Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Искусственные РНК-полимераза II Удлинение Комплексы для вскрытия co-транскрипционной РНК обработки событий

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59497
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Kansas University Medical Center

Summary

Здесь мы описываем сборку РНК-полимеразы II (Pol II) удлиненных комплексов, требующих только коротких синтетических ДНК и Олигонуклеотидов РНК и очищенных Пол II. Эти комплексы полезны для изучения механизмов, лежащих в основе совместной транскрипционной обработки стенограмм, связанных с комплексом удлинения Пол II.

Abstract

Эукариотический синтез мРНК представляет собой сложный биохимический процесс, требующий транскрипции шаблона ДНК в прекурсор РНК многосубединым ферментом РНК-полимераза II и сотранскрипционным укупоркой и сплайсингом РНК-прекурсора для формирования зрелой мРНК. Во время синтеза мРНК комплекс удлинения РНК-полимеразы II является мишенью для регулирования большой коллекцией транскрипционных факторов, контролирующих его каталитической активностью, а также укупорки, сращивания и 3'обработки ферментов, которые создают зрелые мРНК. Из-за присущей им сложности синтеза мРНК более простые экспериментальные системы, позволяющие проводить изоляцию и исследование различных стадий сотранскрипции, обладают большой полезностью.

В этой статье мы описываем одну из таких простых экспериментальных систем, пригодных для исследования котранскрипционной РНК-укупорки. Эта система опирается на определенные комплексы рнк-полимеразы II, собранные из очищенной полимеразы и искусственных транскрипционных пузырьков. При обездвижении с помощью биотинителированной ДНК эти комплексы рнк-полимераза II удлинения обеспечивают легко манипулируемый инструмент для вскрытия котранскрипционной РНК-укупорки и механизмов, с помощью которых комплекс удлинения набирает и регулирует укудчивую фермент во время скотрансктионная РНК укупорки. Мы ожидаем, что эта система может быть адаптирована для изучения набора и/или сборки белков или белковых комплексов с ролями на других стадиях созревания мРНК в сочетании с комплексом вытяжения РНК-полимеразы II.

Introduction

Эукариотический посыльный РНК (мРНК) синтез является сложным биохимическим процессом, который включает в себя синтез необработанной РНК-прекурсоров РНК-полимераза II и обработка РНК-прекурсора для получения зрелой мРНК. Этапы обработки РНК, укупорки, сращивания и полиаденилаации выполняются в основном совместно транскрипционно. Комплекс удлинения Pol II служит эшафотом, который вербует и организует деятельность многих ферментов обработки РНК. Следовательно, наше окончательное понимание того, как образуются зрелые эукариотические мРНК, будет в значительной степени опираться на разработку экспериментальных систем, позволяющих рассеивать биохимические механизмы, лежащие в основе набора в удлинение комплекса и регулирование ферментов, ответственных за совместное транскрипционное укупорки, сплайсинг и полиаденилацию.

Неудивительно, что разработка таких экспериментальных систем была сложной задачей. Основным препятствием была замечательная сложность самой транскрипции Pol II, где просто ездовестяя базальную транскрипцию Pol II in vitro требует минимального набора из пяти общих факторов инициации транскрипции: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF и TFIIH 1. Кроме того, восстановление любого вида регулируемой транскрипции Pol II in vitro требует еще большего набора транскрипционных факторов и корегуляторов. Таким образом, основной целью было разработать более простые экспериментальные системы, позволяющие воссоздать активные комплексы удлинения Pol II, пригодные для исследования функционального соединения транскрипции Пол II и обработки РНК.

Один из таких простых методов для восстановления активных комплексов удлинения Пол II оказался полезным для структурных и биохимических исследований удлинения Pol II и, в последнее время, для исследования совместной транскрипционной обработки РНК2,3 ,4,5. В этой статье мы покажем, как комплексы удлинения Pol II, приготовленные из очищенного Поля II и синтетических пузырей транскрипции, могут быть эффективно использованы для исследования механизмов, лежащих в основе котранскрипционного укупорки зарождающихся транскриптов Pol II.

Capping относится к ковалентное добавление 5'-гуанозин "шапка" на 5'-трифосфат конце зарождающейся Пол II стенограммы. Крышка важна для последующих этапов созревания мРНК, транспортировки, перевода и других процессов6,7. Крышка добавляется совместно транскрипционно в пол II стенограммы фермента называют укупорки фермента. В клетках млекопитающих активные участки, ответственные за РНК 5'-трифосфатаза и гуанилил трансферазы деятельности фермента укупорки, содержатся в одном полипептиде8. Фермент укупорки завербован к комплексу удлинения Pol II через взаимодействия с еще не определенными поверхностями на теле Pol II и домене rpb1 carboxy-терминального (CTD) фосфорилона на Ser5 его гептапептида повторяет5. В комплексе удлинения фермент укупорки катализает добавление крышки 5'-гуанозин, как только зарождающийся транскрипт достигает длины не менее 18 нуклеотидов и вышел из канала выхода из полимеразной РНК. На первом этапе реакции укупорки, трифосфатазы гидролизов РНК 5'-трифосфат аудионизирует 5'-дифосфат. На втором этапе GTP гидролизуется до GMP гуанилил-трансферазой, образуя промежуточный фермент GMP-capping. Наконец, гуанылил трансферазы передает GMP в 5'-дифосфатный конец зарождающегося транскрипта для получения крышки.

Примечательной особенностью укупорки реакции является то, что совместнотранскрипционные укупорки (т.е. укупорки стенограмм, связанных с функциональными комплексами удлинения Пол II) является гораздо более эффективным, чем укупорки свободной РНК5,9. Таким образом, главный вопрос в этой области заключается в том, как эта драматическая активация укупорки достигается через взаимодействие фермента укупорки с комплексом удлинения Pol II. В этом протоколе мы описываем сборку активных комплексов рнк-полимеразы II с использованием только очищенной РНК-полимеразы II и искусственных транскрипционных пузырей. Эти методы позволяют создавать удлинение РНК-полимераза II комплексов с транскриптами определенной длины и последовательности. В недавнем исследовании, мы использовали эти определенные РНК полимеразы II удлинение комплексов в качестве модели для изучения аспектов механизмов РНК укупорки5. В частности, мы показали, что (i) укупорки РНК, связанные с этими удлинением комплексов, были более чем в 100 раз более эффективными, чем ограничение свободной РНК и (ii) стимулировалось TFIIH-зависимым фосфорилированием Pol II CTD. Описанный здесь подход в принципе можно было бы адаптировать для генерации субстратов для изучения других реакций по обработке РНК, связанных с комплексом удлинения Пол II.

В разделе 1 этого протокола, искусственные комплексы удлинения создаются путем аннулирования синтетического шаблона нити ДНК олигонуклеотида к Олигонуклеотид РНК, который дополняет в своем 3'-end примерно 9 нуклеотидов шаблона нити ДНК. Пол II затем загружается на ДНК: РНК дуплекс. Удлинение комплекс затем завершается добавлением частично дополняющих, не-шаблон наяп ДНК олигонуклеотида, который помечен с биотином на его 3'-конец (Рисунок 1 и Рисунок 2A). Олигонуклеотид РНК продлевается Полом II в этих удлиненных комплексах, чтобы сделать радиомаркированные транскрипты определенной длины и последовательности при добавлении соответствующих комбинаций радиомаркированных нуклеотидов. Кроме того, используя комбинацию смок для удаления неинкорпорированных нуклеотидов и дальнейшего добавления различных комбинаций нуклеотидов, можно «ходить» пол II в разные позиции по шаблону ДНК и синтезировать РНК определенных длин. РНК затем очищается и подвергается электрофорезу в денатурируя гели мочевины-PAGE. В разделе 2 протокола для анализа котранскрипционной РНК-укупорки используются комплексы искусственного удлинения. В приведенном примере представлены меры воздействия фосфорилирования TFIIH на совместное транскрипционное укупорки РНК. В этом эксперименте мы измеряем степень котранскрипционного укупорки как функцию укупорки концентрации фермента (5, 15 и 45 нг на реакцию) и время (1, 2 и 4 мин).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Сборка искусственных удлинений комплексов и Пол II Ходьба

  1. Обездвижить 1 нмоль нешаблонного олиго ДНК, содержащего молекулу биотина 3' на магнитных бусинах.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Следующие шаги можно сделать заранее, чтобы подготовиться к будущим экспериментам. Все последовательности олиго, используемые в этом протоколе, приведены в таблице1. ОлигорнЫ РНК синтезируются с 5'-трифосфатных модификаций.
    1. Добавьте 200 л магнитных бусин (10 мг/мл) в трубку с низким содержанием белка 1,5 мл, а затем поместите на магнитную стойку на 2 мин.
    2. В то время как трубка находится на магнитной стойке, удалить жидкость из трубки, не нарушая бисера. Чтобы вымыть бисер, снимите трубку со стойки, добавьте 1 мл 5 мМ Tris-HCl pH 7.5, 0,5 мМ EDTA, 1 M NaCl, верните трубку в стойку и удалите раствор для мытья после 2 мин.
    3. Повторите стих стих ает еще 2 раза, используя 200 зл и того же буфера.
    4. Отстегивание магнитных бусин в 400 мл 10 мм Tris-HCl pH 7,5, 1 мМ EDTA, 2 М NaCl, буфер. Затем смешайте с 380 зл и H2O и 20 Зл из 10 мкм нешаблона биотинилатированных ДНК олиго. Поместите трубку на nutator и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
    5. Вымойте обездвиженной нешаблонной ДНК олиго 3 раза с 200 зл и 5 мМ Tris-HCl pH 7.5, 0,5 мМ EDTA, 1 M NaCl, а затем 3 раза с 200 мкм HEPES-NaOH pH 7,9, 20% глицерол, 100 мм KCl, 1 мМ EDTA, 0,5 мг/мл бычьей сыворотки альбумина.
    6. Оставьте трубку на ночь при 4 градусах Цельсия, чтобы закончить блокирование бисера с BSA.
    7. На следующий день поместите трубку в магнитную стойку, снимите и отбросьте жидкость, и отрептите бусы в 200 л 20 ММ HEPES-NaOH pH 7.9, 20% глицерола, 100 мМ KCl, 1 мМ EDTA, 0,5 мг/мл крупной сыворотки и перенос на новую трубку. Для этого шаблона ДНК конечная концентрация составляет примерно 5 км.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации и концентрация олиго должны быть эмпирически определены для каждого биотиниляционного олиго ДНК. Этот шаблон должен обеспечить достаточно для 200 реакций, и длиться по крайней мере 6 месяцев при хранении при 4 градусах Цельсия.
  2. Аннеал РНК и ДНК шаблон атрии олигонос в 2:1 молярное соотношение (20 и 10 рмоль, соответственно), чтобы получить ДНК: РНК дуплекс.
    1. Настройка смеси 10 злеа annealing, как описано в таблице 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 10 юл annealing смеси достаточно для 10 реакций. Annealing смесь может быть масштабирована по мере необходимости, если больше анализов должны быть выполнены.
    2. Выполните annealing реакции в тепловой циклист с помощью следующей программы: 5 мин при 45 градусах Цельсия, а затем 12 циклов по 2 мин каждый, начиная с 43 градусов по Цельсию и снижение температуры 2 градусов по Цельсию за цикл. Простоя при 4 градусах по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это гибкий временной момент. Аннеалинг заканчивается в течение 30 мин, но может быть оставлен при 4 градусах По Цельсию в течение более длительного периода. В лаборатории, annealing смеси были оставлены сидя до 4 ч без наблюдения какого-либо снижения эффективности реакции.
    3. В то время как аннулирование РНК шаблона нити ДНК, подготовить буферы для более поздних шагов протокола. Ингредиенты, необходимые для подготовки каждого буфера для одной реакции с каждым буфером, перечислены в таблицах от 2 до 8. Масштабируйте рецепты в разы в размере 1 евро для мытья и (X-1) для всех других буферов. X - количество реакций, которые должны быть подготовлены; Y - количество необходимых стирок (минимум 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все буферы свежими в день эксперимента. Не размещайте трубки на льду после добавления ПВА в буферы. Добавьте Pol II или нуклеотиды в буферы прямо перед использованием.
  3. Нагрузка очищенная РНК-полимераза II на гибрид ДНК: РНК.
    1. Смешайте 1 пмоль (1 кв л) ДНК: РНК дуплекс с 13 Зл буфера Пол II (из таблицы 3).
    2. Добавьте 0,02 единицы очищенной РНК Pol II (1 квл) в смесь со ступени 1.3.1 и смешайте, аккуратно трубачя вверх и вниз и помешивая кончиком трубы, не вводя пузырьков. Инкубировать в течение 10 мин при 30 градусах По Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы, приведенные отсюда, для одной реакции; масштабировать по мере необходимости для количества реакций в эксперименте. РНК Pol II очищены от печени крысы, как описано10 используется в этом примере; однако, РНК Пол II очищены от других источников, в том числе культивированных клеток млекопитающих или дрожжей также могут быть использованы3,4,5,11,12,13.
  4. Завершите удлинение комплекса путем добавления биотинилатной нешаблонной ДНК.
    1. Добавьте 5 пмоль (1 кЛ) олиго нешаблонной ДНК до 14 qL нешаблонного буфера ДНК (из таблицы4), добавьте в трубку от шага 1.3.2, и инкубировать в течение 10 мин при 37 градусах Цельсия.
    2. Поместите образец в магнитную стойку в течение 2 мин. Вымойте 1x с 30 злителем буфера для мытья (из таблицы7), чтобы удалить неинкорпорированные Пол II и олиго.
  5. Создание удлиненных комплексов, содержащих радиомаркированные РНК 23mers.
    1. Выполните все дальнейшие инкубации при 30 градусах Цельсия. Добавьте 1 кЛ из 15 ММ АТФ и 10 «Ci»L (1 qL) из з--32P UTP (3000 Ci/mmol) к 23 Зл буфера импульса и используйте это для повторной работы промытых магнитных бусин.
      ПРЕДЕКТО: Радиоактивный материал опасен. Убедитесь в том, чтобы носить соответствующее защитное оборудование и следовать всем лабораторным рекомендациям для безопасного использования и удаления радиоактивных материалов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замените радиомаркированный UTP 15 ММ UTP, когда радиомаркированная РНК не требуется, например, для западных экспериментов по блот.
    2. Инкубировать реакцию в течение 10 минут, чтобы синтез радиомаркировки 23mers.
    3. Добавьте 1,5 зл раствора, содержащего 100 ММ АТП и 100 мкм UTP смесь 3,5 л буфера погони, добавить в трубку, содержащую предварительно собранные удлинение комплексов, и инкубировать в течение 5 минут, чтобы преследовать все зарождающиеся стенограммы в 23mers.
    4. Поместите образец в магнитную стойку в течение 2 мин, удалите супернатант, вымойте один раз с 30 зл и буфером для мытья, чтобы удалить неинкорпорированные нуклеотиды, и повторно вновь в 30 зл мыть буфера.
    5. Либо добавить 94 л стоп-миксса с протеиназы K и гликогена(таблица 9) прекратить реакции или перейти к разделу 1.6 для создания удлинения комплексов с более длинными транскриптами или раздел 2 для выполнения укупорки анализы.
  6. (Необязательно) Прогулка Pol II, чтобы сделать 23, 25 и 29 нуклеотидных стенограмм
    1. Следуйте процедуре, описанной в шагах 1.2.1 до 1.5.4 для подготовки удлиненных комплексов, содержащих радиомаркировку 23mers. Масштабируйте в 4 раза, чтобы создать 120 злителкомплексов вымытой удлинения, что достаточно комплексов для 4 реакций.
    2. Этикетка 3 новых труб "23mer", "25mer" и "29mer". Перенесите 30 зл и средств вымытой удлиненных комплексов в трубку «23mer» и добавьте 94 злилок стоп-миксса с протеиназой K и гликогеном.
    3. Поместите трубку, содержащую оставшиеся 90 юрлица промытых удлиненных комплексов, в магнитной стойке на 2 мин, удалите супернатант и отдохните шарики в 90 л БТБ, дополненные 1,2 мЛ каждый из 1,5 мМ АТФ и 1,5 мМ CTP. Инкубировать в течение 10 мин при 30 градусах По Цельсию.
    4. После мытья один раз с 90 qL буфера стирки и resuspending в 90 qL буфера мытья как описано в шаге 1.5.4, перенесите 30 qL комплексов удлинения к пробке «25mer» и добавлено 94 qL смешивания стопа с proteinase k и гликогеном.
    5. Поместите трубку, содержащую оставшиеся 60 юрлица комплексов в магнитной стойке в течение 2 минут, удалите супернатант, и resuspend шарики в 60 Л Л БТБ дополняется 0,8 мл каждый из 1,5 мм АТФ и 1,5 мм CTP.
    6. Инкубировать в течение 10 минут при 30 градусах Цельсия, мыть один раз с 60 qL буфера мытья, как в разделе 1.5.5, и resuspend в 60 qL буфера мытья.
    7. Перенесите 30 qL из 2x образца в трубку "29mer" и либо добавьте 94 л стоп-микса с протеиназой K и гликогеном, либо перейдите в раздел 2 для выполнения анализов укупорки.
    8. Приступай к очищению и анализу РНК (раздел 3).

2. Использование искусственных комплексов удлинения, чтобы ассировать cotranscriptional Capping

  1. Создание промытых удлиненных комплексов, содержащих 23mers путем масштабирования процедуры, описанной в шагах 1.2.1 до 1.5.5 13-кратного раза. Этого достаточно для 12 реакций и 1 дополнительно.
  2. Фосфорилирование Pol II CTD
    1. Поместите трубку, содержащую промытые удлиненные комплексы, в магнитную стойку на 2 мин, удалите супернатант и отдохните шарики в 377 Л БТБ, дополненные 13 юл 1,5 мМ АТФ.
    2. Подготовьте две новые трубки, помеченные как ЗН и -H, соответственно. К трубке с надписью «H» добавляйте 3 qL из 300 нг/Л TFIIH, а к трубке с пометкой -H добавить 9 л 20 мМ HEPES-NaOH pH 7.9, 20% глицерол, 100 мМ KCl, 1 мМ EDTA, 0,5 мг/мл булбума из сыворотки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно используем TFIIH очищенный от печени крысы, но мы получили аналогичные результаты, используя 0,6 мкг/реакцию коммерчески доступных рекомбинантных Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK, который является модулем киназы от TFIIH). Смотрите таблицу материалов для получения информации.
    3. Добавьте 87 qL промытых удлиненных комплексов от шага 2.2.1 к трубке помеченной «H» и 270 зл промываемых удлиненных комплексов к трубке с надписью -H. Инкубировать 10 мин при 30 градусах Цельсия.
    4. Поместите образец в магнитную стойку на 2 мин. Чтобы удалить избыток нуклеотидов и несвязанного белка, промойте удлинение комплексов в реакциях ЗН и -H с 90 qL или 270 зл буфера мытья, соответственно.
  3. РНК-кеппирование
    1. Resuspend удлиненные комплексы в трубке помечены ЗН в 87 л укупорки смеси (BTB дополнен50 ММ GTP (Таблица 10). Resuspend удлиненные комплексы в трубке с пометкой -H в 261 Зл укупорки смеси.
    2. Подготовьте 4 новые трубки с надписью 5 ng CE,H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Разбавлять фермент (CE) в 20 мМ HEPES-NaOH pH 7.9, 20% глицерол, 100 мМ KCl, 1 мМ EDTA, 0,5 мг/мл бычьего сывороточных альбумина для приготовления растворов, содержащих 5 ng CE/l, 15 нг CE/l, или 45 нг CE/l и дозированный 4-й раствор.
    3. Подготовьте 12 новых трубок с добавлением 94 qL стоп-буфера (2.1.1).
    4. Начните каждую укупорковую реакцию, добавив 87 зЛ удлинение комплекса, обработанного TFIIH или не маркированных труб, содержащих фермент укупорки. Инкубировать при температуре 30 градусов в тепловом блоке.
    5. После 1, 2 или 4 мин, остановить реакции, передавая 30 qL каждой реакции смеси в трубки, содержащие 94 л стоп-буфера. Очистите и проанализируйте реакционные продукты, описанные в разделе 3.

3. Очистка и анализ РНК

  1. Очистка РНК
    1. Инкубировать реакционные продукты в стоп-буфере в течение 20 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приостановка точки. Образцы в этом буфере были сохранены на срок до 4 ч без потери или деградации РНК.
    2. Экстракт один раз с 124 л фенола: хлороформ: изоамил алкоголя (25:24:1) и один раз с хлороформом: изоамил алкоголя (24:1).
      ПРЕДЕКТО: Фенол чрезвычайно токсичен и быстро усваивается кожей. Носите соответствующее защитное оборудование.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для максимального восстановления РНК во время извлечения используйте коммерчески доступные трубки, содержащие гель высокой плотности, который образует стабильный барьер между водной и органической фазами. Смотрите Обсуждение и таблицу материалов.
    3. Перенос визуальной фазы (верхний слой) в новые трубки, содержащие 12,4 л 3 М ацетата натрия pH 5.2.
  2. Этанол выпадает
    1. Добавьте 350 л 100% этанола и тщательно перемешайте путем инверсии.
    2. Инкубировать не менее 10 мин на сухом льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приостановка точки. Для удобства можно остановиться здесь и завершить процедуру на следующий день; однако, можно приступить непосредственно к шагу 3.3 и запустить гель в тот же день. РНК можно хранить при -80 градусов в течение нескольких дней до дальнейшей обработки, но не оставлять на более длительные сроки.
  3. Подготовка образцов РНК для геля электрофореза
    1. Разрешить образцы для оттепели, смешать путем инвертирования 2-3 раза, и центрифуга в течение 15 минут при 21000 х г, 4 КК, в столешной центрифуге. Между тем, создать денатурный гель микс (раздел 3.4.1).
    2. Тщательно удалите этанол из образцов, не нарушая гранулы.
    3. Добавить 500 л 70% этанола, инвертировать трубку пару раз, чтобы мыть гранулы, а затем центрифуга снова на 21000 х г в течение 5 минут при комнатной температуре или 4 градуса по Цельсию.
    4. Удалите как можно больше этанола, как это возможно и сделать быстрый спин (5-10 s) из труб в центрифуге столешницы. Затем, с гель-загрузки наконечник, удалить последний оставшийся объем этанола.
    5. Воздушно-сухие гранулы в течение 3 мин при комнатной температуре.
    6. Растворите РНК, добавив 4 Зл из H2O в верхней части каждой гранулы. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре.
    7. Добавьте 4 qL 2x красителя РНК (см. таблицуматериалов) к смешиванию, а затем вихрь каждой трубки в течение нескольких секунд, чтобы полностью восстановить РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: РНК краситель, который содержит формамид вместо мочевины рекомендуется, так как последний осаждает при низких температурах.
    8. Быстро спина труб, а затем инкубировать их при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 10 минут в теплоблоке.
    9. Храните трубки на сухом льду до готовности к загрузке на гель.
      ПРИМЕЧАНИЕ:       Сохранение РНК на сухом льду позволяет гибко работать над другими экспериментами, в то время как гель полимеризуется. Образцы не нужно разогревать после оттаивания. Тем не менее, РНК может быть непосредственно загружена после нагрева, если гель готов к запуску.
  4. Приготовление геля Urea-PAGE
    1. Для смеси геля 40 мл смешайте в конической трубке 50 мл: 16,7 г мочевины, 15 мл 40% бис:акриламидного раствора (19:1 соотношение), 4 мл 10-x TBE (1 M Tris-HCl, 1 М натриевого бората, 20 мм EDTA) и 8 мл H2O. Этот объем достаточен для одного стандартного размера геля (18 см высотой х 16 см в ширину) с 1,0 мм прокладки.
      ПРЕДЕКТО: Акриламид чрезвычайно токсичен. Хотя нет риска ингаляции, когда он находится в растворе, всегда носить лабораторное пальто, перчатки и защитные очки во время обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта смесь предназначена для литья денатурного 15% полиакриламидного геля, который легко разрешает РНК между 15-50 nt. Изменение концентрации бис / акриламид по мере необходимости для решения различных РНК стенограммы различной длины.
    2. Поместите закрытую трубку, содержащую гель смесь на nutator до полного растворения мочевины.
    3. Настроили гель-кастинг со стеклянными пластинами, 1 мм прокладками и 15-колодец.
    4. Работая быстро, добавить 40 л TEMED и 400 л 10% раствора персульфата аммония к раствору геля и хорошо перемешать. Используя трубку 25 мл, залить раствор геля между пластинами, вставить гребень, и позволяют гель полимеризации, по крайней мере 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если гель наливают более чем на 2 ч перед использованием, как только он полимеризованных покрыть его влажным бумажным полотенцем (оставляя гребень на месте) и оберните полиэтиленовой пленкой, чтобы предотвратить его от высыхания.
  5. Денатурирующий гель РНК электрофорез
    1. После полимеризации, передача геля в работающий бак и предварительно запустить его на 20 мА в 1x TBE в течение 15-30 мин.
    2. Между тем, оттепель образцов (если замороженные), вихрь, и спина их в течение 4 мин при 2000 х г, 4 кв. C.
    3. Когда готовы, выключите блок питания, и тщательно промыть каждый колодец с 1x TBE с помощью шприца.
    4. Используйте гель-загрузки советы для загрузки образцов на гель.
    5. Запуск геля при постоянном 20-30 мА около 2 ч или до нижнего красителя (ксилен цианол FF) достигает нижней части геля.
  6. Снимите гель, поместите его на кусок абсорбциентной бумаги и заверните полиэтиленовой пленкой.
  7. Вывешивать радиомаркированный гель на фосфорэкран.
  8. Сканирование фосфорного экрана с помощью фосфораигаисера и анализ изображения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Цифры 2 и 3 показывают репрезентативные реакции результатов, используемые для генерации комплексов искусственного удлинения, содержащих транскрипты различной длины путем расширения или Pol II из различных источников. На рисунке 4 показано, как эти удлинение комплексы могут быть использованы для проверки котранскрипционного CTD фосфорилирования-зависимой РНК укупорки.

Рисунок 2А представляет собой диаграмму молекул ДНК и РНК в комплексах искусственного удлинения. На рисунке 2B показаны транскрипты разной длины, генерируемые в реакциях, выполненных точно так же, как описано в Протоколе 1, в котором стартовые комплексы искусственной удлинения были подготовлены с использованием синтетического олиго РНК 20 nt (темно-синий цвет на рисунке 2A ; РНК-20мер, таблица 1). Так как мы знаем начальную длину РНК и последовательность шаблонов ДНК, мы можем определить подмножество нуклеотидов– АТФ, CTP, GTP или UTP – необходимо пройти Пол II до определенного положения вдоль шаблона. Количество вновь синтезированных нуклеотидов добавляется к стартовому размеру олигонуклеотида РНК для определения конечной ожидаемой длины (размер олиго RN A и количество нуклеотидов). В присутствии АТФ и UTP, Пол II может добавить 3 nt к 20 NT РНК олиго для создания удлинение комплексов, содержащих 23mer РНК. Если один смаёт неинкорпорированные ATP и UTP, а затем добавляет ATP и CTP, 20 nt олиго продлевается на 2 nt, чтобы сделать 25mer, и если один затем снова смает неинкорпорированных нуклеотидов и добавляет АТФ и GTP, стенограмма расширяется дополнительно 4 nt, чтобы сделать 29mer. Sinsin ce вновь созданные транскрипты соответствуют ожидаемому размеру РНК, и так как почти все радиомаркированные 23mers могут быть количественно преследовали в более длинные продукты, известно, что с помощью этого метода (i) олиго RNA правильно расположен на выходе Pol II канал во время сборки и (ii) радиомаркированные РНК связаны с активными комплексами удлинения Пол II.

На рисунке 2C показана вариация протокола, в которой стартовые комплексы удлинения были подготовлены с использованием того же шаблона ДНК и нешаблонных олиго и олиго RNA (RNA-29mer, Таблица 1), который содержит дополнительные 9 нуклеотидов в его 5'-конец, но в противном случае идентичны по последовательности 20 NT РНК олиго. Поскольку длина стартовой РНК в данном случае составляет 29 nt, удлинение комплексов, содержащих 32mer, 34mer и 38mer транскрипты могут быть созданы с помощью тех же Пол II шагов ходьбы, описанных выше.

В зависимости от объема анализа, этот метод обеспечивает гибкость в источнике Pol II. На рисунке 3 мы сравниваем реакции с использованием Pol II из разных источников. В реакциях, показанных в первых 4 полосах, комплексы искусственного удлинения были собраны с эндогенными, диким типом Pol II очищенным от любой печени крысиной или расщепления дрожжей и ходил, как описано выше, чтобы генерировать 23mers или 25mers. Крысы и расщепления дрожжей Pol IIs, используемых в этих реакциях были очищены почти до однородности с помощью нескольких хроматографических шагов.

Метод также может быть использован для создания комплексов искусственного удлинения, содержащих дикий тип или мутант Pol II, подготовленный с помощью простого, одношагового метода очистки. Последние две полосы в рисунке показывают анализы, выполненные с использованием мутантной формы человеческого Pol II, которая не имеет CTD в его подразделении Rpb1, которое не требуется для каталитического действия Pol II, но помогает пара транскрипции РНК укупорки. CTD-менее Pol II, используемых в этих анализов был очищен анти-FLAG иммуноочистки от человеческой клеточной линии, выражающей EPItope FLAG помечены версия Rpb1. Важно отметить, что концентрация активного Пол II будет варьироваться от подготовки к подготовке. Таким образом, важно для выполнения первоначальных экспериментов, в которых количество Pol II, используемого в реакциях, изменяется для определения количества, необходимого для получения желаемой активности.

На рисунке 4 показан репрезентативный пример ассея, сравнивая укупорки радиомаркированных транскриптов, связанных с комплексами искусственного удлинения, содержащими Pol II, с фосфорилированным или нефосфорилированным CTD. Для этих анализов были подготовлены удлинение комплексов, содержащих 23 нуклеотидных транскрипта с 5'-трифосфатным концом, как описано в протоколе 2.

Инкубация удлиненных комплексов с укупорки фермента приводит к смещению подвижности около 1 nt, что указывает на добавление 5' крышка14,15. Для количественной оценки реакции укупорки, один определяет укупорки эффективности, выраженные в процентах РНК, которая ограничена. Эффективность capping — это отношение ограниченной РНК к общей РНК, разделенное на максимально достижимое укупорки. В наших анализах мы находим максимально достижимое укупорки олигоrn RNA полученных от коммерческих источников составляет 85%, вероятно, из-за неполного трифосфорилирования синтетической РНК.

В реакциях, показанных в первых 3 полосах, удлинение комплексы были инкубированы с общим транскрипционным фактором TFIIH и кофактором АТФ для фосфорилата Pol II CTD до укупорки. В этих реакциях, вблизи максимальной укупорки наблюдалось 1 мин после добавления 5 нг укупорки фермента. Когда анализы проводились с использованием удлиненных комплексов, которые не инкубируются с TFIIH и, следовательно, содержат нефосфорилированный Пол II, потребовалось почти в 10 раз больше укупорки фермента для наблюдения аналогичных уровней укупорки. На последних двух полосах рисунка 4 показаны продукты реакций, при которых удлинение комплексов инкубировалось с ферментом или без укупорки, в присутствии TFIIH. Важно отметить, что TFIIH-зависимость котранскрипционных комплексов искусственного удлинения, продемонстрированную на этой цифре, очень похожа на ту, что наблюдается в удлинении комплексов, которые инициировали транскрипцию у промотории в более сложных ферментных системах 5.

Figure 1
Рисунок 1: Сборка комплексов искусственного удлинения. (A) РНК олиго (темно-синий) 20 nt запечатан на нить шаблона ДНК (зеленый) через дополнительную последовательность 9 nt. (B) РНК полимераза II (Pol II) смешивается с annealed ДНК: РНК гибрид для размещения РНК 3'конец на пол II каталитического сайта. (C) Моляр избыток 3' биотинилатированных не-шаблонная нить ДНК олиго (светло-голубой) добавляется в реакционную смесь, чтобы приложить и дальнейшей стабилизации удлинения комплекса. (D) Иммобилизованные удлиненные комплексы промывают, чтобы удалить излишки олигои и инкубируются соответствующими комбинациями нуклеотидов, чтобы позволить Pol II расширить олиго РНК до нужной длины. Недавно синтезированная часть РНК показана желтым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Пол II ходьба с использованием олигос РНК разной длины. (A) Диаграмма искусственных удлинений комплексов, показывающих нуклеотиды добавил во время прогулок. Нешаблонная нить и шаблон НАЯДна показаны в светло-голубом и зеленом цветах соответственно. 20 nt РНК олиго показано в темно-синий. Также показаны нуклеотиды, добавленные во время последовательных прогулок для генерации 23mer РНК (оранжевый), 25mer РНК (коричневый), и 29mer РНК (магента). (B) Отрицание геля электрофорез с указанием РНК определенной длины, полученных после ходьбы Пол II с помощью 20 NT РНК грунтовки, как описано в Протоколе 1. Нуклеотиды, добавленные во время каждого последовательного шага ходьбы протокола, являются цветовым оранжевым (23mer), коричневым (25mer) и пурпурным (29mer).  (C) Пол II ходьба, начиная с 29 NT РНК грунтовки, но в противном случае точно так же, как показано в B. (B и C) показать части того же геля, но были разделены для иллюстрации целей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Стенограммы, синтезированные комплексами искусственного удлинения, содержащими дикий тип или мутант Пол II. Искусственные удлиненные комплексы были собраны с использованием 20 NT РНК грунтовки и высоко очищенных эндогенных Pol II из крысиной печени или расщепления дрожжей или FLAG иммуноочищенных Пол II не хватает Rpb1 из клеток HeLa (F:Rpb1-ЗКТД). РНК в каждом комплексе была дополнительно расширена до 23 nt или 25 nt. Подробнее смотрите текст. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Фосфорилирование-зависимая активация котранскрипционной РНК-укупорки. Искусственные удлиненные комплексы, содержащие крысиную печень Pol II и радиомаркированную РНК 23mer были инкубированы с АТФ и общий коэффициент транскрипции TFIIH или буфер в течение 10 мин для фосфорилата Pol II CTD. После мытья, удлиненные комплексы были инкубированы с 5 нг, 15 нг, или 45 нг млекопитающих укупорки фермента в течение 1, 2 или 4 мин. Закрытые и uncapped 23mers были решены в денатургиционный гель (сверху, первые 12 полос) и % ограничен РНК была количественнои и построен (внизу). Эта часть фигуры была первоначально опубликована в ref 5, которая была опубликована в виде статьи открытого доступа под лицензией CC-BY. Последние две полосы движения, которые приходят из отдельного эксперимента, иллюстрируют продукты реакций, в которых удлинение комплексы были инкубированы с или без укупорки фермента, в присутствии TFIIH. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Последовательности Комментарии
РНК-20мер АКУКУЧУГУГУГУГУАУА 5' Модификация трифосфата; PAGE и RP-HPLC очищены
РНК-29мер АКУАУГТАКАКУПУГУГУГУГУГУГУГУА 5' Модификация трифосфата; PAGE и RP-HPLC очищены
Шаблон Strand ДНК CTACGGTTAAGCTCACGGTACTTCTGAA
TTAAGCATCATGG		 Двойной PAGE и HPLC очищены
Нешаблон Ная Прэнд ДНК ATCAGAAATGTACCGTGAGCTTAACCGTAG 5' TEG-биотинилат; HPLC очищено

Таблица 1: ДНК и РНК олигонуклеотиды

Окончательная концентрация Объем
Tris HCl рН 7,5 12 мМ
50 мМ MgCl2 5 мМ 1 зл
300 мМ KCl 50 мМ 1,67 л л.
10 мкм Шаблон Strand ДНК олиго в 100 мм Tris-HCl рН 7,5 1 км 1 зл
10 мкм РНК олиго
в 10 мм Tris-HCl рН 7,5		 2 мкм 2 л
Воды 4.33 л л.
10 зл
«Все решения Tris-HCl получены из решений для олиго ДНК и РНК

Таблица 2: Коктейль для аннулирования ДНК и олигос РНК

Буфер Пол II Окончательная концентрация Объем/реакция
Воды 4,52 л л.
50 мМ MgCl2 4,67 мМ 1,40 л л.
250 мМ Трис HCl, рН 7.5 23 мМ 1,40 л л.
300 мМ KCl 27 мМ 1,33 л л.
50% Глицерол 3% 0,9 л л.
20 мг/мл BSA 0,5 мг/мл 0,38 л л.
100 мМ DTT 0,5 мм 0,08 л л.
10% PVA 2% 3 зл
13 зл
Прямо перед использованием буфера добавить:
Аннзатная нить шаблона ДНК: РНК (из таблицы 1) 1 зл
РНК Полимераза II 1 зл
Концентрация KCl в смеси составляет 50 мм, при этом дополнительный KCl исходит от Pol II
Концентрации «Окончательный MgCl2» и Tris HCl составляют 5 мМ и 25 мМ соответственно,
Дополнительные MgCl2 и Tris HCl происходят из аннулированной ДНК: РНК-продукт.

Таблица 3: Пол II смесь

Нешаблонный буфер ДНК Окончательная концентрация Объем/реакция
Воды 4.48 л л.
300 мМ KCl 43,33 мМ 2.17 Лл
50 мМ MgCl2 5 мМ 1,50 л л.
250 мМ Трис HCl, рН 7.5 25 мМ 1,50 л л.
50% Глицерол 3% 0,9 л л.
20 мг/мл BSA 0,5 мг/мл 0,38 л л.
100 мМ DTT 0,5 мм 0,08 л л.
10% PVA 2% 3 зл
14 зл.
Прямо перед использованием буфера добавить:
5 м.М. Биотинилатированный нешаблон ДНК олиго 1 зл
Концентрация KCl в смеси составляет 50 мМ, при этом дополнительный KCl исходит от нешаблонного буфера олиго ДНК.

Таблица 4: Нешаблонная днк-смесь

Буфер маркировки импульсов Окончательная концентрация Объем/реакция
Воды 9.98 Лл
300 мМ KCl 60 мМ 5 зл
50% Глицерол 3% 1,5 л
20 мг/мл BSA 0,5 мг/мл 0,63 л л.
500 мМ MgCl2 8 мМ 0,4 л
1 M Tris HCl, рН 7.9 12 мМ 0,3 л л
100 мМ DTT 0,5 мм 0,13 л л.
1 M HEPES-NaOH, рН 7.9 3 мМ 0,08 л л.
10% PVA 2% 5 зл
23 Зл
Прямо перед использованием буфера добавить:
15 ММ АТП 0,6 мкм 1 зл
3,3 мкм З--32ПЗУТП 0,13 мкм 1 зл
Концентрация Final Tris HCl составляет 20 мМ, при этом дополнительный Tris HCl исходит от нуклеотидного буфера.

Таблица 5: Импульсная маркировка NTP-микс

Буфер погони Окончательная концентрация Объем/реакция
Tris HCl, рН 7.5 30 мМ
300 мМ KCl 60 мМ 1 зл
Воды 0,6 л л
50% Глицерол 3% 0,3 л л
10 мМ DTT 0,5 мм 0,25 л л.
100 мМ HEPES-NaOH, рН 7.9 3 мМ 0,15 л л.
20 мг/мл BSA 0,5 мг/мл 0,13 л л.
500 мМ MgCl2 8 мМ 0,08 л л.
10% PVA 2% 1 зл
3,5 л л
Прямо перед использованием буфера добавить:
100 мкм UTP, 100 ММ АТФ разбавленный в 100 мм Tris-HCl, рН 7.5 5 км 1,5 л
«Все Tris HCl происходит из нуклеотидного буфера

Таблица 6: Чейз NTP смесь

Окончательная концентрация Объем/реакция
Воды 24.21 л л.
1 M KCl 60 мМ 1,8 л
50% Глицерол 3% 1,8 л
20 мг/мл BSA 0,5 мг/мл 0,75 л л.
1 M Tris HCl, рН 7.9 20 мМ 0,6 л л
10% PVA 0,2% 0,6 л л
100 мМ DTT 0,5 мм 0,15 л л.
1 M HEPES-NaOH, рН 7.9 3 мМ 0,09 л л.
30 зл

Таблица 7: Буфер для мытья

Окончательная концентрация Объем/реакция
Воды 14.13 Лл
300 мМ KCl 60 мМ 6 зл
50% Глицерол 3% 1,8 л
20 мг/мл BSA 0,5 мг/мл 0,75 л л.
1 M Tris HCl, рН 7.9 20 мМ 0,6 л л
500 мМ MgCl2 8 мМ 0,48 л л.
100 мМ DTT 0,5 мм 0,15 л л.
1 M HEPES-NaOH, рН 7.9 3 мМ 0,09 л л.
10% PVA 2% 6 зл
30 зл

Таблица 8: Базовый буфер транскрипции (BTB)

Остановить буфер Окончательная концентрация Объем/реакция
Воды 55,74 л л
1 M Tris HCl, рН 7.5 10 мМ 0,6 л л
5 M NaCl 300 мМ NaCl 3,6 л л.
500 мм EDTA 0,5 мм EDTA 0,06 л л.
10% SDS 0,2% SDS 1,2 л
60 зл
Прямо перед использованием буфера добавить:
15 мг/мл гликоген 2 л
20 мг/мл Протеиназа K 2 л
Воды 30 зл

Таблица 9: Остановить микс

Окончательная концентрация Объем/реакция
Воды 11,9 л л
300 мМ KCl 53,33 мМ 5,33 л л
50% Глицерол 3% 1,8 л
1,5 мкм GTP разбавленный в 100 мм Tris HCl, рН 7,5 50 км 1 зл
100 единиц/мл неорганические пирофосфатаза, дрожжи 0,1 единицы/реакция 1 зл
20 мг/мл BSA 0,5 мг/мл 0,75 л л.
1 M Tris HCl, рН 7.9 16,67 мм 0,5 л л
500 мМ MgCl2 8 мМ 0,48 л л.
100 мМ DTT 0,5 мм 0,15 л л.
1 M HEPES-NaOH, рН 7.9 3 мМ 0,09 л л.
10% PVA 2% 6 зл
29 зл.
Прямо перед использованием буфера добавить:
Удпинг фермента 1 зл
Концентрация ККЛ в смеси составляет 60 мМ, при этом дополнительный KCl исходит от фермента укупорки и пирофосфазаза
Концентрация Final Tris HCl составляет 20 мМ, при этом дополнительный Tris HCl исходит от нуклеотидного буфера

Таблица 10: Уппинг микс

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Исследования, которые стремятся вскрыть события в сочетании с комплексом удлинения Pol II, таким как обработка РНК и регулирование самой удлинения стенограммы, могут быть значительно облегчены с помощью высокоочищенной ферментной системы. Настройка таких ферментных систем может быть сложной задачей. Промоутер-зависимая транскрипция Пол II требует по крайней мере пяти общих факторов транскрипции. Подготовка и накопление этих факторов может занять месяцы; следовательно, меромером в этом процессе часто является просто подготовка кадров транскрипционных факторов, необходимых для воссоздания базальной транскрипции в пробирке.

В этой статье мы описываем адаптацию ранее разработанных методов генерациикомплексов искусственного транскрипции удлинения 2,3 с использованием только очищенной Пол II и синтетической ДНК и РНК олигонуклеотидов. Полученные удлиненные комплексы транскрипционно активны и пригодны для исследования соединения транскрипции Pol II и РНК укупорки5. Важно отметить, что транскрипция и РНК укупорки происходят in vivo в контексте хроматина и многих других белков, не присутствующих в этой определенной ферментной системе; следовательно, эта система, как ожидается, резюмировать многие, но не все, особенности реакций, которые происходят in vivo. Протокол, который мы описываем, основывается на предыдущих методах путем иммобилизации комплексов искусственного удлинения через биотинилатированную ДНК, связанную с магнитными бусинами, что позволяет исследователю легко изменять условия реакции и/или удалять неинкорпорированные нуклеотиды на разных стадиях анализов. Важно отметить, что, поскольку тег, используемый для обездвиживания удлиненных комплексов, находится на одном конце нешаблонной нити ДНК, а не на самом Поле II или на ниче шаблона, только те Pol IIs, связанные с комплексами полного удлинения, будут сохранены на бисерах.

Поскольку зарождающиеся транскрипты должны иметь 5'-трифосфатный конец для того, чтобы быть изменены путем укупорки фермента, синтетические олигонуклеотиды РНК, используемые для укупорки экспериментов приобретаются с 5'-трифосфат терминини. Тем не менее, неизмененные олиго вылза РНК могут быть использованы для других применений, включая исследования других событий совместной транскрипционной обработки РНК или деятельности транскрипционных факторов, которые регулируют удлинение Пол II. Независимо от применения вниз по течению, мы рекомендуем собирать удлиненные комплексы с высокоочищенной ДНК и олиготами РНК. В частности, биотинилаповые олиго днк должны быть очищены HPLC, а другие ДНК и РНК олиго должны быть очищены электрофорексисом полиакриламидного геля и/или HPLC. Однако чистота ферментативной деятельности должна определяться на индивидуальной основе и будет зависеть от масштабов каждого эксперимента.

Добавление нешаблонного биотинилатецивого олиго ДНК на последнем этапе сборки должно быть, в принципе, достаточным для получения тернарийского комплекса. Тем не менее, мы всегда включаем по крайней мере один "ходячий" шаг, чтобы подтвердить Пол II включает в себя правильное количество нуклеотидов: Если цель эксперимента состоит в том, чтобы генерировать субстраты для проверки совместного транскрипционного укупорки или других шагов обработки РНК или следовать Пол II удлинение, мы всегда включаем 32P-помечены рибонуклеотида в начальной "ходить", так что стенограмма может быть визуализирована и использовать немаркированные "холодные" нуклеотиды для последующих шагов ходьбы, так что специфическая активность стенограммы различной длины остается постоянным. Хотя метод, описанный в этом протоколе, использует 32p-маркированных нуклеотидов для визуализации зарождающихся стенограмм, анализы на основе флуоресценции могут быть использованы для измерения маркировки РНК, когда невозможно работать с радиоактивными материалами. Тем не менее, важно отметить, что чувствительность таких assays, как правило, гораздо меньше, чем те, которые используют радиоактивные этикетки, и они обычно требуют большего количества ферментов.

Ключевым шагом для воспроизводимых экспериментов является хорошее восстановление РНК во время фенола: хлороформ: изоамил добычи и осадок этанола. Мы обнаружили, что использование микроцентрифуговых труб, содержащих гели высокой плотности (см. Таблица Материалов) для фенола: хлороформ: изоамил экстракция увеличивает воспроизводимость и выход нуклеиновой кислоты от этого шага. Кроме того, использование цветного гликогена (см. Таблицаматериалов) в качестве носителя во время осадки этанола облегчает возможность увидеть небольшие гранулы нуклеиновой кислоты, что делает менее вероятным, что человек непреднамеренно потеряет гранулы, успокоив его во время удаления этанол супернатант.

Искусственные удлиненные комплексы, генерируемые с помощью протоколов, подобных тем, которые мы описываем, также должны быть полезны для измерения белково-белковых или белково-нуклеиновых кислотных взаимодействий между комплексом удлинения Pol II и факторами, регулирующие транскрипт времяунтации или обработки РНК, связанных с удлинением. В этом случае белки, которые остаются привязанными к комплексам искусственного удлинения после мытья, обнаруживаются западным и масс-спектрометрией; радиомаркировка РНК не является необходимым, и мы делаем все этапы транскрипции только с "холодными" нуклеотидами.

Наконец, этот метод может быть подобен для структурного анализа транскрипционных комплексов. Действительно, соответствующие методы были использованы в крио-EM исследований с дрожжами и млекопитающих ферментов для восстановления укупорки фермента-Pol II взаимодействий13, и взаимодействия Pol II с другими белками или белковых комплексов во время удлинения12, паузы16,17, и совсем недавно, связанные с нуклеосоом18. Возможным осложнением для структурного анализа транскрипционных комплексов, генерируемых с помощью этого метода, является необходимость удаления из комплекса биотина/магнитных бусин; однако, это может быть решена путем включения в ДНК олигос конкретных сайтов, признанных ограничения ферментов или с помощью биотина связующих, которые расщепляются после УФ-лучей лечения19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим С. Шумана за предоставление фермента укупорки млекопитающих кДНК. Эта работа была частично поддержана грантом Института медицинских исследований Stowers от Фонда медицинских исследований Хелен Нельсон в Большом Канзас-Сити.  Исходные данные, лежащие в основе этой рукописи, можно получить из хранилища исходных данных Stowers в http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi Perkin Elmer NEG007H001MC For radiolabeling RNA
2x RNA loading dye New England Biolabs B0363S Highly recommended. For preparing RNA during gel loading
40% Bis:Acrylamide solution Biorad 1610144
Bovine Serum Albumin (20 mg/mL) New England Biolabs B9000S
Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg Millipore Sigma 14-476 Used to phosphorylate Pol II CTD
DNA oligonucleotides IDT See Table 8 for purity specifications
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies Invitrogen 65001 We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) Life Technologies Invitrogen AM9516 Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle
Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb Hoefer SE600-15-1.5
MaXtract high density tubes (1.5 mL) Qiagen 129046 Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions
Proteinase K solution (20 mg/mL) Life Technologies Invitrogen 25530049
RNA oligonucleotides Trilink See Table 8 for more details
Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/mL) New England Biolabs NEBM2403S Required only during capping reactions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
  2. Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
  3. Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
  4. Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
  5. Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
  6. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
  7. Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
  8. Ghosh, A., Lima, C. D. Enzymology of RNA cap synthesis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).
  9. Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
  10. Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
  11. Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
  12. Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
  13. Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
  14. Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
  15. Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
  16. Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
  17. Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
  18. Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
  19. Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).

Tags

Генетика Выпуск 147 синтез мРНК РНК-полимераза II удлинение транскрипции фермент CTD киназа синтетические транскрипционные пузыри комплексы искусственной удлинения TFIIH сотранскрипционная обработка РНК
Искусственные РНК-полимераза II Удлинение Комплексы для вскрытия co-транскрипционной РНК обработки событий
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Noe Gonzalez, M., Conaway, J. W.,… More

Noe Gonzalez, M., Conaway, J. W., Conaway, R. C. Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events. J. Vis. Exp. (147), e59497, doi:10.3791/59497 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter