Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול אשר מפשט את המדידה של אור electroretinogram עורר תגובות דג זברה זחל. אלקטרודה הרומן בצורת חרוט ספוג-עצה יכולים לעזור להפוך את המחקר של פיתוח ויזואלי בזחל דג זברה שימוש את electroretinogram ארג קל יותר להשיג עם תוצאות אמינות ועלות נמוכה יותר.
Abstract
דג זברה (רזבורה rerio) משמשת כמודל חוליות מחקרים התפתחותיים, והוא מתאים במיוחד עבור המוח החזותית. למדידות פונקציונלי של ביצועים ויזואליים, electroretinography (ארג) היא שיטה לא פולשנית אידיאלי, אשר כבר מבוססת היטב במינים חוליות גבוה יותר. גישה זו הולך וגובר לבחינת בפונקציה חזותי דג זברה, כולל הזחל התפתחותי מוקדם. אולם, האלקטרודה ההקלטה הנפוץ ביותר עבור זחל דג זברה ארג לתאריך היא האלקטרודה micropipette זכוכית, אשר דורש ציוד מיוחד עבור ייצור שלה, מציגה את אתגר עבור מעבדות עם משאבים מוגבלים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ארג דג זברה זחל באמצעות אלקטרודה בצורת חרוט ספוג-טיפ. האלקטרודה הרומן קל ייצור, ידית, חסכוני יותר, וסביר פחות נזק לעין זחל מאשר micropipette זכוכית. כמו שיטות ארג שפורסמו בעבר, בפרוטוקול הנוכחי יכול להעריך הפונקציה הרשתית החיצונית באמצעות קולט אור ותגובות תא דו-קוטבי, - ו b-גל, בהתאמה. הפרוטוקול יכול בבירור להמחיש את העידון של תפקיד הראייה במהלך הפיתוח המוקדם של הזחלים דג זברה, המשנה את השירות, רגישות, והאמינות של האלקטרודה הרומן. האלקטרודה פשוטה הוא שימושי במיוחד בעת הקמת מערכת ארג חדשה או שינוי הקיים קטן-חיה ארג מכשירי מדידה דג זברה, בסיוע חוקרים במדעי הנורולוגיה חזותי לשימוש של דג זברה דגם האורגניזם.
Introduction
דג זברה (רזבורה rerio) הפך להיות בשימוש נרחב מודל חוליות גנטי, כולל לימודי הנורולוגיה חזותיים. הפופולריות הגוברת של מין זה ניתן לייחס יתרונות כולל נוחות של הנדסה גנטית, שנשמרת מאוד מערכת הראייה חוליות (נוירון סוגים, מורפולוגיה אנטומיים, הארגון וגנטיקה הבסיסית), פוריות גבוהה עלות נמוכה יותר של גידול לעומת מודלים בתרבית של1. Electroretinogram לא פולשנית (ארג) זמן שימש קלינית כדי להעריך את תפקיד הראייה האנושית, ואת בהגדרת מעבדה לכמת ראייה בטווח של מינים גדולים וקטנים, כולל מכרסמים ו-2,דג זברה זחל3 , 4 , 5. הרכיבים ארג שנותחה הנפוצים ביותר הם-גל ו b-גל, שמקורם photoreceptors אור חישה של הפרעה דו קוטבית interneurons, בהתאמה. דג זברה זחל, שכבות נפרדות ברשתית הנקבעים על-ידי 3 ימים לאחר ההפריה (dpf), המורפולוגיה של קונוס קולט אור מסוף synapses בוגרת לפני dpf 46,7. הפונקציה הרשתית החיצונית של דג זברה זחל וכך נוסדה לפני dpf 4, כלומר ארג הוא מדיד מגיל צעיר זה ואילך. בגלל מחזור ניסיוני קצר והמאפיינים תפוקה גבוהה של המודל, ארג הוחלה על זחל דג זברה להערכה תפקודית של המחלה מודלים, ניתוח ראיית צבע ופיתוח רשתית, לומדים מקצבים השעון הביולוגי חזותי בדיקות סמים8,9,10,11,12.
אולם, לגישות עבור דג זברה זחל ארג יש כמה מורכבויות זה עלול להקשות לאמץ. דג זברה זחל שפורסמו ארג הפרוטוקולים המשתמשים בדרך כלל micropipette הזכוכית מולאו נוזל מוליך ההקלטה אלקטרודה3,4,5,13, אשר דורשת micropipette באיכות גבוהה עצה3. ציוד מיוחד, כמו פולר micropipette ובמקרים מסוימים microforge, נדרשים לייצור שלהם. זה יכול להיות אתגר עבור מעבדות עם משאבים מוגבלים, מוביל עלויות נוספות גם כאשר בהתאמת זמינים קטנים בעלי חיים ארג מערכות למדידת תפקוד חזותי דג זברה זחל. גם כאשר החליק, קצה חד micropipette עלולה לגרום נזק פני השטח של העין זחל. בנוסף, מחזיקי micropipette מסחרי אלקטרופיזיולוגיה בנויים עם חוט כסף קבוע. אלה קבוע חוטים להפוך passivated לאחר השימוש החוזרות על עצמן, דרישת הרכישה של מחזיקי חדש המוביל עלויות תחזוקה מוגברת.
כאן נתאר שיטת ארג באמצעות אלקטרודה הקלטה בצורת חרוט ספוג-עצה, זה שימושי במיוחד בהתאמת הוקמה setups ארג קטן-חיה למדידות ארג דג זברה זחל. האלקטרודה מתבצע בקלות בעזרת ספוג דבק פלסטי (PVA) נפוץ בסדר חוט כסף ללא כל ציוד מיוחדים אחרים. הנתונים שלנו מראים כי אלקטרודה הרומן הזה הוא רגיש ולא אמין מספיק כדי להדגים התפתחות תפקודית של המעגלים העצביים רשתית בדג זברה זחל בין 4 ו-7 dpf. אלקטרודה חסכוני ומעשי ספוג-עצה זו עשויה להועיל לחוקרים הקמת מערכות ארג חדשות או שינוי קיימות מערכות קטנות-חיה, ללימודי דג זברה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים electroretinogram (ארג) בוצעו על פי הוראות הקוד המועצה למחקר רפואי ובריאות הלאומית האוסטרלית של תרגול על הטיפול בבעלי החיים ואושרו על-ידי ועדת האתיקה בעלי חיים מוסדיים- באוניברסיטת מלבורן.
1. מאגר הכנה
- להכין את 10 x מאגר דגי זהב רינגר (1.25 מ' NaCl, 26 מ מ אשלגן כלורי, 25 מ מ CaCl2, 10 מ מ MgCl2, גלוקוז 100 מ מ, 100 מ מ HEPES) באמצעות מים אוסמוזה הפוכה (RO). להתאים את המאגר כדי pH 7.8 ולחטא את המאגר באמצעות מסנן μm 0.22. לאחסן מאגר 10 x-4 מעלות צלזיוס כ פתרון מניות3.
הערה: 10 x המאגר רינגר אמור לשמש בתוך 3 חודשים. - ביום של הניסוי, לעשות 1 x מאגר דגי זהב רינגר על ידי דילול של 10 x המאגר דגי זהב רינגר באמצעות מים אוסמוזה הפוכה.
הערה: 1 x המאגר דגי זהב רינגר משמש את הספוג PVA, כולל ספוג המשמש את המיקום של דג זברה זחל, וגם את הספוג על קצה האלקטרודה הקלטה עיתוני.
2. אלקטרודה הכנה
-
להכין את האלקטרודה הקלטה ספוג בצורת חרוט.
- לחתוך לסוף זכר מהשלוחה עופרת אלקטרודת פלטינה ולהסיר מקצה 10 מ מ של ציפוי טפלון החיצוני בידוד באמצעות להב סכין. . שמור על עצמך שלא יגרמו נזק הכבל הפנימי של ההפניה אלקטרודה.
- לחתוך באורך 40 מ מ של חוט כסף (0.3 מ מ קוטר) ולצרף באופן מאובטח זה להפניה אלקטרודה על ידי השילוב את החוט כסף עם החוט הפנימי חשוף. לשים בארגז המפרק באמצעות סרט בידוד, עוזב ~ 15 מ"מ אורך חוט כסף חשופים (איור 1 א').
- Electroplate את החוט החשוף כסף כלוריד באמצעות מקור V DC 9 60 s כדי לשפר את האות הולכה. לטבול את הטיפ כסף חשוף בתוך תמיסת מלח וחבר את הקצה השני למסוף החיובי של הסוללה. התחבר עוד ציתות למסוף שלילית של הסוללה, לטבול את הקצה השני של החוט לתוך מלוחים2.
הערה: לחלופין, chlorinate את החוט כסף בהשריה למשך שעה בפתרון אקונומיקה (המרכיב הפעיל 42 g/L נתרן תת-כלורי). - חותכים כיכר ~ 20 מ מ x 20 מ מ של PVA ספוג באמצעות מספריים כדי להפוך קונוס (איור 1 א'). להרוות את הספוג באמצעות 1 x מאגר רינגר. תחת מיקרוסקופ עם בר בקנה מידה על העינית, להשתמש בלהב האזמל לעצב השיא של קונוס עם ~ 40 µm הקוטר. האוויר יבש הספוג בצורת חרוט על רקמת נייר סופג עד שהכל אחיד.
הערה: הספוג PVA מתרחב באופן משמעותי כאשר רווי, ולכן חשוב כי הספוג קודם רווי תמיסת מלח לפני בעיצוב השיא של קונוס. - לאחר chloriding, אוויר יבש החוט כסף רקמות סופג עבור 5 דק להוסיף את החוט כסף לתוך הספוג PVA מיובשים, מוצק, בצורת חרוט דרך הבסיס של קונוס. לבודד כל מתכת חשופים עודף באמצעות מסיכת הקלטת כדי להפחית לכלוכים פוטו (איור 1B-C).
הערה: לאחר כל מפגש ניסיוני, הסר את הספוג החוט כסף. לשטוף את הספוג באמצעות אוסמוזה הפוכה מים ואוויר יבש לשימוש חוזר. כדי להבטיח אוסף אופטימלי איתות, מומלץ שימוש אחד של חוט כסף. ספוגים PVA לא חוזר יותר מ 5 פעמים. - ביום של הניסוי, לטבול הספוג-קצה האלקטרודה הקלטה 1 x מאגר רינגר למשך 15 דקות לפחות באופן מלא עיתוני הספוג.
- להכין אלקטרודות ייחוס כמתואר לעיל, אך מבלי לצרף את הטיפ ספוג.
- להשיג את האלקטרודה קרקע מסחרית.
3. דג זברה הכנה
- כהה להתאים דג זברה הזחלים בן לילה (> 8 שעות) לפני הקלטות על-ידי הצבת דג זברה בשפופרת 15מל (< הזחלים 20 למחזור) עטוף בנייר אלומיניום ב חממה כהה. הסר את המכסה כדי להבטיח אספקת חמצן נאותה.
- ביום של הקלטה, להדק את המכסה את הצינור בז עטופים בנייר כסף המכילים הזחלים ולהבטיח כי הצינור הוא אור-הוכחה. תחבורה הזחלים למעבדה ארג.
- יוצקים את הדגים פטרי בחושך בסיוע העמום תאורה אדום מ דיודות פולטות אור (LED; 17.4 cd.m-2, λמקסימום 600 ננומטר). מכסים פטרי באמצעות אור-הוכחה מגבות כדי למזער חשיפה קלה.
4. ספוג פלטפורמה הכנה
- חותכים מלבן של ספוג יבש PVA להשתלב בקלות לכף 35 מ מ פטרי. ודא כי עובי הספוג צריך להיות שווה בערך עומק הפטרי.
- לעשות חתך קטן אנכית דרך קצה אחד של הספוג כדי להכיל את החוט כסף של האלקטרודה הפניה.
- משרים את הספוג PVA 1 x מאגר דגי זהב רינגר עד רוויה. אז, במקום את הספוג בצלוחית נקי 35 מ מ. השתמש מגבת נייר סופג נוזל נוסף עד אין פתרון מפריש מן הספוג בתגובה מכבש אצבע האור.
5. החיה והמיקום אלקטרודה
- עזים ומתנגד הזחלים באמצעות tricaine 0.02% בדילול 1 x מאגר דגי זהב רינגר.
- השתמש 3 מ ל פסטר פיפטה להעברת של זחל anesthetized על ריבוע של נייר מגבת (2~ 3 ס מ).
- מניחים מגבת הנייר המכיל את הזחל על פלטפורמת ספוג לח באמצעות מלקחיים. להשתמש במברשת בסדר טבולים המאגר רינגר כדי לכוונן את המיקום של הזחל. ודא שכי עין אחת פונה כלפי מעלה, מבודד מן הנוזל הסמוך על הריבוע של נייר מגבת מתחת הזחל.
- גלזורה הגוף זחל, לא כולל הראש, עם לחות ג'ל לאזור העיניים כדי לשמור את הזחל לחות במהלך ההקלטה ארג.
- מקם את צלחת פטרי עם ספוג פלטפורמה על פלטפורמה המחוממת מים קטן מול גירוי אור הקערה Ganzfeld ממוקם בתוך כלוב פאראדיי (איור 1D).
הערה: תחזוקה של הטמפרטורה של הספוג וגוף זחל מבטיחה אותות ארג יציב. - הכנס האלקטרודה הפניה לתוך החתך עשוי סמרטוט פלטפורמה (איור 1D).
- להתחבר האלקטרודה קרקע מסחרית שהושג כלוב פאראדיי.
- לצרף האלקטרודה הקלטה מחזיק האלקטרודה ולאבטח את המחזיק הזרוע stereotaxic של micromanipulator (איור 1D). השתמש 3 מ ל פסטר פיפטה לטפטף טיפה אחת של 1 x תמיסת רינגר על ספוג קצה האלקטרודה ' רוויה ' מחדש.
- הצב המיקרוסקופ בכלוב פאראדיי הפלטפורמה ארג השמה של האלקטרודה.
הערה: תאורה צריך להינתן על-ידי דים LED אדום (17.4 cd.m-2, λמקסימום 600 ננומטר) כדי לאפשר התבוננות הזחל השמה של האלקטרודה פעיל, תוך שמירה על dark-adaptation. - להתאים את המיקום של פלטפורמת ספוג כדי לאפשר התבוננות הזחל מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, השתמש רקמות סופג כדי להסיר עודפי נוזלים מן קצה ספוג אלקטרודה.
- מקם האלקטרודה פעיל כך הוא נוגע בעדינות על פני הקרנית במרכז העין דג זברה זחל (איור 1E).
- להעביר את קערת Ganzfeld לעבר הרציף ספוג ולהבטיח כי הזחל מכוסה על ידי הקערה.
- סגור את כלוב פאראדיי כדי להפחית את הרעש האלקטרומגנטי מיותר.
6. Electroretinogram הקלטה
-
להשתמש בתוכנה במחשב של מערכת מסוימת ארג (לפרטים, ראה טבלה של חומרים) כדי לעורר את הגירוי ולרכוש נתונים בהתבסס על ההגדרות מומלץ מתחת2.
- הגדר את קצב הדגימה של המערכת 4 KHz מעל ms 650 הקלטה חלון (2,560 נקודות) רכישת התוכנה.
- הגדר את הרווח של המערכת 1,000 ×.
- הגדר הלהקה לעבור סינון של המערכת כדי 1 – 300 הרץ.
- השתמש במסנן חריץ כדי להפחית 60 הרץ (או 50 הרץ, בהתאם תדירות השירות המקומי) רעש.
הערה: רמת הרעש אידיאלי צריך להיות לא יותר מאשר ±10 µV.
-
להתחיל אוסף נתונים באמצעות ההליך המתואר להלן.
- השתמש במבחן יחיד-הבזק (יומן 0.06 cd.s/m2) למדוד לתגובה מבחן של העין כדי להעריך את מיקום אלקטרודות.
הערה: זה עוצמת המבחן פלאש צריך לגרום משרעת גלי-b גדול מ- µV 25 ב 4-dpf הזחלים. אם לא ניתן למדוד לתגובה חזקה, מיקום האלקטרודות ואז לעשות עוד מבחן פלאש כדי לאשר כי האלקטרודות ממוקמות היטב. - בעקבות הבדיקה-הפלאש, לאפשר את בעל החיים כהה להתאים עבור 3 דקות בחושך מוחלט לפני הקלטות.
- הציגו הבזקים של עמעם את עוצמות אור בהיר יותר.
- אותות ממוצע מעבר חוזר על פי רמת האות לרעש.
הערה: באופן כללי, ממוצע אותות יותר ברמות האור דימר (לא פחות מ 3 חזרה), פחות ברמות אור בהיר יותר (בדרך כלל אני חוזר 1). בהדרגה להאריך את מרווח הזמן בין הגירוי מ-10 ל-60 s מרמת האור dimmest את המבריקים. פרוטוקול מדגם מוצג בטבלה 1. - לאחר ההקלטות, בצורה הומאנית להרוג הזחלים באמצעות tricaine 0.1%.
- השתמש במבחן יחיד-הבזק (יומן 0.06 cd.s/m2) למדוד לתגובה מבחן של העין כדי להעריך את מיקום אלקטרודות.
7. ניתוח
- למדוד את משרעת-גל מקו לשוקת-גל שלילי והמרביים b-גל שוקת-גל שלילי אל פסגת b חיובי-גל.
- למדוד את ו b-גל מרומזת פעמים מתחילת גירוי את השוקת של-הגל, הפסגה של b-הגל, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סעיף זה מספק תוצאות נציג למדידות ארג שנלקחו מדי יום 4 כדי 7 dpf. מ- 4 dpf, ארג תגובות להציג רכיבי ו- b-גלים חזקים, אשר נובעים photoreceptors של תאים דו-קוטביים, בהתאמה. כל גיל שנבדקו, משרעת של b-הגל גדל עם עוצמת האור (איור 2; איור 3). ראוי לציין, את הרגישות של הרשתית דג זברה זחל כדי הבזקים דימר עולה עם הגיל. - ו b-הגל לא היו לזיהוי על עוצמות נמוך יותר מאשר-1.61 להיכנס cd.s/m2 -4 dpf, ואילו אותות ברורה היו לזיהוי-אלה עוצמות עבור הזחלים בוגרים (איור 2). התגובה b-גל גדל באופן משמעותי בין dpf 4 ו- 5 (P < 0.0001; איור 2A -B; איור 3B). למרות b-הגל-בעוצמות נמוכות הראה שינוי קטן בין 5 ל 7 dpf, האות-יומן 2.48 cd.s/m2 היה גדול ב- dpf 7 לעומת dpf 5 ו- 6 (P < 0.0001; איור 2; איור 3B). A ו- b-גל מרומזת פעמים הפך מהר יותר באופן משמעותי לאחר 5 dpf (P < 0.0001; איור 3C -D). באופן כללי, תוצאות אלו מדגימים ההבשלה של דג זברה פונקציה רשתית בין 4-7 dpf. מעניין, משרעת-גל הופיע כדי להקטין בין 5 ל 7 dpf (איור 3 א). ייתכן כי ההבשלה של קשרים סינפטיים ברשתית החיצוני מתקצר ההשהיה של תאים דו-קוטביים תגובות, וכתוצאה מכך התפרצות b-גל מהיר מסכות-הגל. כל מי שרוצה ללמוד-הגל יכול להעסיק טיפול תרופתי כדי לחסום תגובות פוסט-photoreceptoral (כלומר רכיב b-גל).
איור 1: דג זברה G anzfeld ארג לשדך את האלקטרודה בצורת חרוט ספוג-עצה. (א) הספוג בצורת קונוס קצה האלקטרודה כסף למשפחה עם ילדים הם אוויר יבש לפני בניית האלקטרודה ספוג-טיפ. (בג) לאחר מכן, החוט כסף עם כלור מוכנס לתוך קונוס ספוג דרך הבסיס ליצירת האלקטרודה מלאה. (ד) בכיוונון ארג Ganzfeld דג זברה זחל טיפוסי, האלקטרודה הפניה מוכנס לתוך פלטפורמת ספוג ומכוסה הזחל דג זברה הקערה Ganzfeld. אלקטרודה (E) הספוג-הטיפ נוגע בעדינות על פני הקרנית במרכז העין זחל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: נציג עקבות ארג הממוצע של פראי-סוג הזחל דג זברה. ממוצע ארג עקבות של דג זברה wildtype (א) 4 dpf (n = 8), (B) 5 dpf (n = 8), (ג) 6 dpf (n = 7), ו- (ד) 7 dpf (n = 9). התגובות היו elicited באמצעות הבזקים של נוריות לבנות. בכל גיל, העקבות הצג תגובות הבזקי (מלמטה למעלה)-2.75,-2.11,-1.61,-0.81, 0.06, 0.72, 1.55, 1.89, 2.18, 2.48 להיכנס cd.s/m2. סרגל קנה מידה = 50 µV. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ארג ו- b-גל amplitudes והשעות מרומזת עבור 4-7 dpf דג זברה. (א) קיבוץ ממוצע (± שגיאת התקן של הממוצע)-גל משרעת גדל עם ההבזקה אבל פחתה עם גיל 4-7 dpf הזחלים. משרעת גלי-b ממוצע (B) ב 4 – 7 dpf הזחלים גדל עם ההבזקה; משרעת גדל בין dpf 4 ו- 5. (ג) ממוצע-גל מרומזת וזמן (D) b ממוצע-גל מרומזת הפך מהיר יותר בין dpf 5, 6 ו- 7. שורות מיטבית נגזרות רגרסיה ליניארי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| עוצמת האור של הגירוי (יומן cd.s.m-2) | מספר חזרה | מרווח בין הגירוי (s) |
| -2.75 | 3 עד 6 | 10 |
| (30 s לפני הבא) | ||
| -2.11 | 3 עד 6 | 10 |
| (30 s לפני הבא) | ||
| -1.61 | 3 עד 6 | 10 |
| (30 s לפני הבא) | ||
| -0.81 | 3 עד 6 | 10 |
| (60 s לפני הבא) | ||
| 0.06 | 3 עד 6 | 10 |
| (60 s לפני הבא) | ||
| 0.72 | 1 עד 3 | 60 |
| 1.55 | 1 עד 3 | 60 |
| 1.89 | 1 עד 3 | 60 |
| 2.18 | 1 עד 3 | 60 |
| 2.48 | 1 עד 3 | 60 |
טבלה 1: דוגמה פרוטוקול של הקלטות ארג. מצגות הגירוי מתחיל מן dimmest (למעלה) התקדמות בהיר יותר רמות האור (למטה), עם למחמיר יותר גירוי בין מרווחי כדי להבטיח שהתאקלמות האפל הזה נשמר. המספר של אותות בממוצע בעוצמה כל תלוי ברמת אות לרעש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המפרט פונקציונליים כגון ארג הפכו יותר ויותר חשוב בסוויטת הכלים המשמשים ללמוד דג זברה הזחל8,9,12,14. בשל גודל קטן של העין דג זברה זחל, זכוכית micropipettes כבר הסתגלו כמו הקלטה אלקטרודות ביותר שפורסמה בפרוטוקולים3,4,5,8,9 , 12 , 13 , 14. כאן אנו מתארים את פרוטוקול ארג דג זברה זחל באמצעות אלקטרודה בצורת חרוט ספוג-עצה פשוטה יותר של. האלקטרודה הרומן יכול לשמש כדי לשנות את תקן מערכות ארג קטן-חיה כדי למדוד דג זברה זחל פונקציה ברשתית ללא כל ציוד נוסף. החומרים להכנת האלקטרודה ספוג-עצה הם פשוט מסחרי PVA ספוג חוט כסף 0.3 מ מ, מה שהופך את זה חסכוני יותר מאשר הגישות הקודמות. יתרון נוסף הוא כי, בניגוד הטיפ micropipette קשה וחד, קצה ספוג אלקטרודה עדינה היא הסבירות לפגיעה העין זחל. לבסוף, הספוג PVA מסייעת לשמור על לחות העין זחל במהלך ההקלטה.
המפתח ליישום מוצלח של האלקטרודה ספוג-טיפ נועד להבטיח לרוויה מלאה של הספוג. זה בדרך כלל לוקח לא פחות מ 15 דקות של ספוג את 1 x מאגר דגי זהב רינגר. רווית לא שלם של הספוג יכול להגביר את רמת הרעש עקב ייבוש מהיר של האלקטרודה. אוסף אות טוב יותר, ביצוע אלקטרודות חדשה עבור כל מושב ניסיוני (בדרך כלל < 8 h) מומלץ בחום. שימוש חוזר יכול להוביל אותות ארג מופחתת, ביצוע השוואות בין הפעלה קשה יותר.
בעת ביצוע מיקום של דג זברה זחל על הפלטפורמה ספוג, יש לנקוט על מנת להבטיח כי העין כדי למדוד לא קשר עם כל פתרון שמסביב או מגבת הנייר מתחת הדגים. קשר כזה מכנסי המעגל החשמלי, כפי האלקטרודה הפניה שמוטבע פלטפורמת ספוג ומפחית את ארג.
אפילו עם אלקטרודה טוב רווי ספוג טיפים, ייבוש הדרגתי מתרחש, אשר מתבטא כמו רעש מוגבר בארג אותות. אם זה קורה, לטפטף טיפה אחת של 1 x דג זהב רינגר על גבי הבסיס של קונוס באמצעות מזרק 1 מ"ל, מחט 30 G x ½". אם הוספת פתרון קצה ספוג אינו מקטין את רמת הרעש, בדוק כי העין אינה במגע עם נוזל שמסביב ולהבטיח כי קצה האלקטרודה ממורכזת על השיא הקרנית.
ההקלטות התוצאות נציג המובאות כאן נעשו עם הגדרת bandpass של 1 – 300 הרץ, אשר אינו מאפשר דגימה של פוטנציאל מתנדנדות (OP) — wavelets ב b-הגל הנגזרות מסדר שלישי הנוירונים ברשתית כולל אמקרין ולא גנגליון תאים 15,16,17. הגדרת lowpass גבוהה יותר (למשל, 500 או 1000 Hz) ייתכן יותר מתאים עבור OP הקלטה.
לסיכום, האלקטרודה בצורת חרוט ספוג-טיפ מסייעת לפשט את הזחל דג זברה ארג הקלטה עם מערכות ארג קטן-חיה קיימות, מתן תוצאות אמינות. התוצאות נציג מדגימים כי משרעת ארג גדל בין dpf 4 ו- 5, עם התבגרות נוספת בין 5 ל 7 dpf מפגין כמו מהר יותר מרומזת פעמים. פרוטוקול ארג פשוטה שלנו עם האלקטרודה חסכוני ומעשי בצורת חרוט ספוג-טיפ יכולים ליהנות החוקרים ללמוד פונקציה ברשתית דג זברה. ניתן גם להתאים את הטכניקה כדי להעריך דג זברה למבוגרים או דגמים אחרים חוליות עם עיניים קטנות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש גילויים לא רלוונטי לעבודה זו.
Acknowledgments
המימון לפרויקט זה סופק על ידי מענק מהמכון Neuroscience מלבורן (כדי PTG, PRJ & BVB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
| 1 mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
| 30 G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
| Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
| Circulation water bath | Lauda-Ko?nigshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
| Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
| Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
| Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
| Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
| Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
| PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
| Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
| Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
| Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
| Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |
References
- Roper, C., Tanguay, R. L. Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. , Academic Press. 143-151 (2018).
- Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. , e54158 (2016).
- Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae. Journal of visualized expriment: JoVE. (97), (2015).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 57-68 (2002).
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot4973 (2008).
- Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C., Kohler, K. Synaptic plasticity and functionality at the cone terminal of the developing zebrafish retina. Developmental Neurobiololgy. 56 (3), 222-236 (2003).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Developmental Neurobiololgy. 72 (3), 302-327 (2012).
- Saszik, S., Bilotta, J., Givin, C. M. ERG assessment of zebrafish retinal development. Visual Neuroscience. 16 (5), 881-888 (1999).
- Niklaus, S., et al. Cocaine accumulation in zebrafish eyes leads to augmented amplitudes in the electroretinogram. Matters. 3 (6), e201703000003 (2017).
- Tanvir, Z., Nelson, R. F., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic ERG. Disease models & mechanisms. , dmm. 035220 (2018).
- Kakiuchi, D., et al. Oscillatory potentials in electroretinogram as an early marker of visual abnormalities in vitamin A deficiency. Molecular medicine reports. 11 (2), 995-1003 (2015).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Zebrafish larvae lose vision at night. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 205-210 (2004).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Developmental Dynamics. 222 (4), 564-570 (2001).
- Cameron, M. A., Barnard, A. R., Lucas, R. J. The electroretinogram as a method for studying circadian rhythms in the mammalian retina. Journal of genetics. 87 (5), 459-466 (2008).
- Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. Extraction and modelling of oscillatory potentials. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 17-36 (2002).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. The Journal of Physiology. 555 (1), 153-173 (2004).
