى)-2.75،-2.11،-1.61،-0.81، 0.06، 0.72، 1.55، 1.89، 2.18، 2.48 تسجيل cd.s/m2. شريط المقياس = 50 µV. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: ستريك موجه وب أرج وأوقات ضمني لالزرد إدارة الشرطة الاتحادية 4 إلى 7- (أ) مجموعة المتوسط (± الخطأ المعياري للوسط) السعة ازدادت كثافة الفلاش ولكن انخفضت مع التقدم في السن في 4 – 7 إدارة الشرطة الاتحادية اليرقات الموجه. (ب) موجه ب متوسط السعة في 4 – 7 إدارة الشرطة الاتحادية اليرقات ارتفع بشدة فلاش؛ السعة نما بين إدارة الشرطة الاتحادية 4 و 5. (ج) متوسط الموجه الضمني ووقت الضمني الموجه ب متوسط (د) أصبحت أسرع بين إدارة الشرطة الاتحادية في 5 و 6 و 7. خطوط من أفضل احتواء مستمدة من الانحدار غير الخطي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| كثافة الضوء المحفز (سجل cd.s.m-2) | عدد تكرار | الفاصل الزمني بين التحفيز (s) |
| -2.75 | 3 إلى 6 | 10 |
| (30 ثانية قبل التالي) | ||
| -2.11 | 3 إلى 6 | 10 |
| (30 ثانية قبل التالي) | ||
| -1.61 | 3 إلى 6 | 10 |
| (30 ثانية قبل التالي) | ||
| -0.81 | 3 إلى 6 | 10 |
| (60 ثانية قبل التالي) | ||
| 0.06 | 3 إلى 6 | 10 |
| (60 ثانية قبل التالي) | ||
| 0.72 | 1 إلى 3 | 60 |
| 1.55 | 1 إلى 3 | 60 |
| 1.89 | 1 إلى 3 | 60 |
| 2.18 | 1 إلى 3 | 60 |
| 2.48 | 1 إلى 3 | 60 |
الجدول 1: البروتوكول المثال تسجيلات أرج. عروض الحوافز تبدأ من الأكثر خفوت (أعلى) والتقدم إلى مستويات الضوء أكثر إشراقا (أسفل)، مع تدريجيا يعد الحافز بين الفواصل الزمنية ضمان الحفاظ على هذا التكيف الظلام. يعتمد عدد الإشارات في المتوسط في كل شدة على مستوى إشارة إلى الضوضاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قراءات فنية مثل أرج أصبحت متزايدة الأهمية في الجناح للأدوات المستخدمة في دراسة الزرد اليرقات8،9،،من1214. نظراً لصغر حجم العين الزرد اليرقات، تكيفت ميكروبيبيتيس الزجاج كتسجيل كهربائي في نشر معظم البروتوكولات3،4،5،،من89 , 12 , 13 , 14-هنا يمكننا وصف بروتوكول أرج الزرد يرقات باستخدام قطب نصيحة الأسفنج على شكل مخروط أبسط. يمكن استخدام مسرى الرواية لتعديل الحيوانات الصغيرة أرج أنظمة معيارية لقياس وظيفة الزرد اليرقات الشبكية دون أي معدات إضافية. المواد اللازمة لصنع مسرى الأسفنج-نصيحة هي ببساطة التجارية بولي الأسفنج وسلك الفضة 0.3 مم، مما يجعل هذا أكثر اقتصادا من النهج السابقة. ميزة أخرى أنه، خلافا لنصيحة ميكروبيبيتي الصلبة والحادة، تلميح الأسفنج القطب الطف أقل احتمالاً لتلف العين اليرقات. وأخيراً، الأسفنج بولي يساعد على الحفاظ على رطوبة العين اليرقات خلال التسجيل.
مفتاح التطبيق الناجح لمسرى نصيحة الأسفنج ضمان الإشباع الكامل من الأسفنج. وهذا يأخذ عادة لا تقل عن 15 دقيقة في مغطس في 1 × المخزن المؤقت ذهبية المسابقة. يمكن زيادة التشبع غير مكتملة من الأسفنج مستوى الضوضاء سبب التجفيف أسرع القطب. لجمع إشارة أفضل، مما يجعل أقطاب جديدة لكل دورة تجريبية (عموما < 8 ح) ينصح بشدة. يمكن أن يؤدي استخدام تكرار انخفاض أرج الإشارات، يزيد من صعوبة إجراء مقارنات فيما بين الدورات.
عند تحديد المواضع الزرد اليرقات إلى ساحة الأسفنج، يجب الحرص على التأكد من أن العين لقياس ليس على اتصال بأي حل المحيطة أو منشفة ورقية تحت الأسماك. جهة الاتصال هذه السراويل الدارة الكهربائية، مسرى مرجع مضمن في منهاج الأسفنج ويقلل من أرج.
حتى مع نصائح الأسفنج القطب مشبعة جيدا، التجفيف التدريجي يحدث، الذي هو واضح كالضوضاء المتزايدة في إشارات أرج. وينبغي أن يحدث هذا، بالتنقيط قطره واحدة من 1 x ذهبية في المسابقة على قاعدة المخروط باستخدام المحاقن 1 مل وابرة 30 x ½ ". إذا إضافة الحل إلى نصيحة الأسفنج لا تقلل من مستوى الضوضاء، تحقق من أن العين ليست على اتصال سوائل المحيطة بها وضمان أن نصيحة القطب يتركز على قمة القرنية.
وقدمت التسجيلات في نتائج تمثيلية ذكرت هنا مع إعداد ممر الموجه من 1 – 300 هرتز، التي لا تسمح بأخذ عينات من إمكانات متذبذبة (OP) — المويجات في ب-الموجه المستمدة من الخلايا العصبية الشبكية الترتيب الثالث بما في ذلك أماكريني والعقدة الخلايا 15،،من1617. إعداد س أعلى (مثلاً 500 أو 1000 هرتز) قد تكون أفضل مناسبة لتسجيل البروتوكول الاختياري.
وباختصار، مسرى نصيحة الأسفنج على شكل مخروط يساعد على تبسيط تسجيل أرج الزرد اليرقات مع النظم أرج الحيوانات الصغيرة القائمة، وتقديم نتائج يمكن الاعتماد عليها. وتبين النتائج الممثل أن السعة أرج ينمو بين 4 و 5 إدارة الشرطة الاتحادية، مع زيادة النضج بين 5 و 7 إدارة الشرطة الاتحادية الإظهار كأسرع الأوقات الضمني. يمكن أن تستفيد بروتوكولنا أرج بسيطة مع قطب اقتصادي وعملي على شكل مخروط الأسفنج-نصيحة المحققين يدرسون الزرد وظيفة الشبكية. التقنية يمكن تكييفها أيضا لتقييم الزرد الكبار أو نماذج فقاريات أخرى مع عيون الصغيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا الكشف عن البيانات ذات الصلة بهذا العمل.
Acknowledgments
التمويل لهذا المشروع قدمت بمنحه من معهد علم الأعصاب ملبورن (إلى PTG، PRJ و BVB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
| 1 mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
| 30 G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
| Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
| Circulation water bath | Lauda-Ko?nigshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
| Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
| Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
| Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
| Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
| Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
| PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
| Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
| Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
| Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
| Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |
References
- Roper, C., Tanguay, R. L. Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. , Academic Press. 143-151 (2018).
- Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. , e54158 (2016).
- Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae. Journal of visualized expriment: JoVE. (97), (2015).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 57-68 (2002).
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot4973 (2008).
- Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C., Kohler, K. Synaptic plasticity and functionality at the cone terminal of the developing zebrafish retina. Developmental Neurobiololgy. 56 (3), 222-236 (2003).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Developmental Neurobiololgy. 72 (3), 302-327 (2012).
- Saszik, S., Bilotta, J., Givin, C. M. ERG assessment of zebrafish retinal development. Visual Neuroscience. 16 (5), 881-888 (1999).
- Niklaus, S., et al. Cocaine accumulation in zebrafish eyes leads to augmented amplitudes in the electroretinogram. Matters. 3 (6), e201703000003 (2017).
- Tanvir, Z., Nelson, R. F., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic ERG. Disease models & mechanisms. , dmm. 035220 (2018).
- Kakiuchi, D., et al. Oscillatory potentials in electroretinogram as an early marker of visual abnormalities in vitamin A deficiency. Molecular medicine reports. 11 (2), 995-1003 (2015).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Zebrafish larvae lose vision at night. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 205-210 (2004).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Developmental Dynamics. 222 (4), 564-570 (2001).
- Cameron, M. A., Barnard, A. R., Lucas, R. J. The electroretinogram as a method for studying circadian rhythms in the mammalian retina. Journal of genetics. 87 (5), 459-466 (2008).
- Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. Extraction and modelling of oscillatory potentials. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 17-36 (2002).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. The Journal of Physiology. 555 (1), 153-173 (2004).
