En melanom pasient-avledet Xenograft modell
Summary
Pasient-avledet xenograft (PDX) modeller mer robust recapitulate melanom molekylær og biologiske egenskaper og er mer prediktiv behandling respons i forhold til tradisjonelle plast vev kultur-baserte analyser. Her beskriver vi vår standard drifts protokoll for etablering av nye PDX-modeller og karakterisering/eksperimentering av eksisterende PDX-modeller.
Abstract
Akkumulere bevis tyder på at molekylære og biologiske egenskaper varierer i melanom celler dyrket i tradisjonelle to-dimensjonale vev kultur fartøy versus in vivo i menneskelige pasienter. Dette er på grunn av flaskehalsen utvalg av klonal bestander av melanom celler som kan robust vokse in vitro i fravær av fysiologiske forhold. Videre svar på behandling i todimensjonale vev kulturer generelt ikke reflekterer trofast svar på behandling hos melanom pasienter, med de fleste kliniske studier unnlater å vise effekten av terapeutiske kombinasjoner vist å være effektive i Vitro. Selv om xenografting av melanom celler til mus gir den fysiologiske in vivo kontekst fraværende fra to-dimensjonale vev kultur analyser, melanom cellene som brukes for engraftment har allerede gjennomgått flaskehals utvalg for celler som kan vokse under todimensjonale tilstander når cellelinjen ble opprettet. Den irreversible forandringer som oppstår som en konsekvens av flaskehalsen inkluderer endringer i vekst og invasjon egenskaper, samt tap av spesifikke subpopulasjoner. Derfor, modeller som bedre recapitulate den menneskelige tilstand in vivo kan bedre forutsi terapeutiske strategier som effektivt øker den generelle overlevelse av pasienter med metastatisk melanom. Den pasient-avledet xenograft (PDX) teknikken innebærer direkte implantation av tumorceller fra den menneskelige pasienten til en mus mottaker. På denne måten tumorceller er konsekvent dyrket under fysiologiske påkjenninger i vivo og aldri gjennomgår to-dimensjonal flaskehals, som bevarer den molekylære og biologiske egenskaper til stede når svulsten var i den menneskelige pasient. Kjente, PDX modeller avledet fra organ nettsteder av metastaser (dvs. hjernen) vise lignende metastatisk kapasitet, mens PDX modeller avledet fra terapi naive pasienter og pasienter med ervervet resistens mot terapi (dvs. BRAF/MEK inhibitor terapi) display lignende følsomhet for terapi.
Introduction
Prekliniske modeller er avgjørende for alle aspekter av translational kreftforskning, inkludert sykdoms karakterisering, oppdagelse av nyttige sårbarheter unik for kreft versus normale celler, og utvikling av effektiv terapier som utnytter disse sikkerhetsproblemene for å øke den generelle overlevelsen av pasientene. I melanom feltet, titusenvis av cellelinje modeller har blitt sterkt benyttet for narkotika screening, med > 4000 bidratt av vår gruppe alene (WMXXX-serien). Disse cellelinje modeller ble avledet fra melanom pasienter med ulike former for hud melanom (dvs. acral, uveal, og overfladisk spredning) og diverse genotyper (dvs. BRAFV600-mutant og neuroblastom RAS viral diagnostisk homologe [ NRAS Q61R-mutant]), som spenner over spekteret av sykdom som finnes i klinikken1,2.
Utvetydig, den mest vellykkede, målrettede terapi strategi i melanom feltet har dukket opp fra 1) den genomisk karakterisering av pasientens svulster identifisere BRAF mutasjoner i ~ 50% av melanomer3 og fra 2) prekliniske etterforskning utnytte melanom cellelinje modeller4. Den BRAF/MEK inhibitor kombinasjon var Food and Drug Administration (FDA)-godkjent i 2014 for behandling av pasienter som melanomer havnen aktivere BRAFV600E/K mutasjoner og har en > 75% responsrate5. Til tross for denne innledende effekten, oppstår motstanden raskt i nesten alle tilfeller på grunn av mangfoldige indre og ervervet motstands mekanismer og intratumoral heterogenitet. Dessverre, cellelinje modeller ikke recapitulate representative biologiske heterogenitet når vokst i to-dimensjonal kultur i plast fartøy, som masker deres klinisk prediktiv potensial når etterforskere forsøker å eksperimentelt bestemme behandling som kan være effektive hos pasienter med en bestemt form eller genotype av melanom6. Forstå hvordan du best modell pasienten intratumoral heterogenitet vil tillate etterforskerne å bedre utvikle terapeutiske modaliteter som kan drepe terapi-resistente subpopulasjoner at stasjonen svikt til dagens standard-of-Care terapier.
Paramount til begrenset prediktiv verdi av cellelinje modeller er hvordan de er i utgangspunktet etablert. Irreversible forandringer oppstår i tumor klonal landskapet når en enkelt celle suspensjon av en pasientenes svulst er dyrket på todimensjonale, plast vev kultur fartøy, inkludert endringer i proliferativ og invasiv potensial, eliminering av spesifikke subpopulasjoner, og endring av genetisk informasjon7. Xenotransplantater inn mus av disse melanom cellelinje modeller representerer den mest brukte in vivo plattform for prekliniske studier; imidlertid lider denne strategien også fra de fattige recapitulation av komplekse tumor heterogenitet observert klinisk. For å overvinne denne brist, har det vært en økende interesse i å innlemme mer sofistikerte prekliniske modeller av melanom, inkludert PDX modell. PDX-modellene har blitt benyttet i > 30 år, med banebrytende studier hos pasienter med lungekreft som viser samsvar mellom pasientens respons på cytotoksisk midler og responsen til PDX-modellen som stammer fra samme pasient8. Nylig har det vært en stasjon for å utnytte PDX modeller som verktøyet for valg for prekliniske undersøkelser både i bransjen og i akademiske sentre. PDX-modeller, på grunn av sin overlegne recapitulation av tumor heterogenitet hos mennesker, er mer klinisk relevante å bruke i behandlings optimalisering innsats enn cellelinje xenotransplantater9. I melanom, det er enorme hekk som sløv den terapeutiske forvaltningen av avansert sykdom10. Klinisk relevante PDX modeller har blitt brukt til å modellere klinisk motstand og identifisere terapeutiske strategier med klinisk tilgjengelige agenter for å behandle terapi-resistente svulster11,12. Kort sagt, protokollen som presenteres her for å generere PDX modeller krever subkutan implantation av ferskt vev fra primær eller metastatisk melanomer (samlet inn av biopsi eller kirurgi) til NOD/scid/IL2-reseptor null (NSG) mus. Ulike variasjoner i metodisk tilnærming brukes av ulike grupper; Imidlertid finnes en fundamental kjerne13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har her beskrevet generere PDX modeller av melanom med pasient vev avledet fra primær og metastatisk svulster, kjerne biopsier, og FNAs. Når direkte engrafted til NSG-mus, svulster presentere lignende morfologiske, genomisk, og biologiske egenskaper til de observert i pasienten. I tilfelle når bare en liten mengde vev er tilgjengelig for etterforskere, som ofte skjer med FNAs, gjør PDX teknikken for utvidelse av tumor vev for DNA, RNA, og protein karakterisering, samt for terapi forsøk for å tillate prekliniske …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Wistar Institute Animal Facility, mikroskopi anlegg, histologi Facility, og Research Supply Center. Denne studien ble finansiert delvis av tilskudd fra U54 (CA224070-01), SPORE (CA174523), p01 (CA114046-07), Dr. Miriam og Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, og melanom Research Foundation.
Materials
| 1 M Hepes | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # H0887-100ML | |
| 100x PenStrep | Invitrogen | Cat # 15140163 | |
| 1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) | MED | Cat # MT21-023-CV | |
| 2.5% Trypsin | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # T4549-100ML | 10 mL aliquots stored at –20oC |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # A9418-500G | |
| Chlorhexidine | Fisher Scientific | Cat# 50-118-0313 | |
| Collagenase IV (2,000 u/mL) | Worthington | Cat #4189 | make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1 |
| DMSO | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # C6295-50ML | |
| DNase | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # D4527 | |
| EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) | Merck | Cat # 324626.25 | |
| FBS | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 16000-044 | |
| Fungizone | INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES | Cat # 15290-018 | |
| Gentamicin | FISHER SCIENTIFIC | Cat # BW17518Z | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | Cat # 050031 | |
| Leibovitz's L15 media | Invitrogen | Cat # 21083027 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354230 | Artificial extracellular matrix |
| Meloxicam | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein | Cat # 025115 | 1-5mg/kg, as painkiller |
| NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice | The Wistar Institute, animal facility | breeding | |
| PVA (polyvinyl alcohol) | SIGMA-ALDRICH CORPORATION | Cat # P8136-250G | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Fisher Scientific | Cat# MT10041CM | |
| Scalpel | Feather | Cat # 2976-22 | |
| Virkon | GALLARD-SCHLESINGER IND | Cat # 222-01-06 | |
| Wound clips | MikRon | Cat #427631 |
References
- Garman, B., et al. Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
- Paraiso, K. H., et al. Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy. British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).
- Long, G. V., et al. Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib. Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).
- Shi, H., et al. Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy. Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).
- Monsma, D. J., et al. Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms. American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- De La Rochere, P., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).
