Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

מלנומה מטופלת-נגזר מודל Xenograft

doi: 10.3791/59508 Published: May 20, 2019

Summary

המטופל נגזר מבע (pdx) דגמים נוספים ביותר בסדר מלנומה מולקולרית תכונות ביולוגיות, הם ניבוי יותר של תגובת הטיפול לעומת רקמה פלסטית מסורתית התרבות מבוסס assays. כאן אנו מתארים את פרוטוקול ההפעלה הסטנדרטית שלנו להקמת דגמי PDX חדשים ואפיון/ניסויים של דגמי PDX קיימים.

Abstract

צבירת ראיות עולה כי תכונות מולקולריות וביולוגיות שונות בתאי מלנומה גדל בתוך כלי התרבות המסורתית דו מימדי רקמות לעומת בvivo בחולים אנושיים. זה בשל בחירת צוואר הבקבוק של אוכלוסיות שבטים של תאים מלנומה שיכול לצמוח ברוטי בחוץ בהעדר מצבים פיזיולוגיים. עוד, התגובות טיפול בתרבויות דו מימדי רקמות הכולל לא בנאמנות לשקף התגובות טיפול בחולי מלנומה, עם רוב הניסויים הקליניים נכשל להראות את היעילות של שילובים טיפוליים המוצג להיות יעיל ב מבחנה. למרות שתלה שתלה של תאים מלנומה לתוך עכברים מספק את הפיסיולוגיים בהקשר vivo נעדר משני מימדי התרבות רקמה, התאים מלנומה המשמשים לחרט כבר עברו בחירת צוואר בקבוק עבור תאים שיכולים לצמוח תחת תנאים דו-ממדיים כאשר קו התא הוקם. השינויים הבלתי הפיכה המתרחשים כתוצאה של צוואר הבקבוק כוללים שינויים במאפייני הצמיחה והפלישה, כמו גם הפסד של אוכלוסיות משנה ספציפיות. לכן, מודלים כי טוב יותר ללכוד את המצב האנושי vivo אולי טוב יותר לנבא אסטרטגיות טיפוליות המגבירים ביעילות את ההישרדות הכוללת של חולים עם מלנומה גרורתית. המטופל נגזר מבע (pdx) טכניקה כרוכה השרשה ישירה של תאים סרטניים מהמטופל האנושי לנמען העכבר. באופן זה, תאים סרטניים גדלים בעקביות תחת מתחים פיזיולוגיים בvivo ולעולם לא לעבור בקבוק דו מימדי, אשר שומר על המאפיינים המולקולריים והביולוגיים נוכח כאשר הגידול היה החולה האנושי. הבולטים, PDX מודלים נגזר מאתרי איברים של גרורות (כלומר, המוח) להציג קיבולת גרורתית דומה, בעוד מודלים PDX נגזר מחולים תמימים תרפיה וחולים עם עמידות לטיפול (כלומר, BRAF/מעכב מעכבי טיפול) להציג רגישות דומה לטיפול.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מודלים preclinical הם קריטיים עבור כל ההיבטים של מחקר הסרטן translational, כולל אפיון המחלה, גילוי של פגיעויות שימושי ייחודי לסרטן לעומת תאים נורמליים, ופיתוח של טיפולים יעיל לנצל פגיעויות אלה כדי להגביר את ההישרדות הכוללת של חולים. בשדה מלנומה, עשרות אלפי דגמים של קו התא כבר מנוצל בכבדות עבור הקרנת סמים, עם > 4000 תרמה על ידי הקבוצה שלנו לבד (סדרת WMXXX). אלה מודלים קו התא נגזר מחולי מלנומה עם צורות שונות של מלנומה עורית (כלומר, acral, uveal, ו התפשטות שטחית) ו גנוסוגים מגוונים (כלומר, BrafV600-מוטציה ו נוירובלסטומה RAS ויראלי אונאוולוג הומולוג [ מיכל הנברס Q61R-מוטציה]), אשר תוחלת את הספקטרום של המחלה הנוכחית בקליניקה1,2.

חד-משמעית, המוצלח ביותר, טיפול ממוקד האסטרטגיה בשדה מלנומה התפתחה מ 1) האפיון גנומית של גידולים של חולים לזיהוי מוטציות Braf ב ~ 50% של מלנומה3 ו מ 2) חקירה פרה-קלינית מינוף קו מלנומה תא מודלים4. שילוב BRAF/מק מעכב היה מזון ותרופות מינהל (FDA)-אושרה ב 2014 לטיפול בחולים אשר הנמל מלנומה הפעלת brafV600E/K מוטציות ומתגאה > 75% תגובה שיעור5. למרות היעילות הראשונית הזאת, ההתנגדות מתעוררת במהירות כמעט בכל מקרה בשל מנגנונים מהותיים ושנרכשו מנגנוני ההתנגדות טרוגניות. למרבה הצער, מודלים של קו התא אינם מטרוגניות ביולוגי נציג מייצג כאשר גדל בתרבות דו-ממדית בכלי פלסטיק, אשר מסכות הפוטנציאל החזוי הקליני שלהם כאשר חוקרים מנסים לקבוע את טיפולים שעשויים להיות יעילים בחולים עם טופס מסוים או גנוטיפ של מלנומה6. הבנת כיצד החולה המודל הטוב ביותר intratumoral טרוגניות יאפשר לחוקרים לפתח בצורה טובה יותר שיטות טיפוליות שיכולות להרוג אוכלוסיות משנה עמידים לטיפול כי כישלון לתקן הנוכחי של טיפול טיפולים.

פרמאונט לערך ניבוי מוגבל של דגמי קו התא הוא כיצד הם הוקמו בתחילה. שינויים בלתי הפיכה להתרחש בנוף שבטיים הגידול כאשר השעיה תא יחיד של הגידול של החולים גדל על דו מימדי, רקמה פלסטית כלי התרבות, כולל שינויים בפוטנציאל מתרבים ופולשני, חיסול של ספציפי אוכלוסיות משנה, ושינוי של מידע גנטי7. Xenografts לתוך עכברים אלה קו מלנומה תא מודלים לייצג את הנפוץ ביותר בפלטפורמת vivo עבור מחקרים קדם קלינית; עם זאת, אסטרטגיה זו גם סובלת לכידה המסכן של גידול מורכב טרוגניות נצפתה קלינית. כדי להתגבר על זה מגיע, יש כבר עניין גדל והולך שילוב מודלים פרה מתוחכמים יותר של מלנומה, כולל מודל pdx. PDX מודלים כבר מנוצל עבור > 30 שנים, עם מחקרים הזרע בחולי סרטן ריאות הפגינו הקונקורדנציה בין התגובה של המטופלים לסוכני ציטוטוקסיים ואת התגובה של מודל PDX נגזר מאותו מטופל8. לאחרונה, יש כבר כונן להשתמש במודלים PDX ככלי הבחירה לחקירות קדם קלינית הן בתעשייה והן במרכזים אקדמיים. PDX מודלים, בגלל לכידה מעולה שלהם של טרוגניות הגידול בחולים אנושיים, הם רלוונטיים יותר קלינית לשימוש במאמצי אופטימיזציה טיפול מאשר קו התאים xenografts תלי9. ב מלנומה, יש מכשולים עצומים כי בוטה הניהול הטיפולית של מחלה מתקדמת10. מודלים קלינית רלוונטיים pdx שימשו למודל עמידות קלינית לזהות אסטרטגיות טיפוליות עם סוכנים זמינים קלינית לטיפול בגידולים עמידים בפני11,12. בקצרה, הפרוטוקול המוצג כאן כדי ליצור מודלים PDX דורש השרטת תת עורית של רקמה טרייה של מלנומה הראשי או גרורתי (שנאסף על ידי ביופסיה או ניתוח) לתוך בנוד/scid/IL2-לקולטן null (NSG) עכברים. וריאציות שונות בגישה מתודולוגי משמשות קבוצות שונות; עם זאת, ליבת יסוד קיימת13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקולי החיות הבאים מתבקשים לבצע את ההנחיות של ועדת האתיקה ההומאנית של מכון וויסטאר והנחיות לטיפול בבעלי חיים.

1. רקמת הגידול מלנומה אוסף

  1. לאסוף רקמת הגידול (כינה מעבר 0) מחולים מלנומה על ידי אחד הניתוחים הבאים או שיטות ביופסיה.
    1. עבור רקמת כריתה כירורגית, לשמור על מינימום של 1 גרם של רקמה (לכרות גרורות ונגעים ראשוניים) באמצעי אחסון התחבורה (RPMI 1640 + 0.1% fungizone + 0.2% gentamicin) ב 4 ° c או על קרח.
    2. עבור רקמת ביופסיה כירורגית, לשמור פחות מ 1 גרם של רקמה (לעתים קרובות אגרוף ביופסיות של תת עורית [ספורטינג ראגה] גרורות הלימפה [in] גרורות) באמצעי אחסון התחבורה ב 4 ° צ' או על קרח.
    3. עבור רקמת ביופסיה ליבה, לשטוף את גליל (ליבה) של רקמות של כ 10 מ"מ x 1 מ"מ (לעתים קרובות, ביופסיות כבד) לתוך שפופרת 15 mL המכילה 5 מ ל של אמצעי אחסון התחבורה ב 4 ° c או על קרח.
    4. עבור המחט העדינה לחות (FNAs) רקמות, לשמור על כמות קטנה מאוד של רקמה (פחות מ 1 מ ' בגודל) נלקח ישירות מהמטופל במחט ומזרק ב 4 ° צ' או על קרח.
  2. להעביר את הרקמה באמצעי אחסון הובלה ב -4 ° צ' או על קרח באותו יום או עם משלוח לילה לאחר כריתה כירורגית או ביופסיה. לעבד את הרקמה בתוך 1-2 h של משלוח.

2. עיבוד רקמת הגידול להשתלת עכבר

  1. כריתה כירורגית או עיבוד רקמה ביופסיה כירורגית
    1. להעביר את הרקמה צלחת פטרי סטרילית ולהפריד את רקמת הגידול מפני רקמות נורמלי מסביב ככל האפשר.
    2. הסרת רקמת נקרוטיק (מזוהה בדרך כלל בצבע חיוור-לבנבן הממוקם במיקום מרכזי בתוך הגידול) מן הגידול הנותר ככל האפשר.
    3. השתמש אזמל כדי לחלק את נתח הגידול הראשוני לתוך חתיכות שוות ערך (~ 3 מ"מ x 3 מ"מ) עבור השתלת עכבר כירורגית (איור 2).
    4. באופן אופציונלי, אם רקמת הגידול מספיק זמין, הצמד להקפיא את הרקמה עבור במורד הזרם (RNA ברצף [RNASeq], רצף exome שלם [ווס], וכו ').
    5. להפוך את הגידול להשתהות על ידי מינילו את רקמת הגידול באמצעות טכניקה להב צלב עם שני להבים אזמל. האוהב את נתחי הגידול דק ככל האפשר כדי ליצור שאיפה, אשר כעת מוכן השתלת העכבר הכירורגית.
    6. לחילופין, אם רקמת הגידול קשה מדי עבור דיסוציאציה מכנית, השתמש בהליך דיסוציאציה של העיכול כדי ליצור ג'ל כמו שומן ו תא בודד השעיית השרשה ו/או הזרקה.
      1. האוהב את גושי הגידול דק ככל האפשר כדי ליצור שאיפה.
      2. שים את המים בשפופרת 50 mL עם תמיסת מלח מאוזנת קר של האנק (HBSS)-/- (ללא Ca+ + ו-Mg+ +); אז, צנטריפוגה ואת הגלולה ב 220 x g עבור 4 דקות ב 4 ° c.
      3. השהה מחדש את העישון ב-10 מ ל של מדיה לתקציר מחומם (200 U/mL מתוצרת הרביעי + 5 מ"מ CaCl2 + 50 U/Ml DNase ב HBSS-/-) עבור 1 גרם של רקמת הגידול.
      4. מניחים את הצינור באמבט מים בגודל 37 ° c במשך 20 דקות ומערבבים במרץ כל 5 דקות עם פיפטה חד פעמי.
      5. רוחצים עם עד 50 mL של HBSS-/-; לאחר מכן, צנטריפוגה ב 220 x g עבור 4 דקות ב 4 ° c.
      6. להוסיף 5 מ ל של prewarmed TEG (0.025% טריפסין + 40 μg/mL אתילן גליקול-bis (β-עמינח אתר)-N, N, N ', N'-טטראצטט חומצה [EGTA] +10 10 μg/mL פוליוויניל אלכוהול [PVA]) עבור 1 g של רקמת הגידול, בעדינות להשהות/לנער, ולמקם את הצינור ב 37 ° c עבור 2 דקות ללא ערבוב.
      7. להוסיף לפחות 1 כמות שווה של מדיה בצביעת קר (1% בסרום שיסמין [BSA] + 10 מ"מ 4-(2-הידרוקסיל) -1-חומצה piperazinefonic [HEPES] + 1x פניצילין-סטרפטומיצין ב L15 media) כדי להרוות את טריפסין ואת צנטריפוגה ב 220 x g עבור 4 דקות ב 4 ° C.
      8. להשעות מחדש את המדגם ב 10 מ ל של הצביעת מדיה לכל 1 g של רקמת הגידול ולסנן אותו באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר כדי לקבל השעיה תא יחיד עבור הזרקת העכבר (איור 2).
      9. שאיפה נותרת על גבי מסננת התא ניתן גם לאסוף עבור השתלת עכבר כירורגי.
  2. ג עפרת ביופסיה רקמת עיבוד
    1. יוצקים את רקמת צילינדר הליבה בצינור התחבורה רקמת לתוך 5 ס מ צלחת פטרי.
    2. להסיר את הנוזל העודף, לגרד את הרקמה לקצה של צלחת פטרי, בעדינות את רקמת הגידול, להוסיף ~ 100 – 150 μL של HBSS-/- על גבי רקמת הגידול, ובמהירות לצייר את hbss/הגידול רקמת הבולם לתוך מזרק 1 mL.
    3. להצמיד 23 גרם מחט ל 1 מזרק mL, להעביר את HBSS/הגידול רקמת הבולם דרך המחט לתוך שפופרת ספין 1.5 mL.
    4. רענון ההשעיה הגידול לתוך המזרק עם המחט עדיין על עד שהוא יכול לעבור בצורה חלקה דרך המחט.
    5. לבסוף למשוך את ההשעיה הגידול בחזרה לתוך המזרק ולנתק את המחט 23 G.
    6. לצרף a 27 המחט G ולצייר נפח שווה (~ 100-150 μL) של מטריצה מלאכותית (ראה טבלת חומרים) לתוך המזרק.
    7. הוסף נפח שווה של מטריצה מלאכותית באיטיות לתוך שפופרת ספין 1.5 mL עם הגידול/HBSS-/- השעיה, בזהירות הימנעות היווצרות של בועות.
    8. לצייר בפעם האחרונה חזרה לתוך המזרק ואת רקמת הסרטן ביופסיה הליבה כעת מוכן הזרקת העכבר.
  3. עיבוד רקמות FNA
    1. מניחים את המזרק המכיל את דגימות FNA (לכוד במחט) על הקרח.
    2. הפרד את המחט (המכילה רקמת FNA) מן המזרק ולהסיר את הבוכנה מן המזרק, להוסיף ~ 150 – 200 μL של HBSS-/- לחלק העליון של המזרק.
    3. הכנס מחדש את הבוכנה לתוך המזרק והמחט (המכילה את רקמת FNA), ודחף את HBSS-/- דרך המחט לתוך שפופרת ספין של 1.5 mL. שלב זה מסיר את הגידול FNA מן המחט.
    4. חזור על שלב 2.3.3 עם hbss-/-/FNA ההשעיה פעמיים באמצעות מזרק אותו כדי למקסם את האחזור של רקמת הגידול מן המחט.
    5. הוספת אמצעי אחסון שווה (~ 100-150 μL) של מטריצה מלאכותית מלאכותי לצינור הספין 1.5 mL המכיל את HBSS/FNA השעיה.
    6. לערבב כראוי על ידי לשרטט לאט את מטריקס מלאכותית/hbss-/-/FNA בחזרה לתוך המחט 23 G וחוזר פעמיים.
    7. לצייר את כל החילוץ מלאכותי מטריקס/hbss-/-/FNA נפח בחזרה לתוך המזרק, להחליף את המחט 23 g עם מחט 27 g, ואת המדגם FNA כעת מוכן הזרקת העכבר.

3. השתלת גידול והזרקה של עכברים

  1. השרשה של כריתה כירורגית או רקמת ביופסיה כירורגית
    הערה: להבטיח את כל המכשירים כירורגי סטרילי על ידי אוטוקלינג או השימוש טרום מעוקר מכשירים חד פעמיים.
    1. לגלח שיער מהגב התחתון של NSG 6-8 שבוע גברים או עכברים נקבה עוזב בקירוב כ 1.5 ס"מ x 3 ס מ שטח ללא שיער. השתמשו בעכברים באמצעות isofלבנה, ומאשרים על ידי סחיטה עדינה של כף הרגל כמבחן של תגובתיות. השתמש משחה וטרינר על עיניהם כדי למנוע יובש.
    2. מניחים עכברים בודדים על משטח החום בחרוט האף של מכונת ההרדמה, לקרצף את האזור מגולח עם כלורקסאידין. לאחר מכן כבו עם 70% אתנול והניחו להתאדות.
    3. הכנת גושים או לחלק שאיפה הגידול בצלחת פטרי לתוך תלי בודדים עבור השרשה כירורגית (כלומר, לתוך שלושה תילים שווים אם להיות מושתל ל 3 עכברים).
    4. באמצעות להב האזמל, לעשות חתך של כ 5 מ"מ אורך במרכז האחורי של העכבר, לקחת זוג אחד של מלקחיים ולהרים את העור בצד של החתך הפוך של המפעיל.
    5. לקחת את המספריים לעומת זאת ולהפריד את העור משכבת השריר על ידי חיתוך בעדינות קרום הפנים עם חתכים מספריים קטנים, ובכך ליצור "כיס" עבור רקמת הגידול.
    6. להרים קטע גידול אחד או תלולית אחת בודדת של רקמת הגידול עם להב האזמל בעדינות למקם את הרקמה לתוך הכיס שנוצר.
    7. ניהול 100 μL של מטריצה מלאכותית על תל רקמת הגידול בכיס.
    8. באמצעות שני זוגות של מלקחיים, למשוך את החתך בשני הקצוות כך את קצות הפצע להתקרב יחד, ולסגור את הפצע על ידי החלת אחד או שני מחסניות הפצע.
    9. תת עורית להזריק 1-5 מ"ג/ק"ג מלוקסיאם כאבים בעכברים לאחר הניתוח.
    10. לקחת את העכבר מתוך חרוט האף ולמקם אותו בחזרה לכלוב המקורי שלו, להתבונן בעכבר תוך כדי התעוררות. אל תחזרו לכלוב עד שהחלמת לחלוטין.
    11. להסיר תפסי פצע לאחר כ 7 ימים. אם ההחלמה אינה מלאה לאחר 7 ימים, השאירו את מחסנית הפצע בעוד יום או יומיים.
      הערה: אם באמצעות השעיית תא בודד מתוך כריתה כירורגית או עיבוד רקמה ביופסיה כירורגית, זה יהיה לערבב עם מטריצה מלאכותית (ב 1:1 יחס) עבור הזרקת עכברים.
  2. הזרקה של FNA או רקמת ביופסיה ליבה
    1. המקום עכבר NSG על מתלה רשת פלדה, להחזיק את העכבר בחוזקה על ידי הזנב, ובעדינות למשוך את העכבר לאחור. זה יהיה לתפוס את הרשת עם הרגליים הקדמיות שלה בחוזקה. לחילופין, רסן עכבר ביד הלא-דומיננטית והרשה לאזור האגף להיראות.
    2. לחטא את העור של האגף עם דגימות אלכוהול, לאט ובהתמדה להזריק את התוכן של המזרק מתחת לעור של העכבר.
    3. להוציא את המחט ולמקם את העכבר בחזרה לכלוב שלו.

4. ניטור צמיחת הגידול

  1. לנטר עכברים פעם שבועית כדי לבדוק גידולים ממשית.
  2. לאחר גידולים נמצאים בגודל מדיד (כ 50 מ"מ3), השתמש קליבר כדי להקליט את ממדי הגידול. השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב אמצעי אחסון לגידול: (רוחב x רוחב x אורך)/2.
  3. הגידול בקציר פעם נפח הגידול מגיע סביב 1.5 ס"מ3 (כ 4 – 10 שבועות). הגידול נקרא כעת מעבר העכבר 1 (MP1).

5. גידול בקציר לרקמות בנקאיות, השרשה, וניסוי/אפיון

  1. להרוג את העכבר בחדר CO2 , לבדוק סימנים חיוניים כדי לאשר את המוות, ולאחר מכן להטביע את העכבר בתמיסה virkon כדי לעקר את העור עבור 30 s בביו-הקבינט.
  2. השתמש מספריים מעוקל מלקחיים כירורגי כדי להרים את העור הסמוך לגידול ולעשות חתך אופקי.
  3. השתמש טכניקת הפרדה קהה להניע את העור משני צידי הגידול ועל הגידול, חשיפת הגידול.
  4. להשתמש במספריים או להב אזמל כדי להפריד את הגידול מfascia.
  5. לכרות את הגידול ולהעביר את הגידול צלחת פטרי סטרילי, לחתוך את הגידול לחתיכות קטנות להסיר רקמה נקרוטית מן הגידול.
  6. . רקמת גידול בנקים להשתלה עתידית
    1. לקחת 2-3 חתיכות גידול קטן קטן יותר ~ 10 מ"מ x 10 מ"מ ו הממס אותם לחתיכות קטנות יותר ~ 1 מ"מ x 1 מ"מ.
    2. העבר את כל הרקמה טחון 2 מ ל בקבוקון קריוגני, להוסיף 1 מ ל של הקפאת מדיה (10% DMSO + 90% FBS).
    3. ערבב היטב ומניחים מבחנות קריוגניים לתוך מיכל מקורר לקירור מבוסס תאים בקרח יבש.
    4. לאחסן את המיכל ב-80 ° c מקפיא בלילה ולאחר מכן להעביר בצלוחיות חנקן נוזלי (LN2) אחסון.
  7. הקפאת רקמות עבור במורד הזרם (RNASeq, ווס, וכו ').
    1. מניחים חתיכות רקמת הגידול (~ 3 מ"מ x 3 מ"מ) לתוך בקבוקון קריוגני ולשים את בקבוקון קריוגני ב LN2 באופן מיידי. חנות בבקבוקונים ב-80 מקפיא ° c.

6. PDX טיפול בניסויים

הערה: זה ייקח שני שלבי הרחבה לגדול רקמת הגידול מספיק כדי להפיק את המספר הדרוש של עכברים הנושאת PDX לניסוי הטיפול.

  1. תרימי בקבוקון קריוזה המכיל את רקמת PDX הפקדה מ-LN2, ומניחים את הקריובקבוקון באמבט מים 37 ° c עד הקפאת התקשורת המכילה את רקמת הגידול הוא רק מתחיל להמיס.
  2. רוקן את התוכן של הקריובקבוקון לתוך מחומם מראש HBSS-/- בצינור 50 mL, ולשטוף את הרקמה.
  3. הרקמה גלולה על ידי צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 1,200 סל ד.
  4. הסר HBSS-/- ממדגם הגידול על ידי שאיפה ואקום עם Pipet פסטר.
  5. החלק את רקמת PDX מצינור 50 mL לתוך 5 ס"מ או 10 ס"מ צלחת פטרי ומקום על קרח רטוב.
  6. בצע את פרוטוקול השרשה לעיל כדי השתל רקמת הפקדה מתוך בקבוקון קריוגני לתוך 5 NSG עכברים לסיבוב הראשון של הרחבת הגידול PDX.
  7. לאחר גידולים להגיע ~ 600 – 800 מ"מ3, קציר 1-2 גידולים כדי לקבל השעיה תא בודד עם הפרוטוקול הנ ל עיבוד רקמות הגידול: דיסוציאציה מכנית, קולגן הליך העיכול תהליך הדיסוציאציה.
  8. גלולה תאים ולהשעות מחדש 6 מ ל של hbss-/-/מטריצה מלאכותית (1:1 יחס), תת עורית הכנסה ~ 50 nsg עכברים, עם 100 μl של תערובת התא לכל עכבר עבור הסיבוב השני של הרחבת הגידול pdx.
  9. למדוד את גודל הגידול עם מדידת שבועי.
  10. המתן לגודל הגידול של ~ 100 mm3 ב 3-5 שבועות, אקראי עכברים לקבוצות, ולהתחיל טיפול.
  11. כאשר גודל הגידול מגיע המרבי מאושר IACUC נפח, להפסיק את הטיפול.
  12. בצע את פרוטוקול גידול לעיל הקציר לאסוף חתיכות הגידול קפואים הצמד, הגידול חתיכות עבור פרפין בלוקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

רקמת הגידול עבור מלנומה PDX מודלים יכול לבוא ממגוון של מקורות שונים, יכול גם להיות מעובד לפי הדינמיקה הצמיחה של מודלים בודדים את השימוש הרצוי של רקמת PDX. העדיפות בעת יצירת מודל PDX היא לקבל חומר מספיק לבנק לשימוש עתידי DNA לאפיון (איור 1).

פעם מספיק חומר הוא הפקידה, רקמת הגידול ניתן להרחיב באחת משלוש שיטות עיקריות כדי לגדול גידול מספיק כדי לבצע מחקר טיפול פורמלי (איור 2א). כל אחת מהשיטות המתוארות במסמך זה תאפשר הרחבת גידול מ-PDXs (איור 2ב'). זהו הניסיון שלנו ליצור השעיית תא בודד של תאים סרטניים עם שימוש בעיכול אנזימטי (הקולגן הרביעי) יכול לאפשר גידול מהיר יותר הגידול, והוא יכול לאפשר גידול אחד הראשונית להתרחב 10 – 20 עכברים, ואילו קטע הגידול ושאיפה ניתן להרחיב את השיטה רק ל-5 – 10 עכברים (איור 2ג). כפי כבר הפגינו בעבר סוגים אחרים של גידולים, מלנומה PDX מודלים לעתים קרובות משקפים את רגישות התרופה המטופל הציג בעת טיפול. המוצג כאן הוא עקומת טיפול מייצג מחולה מלנומה עם brafV600E מלנומה מוטציה אשר בתחילה הגיב מעכב braf אבל בסופו של דבר הישנות. PDX נגזר מחולה זה גם הציג רגישות ראשונית לעיכוב BRAF (Rx1) בתוספת מעכב נוסף (Rx2); עם זאת, הגידולים הישנות בסופו של דבר (איור 3).

Figure 1
איור 1 : מודל Pdx הדור זרימת עבודה עבור רקמת גידול בנקאות וביצוע לימודי טיפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : שיטות השרשה אלטרנטיבית. (א) גידולים יכולים להיות מעובד לתוך אחד הגושים, השעיה שאיפה, או כמו תא בודד השעיה. (ב) כל שלוש שיטות יאפשר צמיחה של גידולים בvivo. המוצג כאן הם עכברים תת-עורי מושתל עם הגידול והתמונה 12 ימים לאחר השרשה. (ג) הראו הם הצמיחה עקומות הגידול עבור העכברים הוזרק עם אחת משלוש שיטות השרשה. N = 5 לכל זרוע; קווי שגיאה הם שגיאה סטנדרטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : נתונים מייצגים עבור משפט טיפול PDX. עכברים הושתל עם גידולים PDX וטופלו עם שליטה ברכב או שילוב שני מעכב של מעכב BRAF ו מעכב מק. N = 6 לכל זרוע. אקראיות השתמשו כדי למקם עכברים לקבוצות לימוד. של הערה, למרות ~ 500 mm3 שימש בדוגמה זו כמו נפח הגידול ההתחלתי עבור חניכה תרפיה, אמצעי האחסון השגרתי להתחיל מחקרים pdx הוא 100 – 200 מ"מ3 כמו לגידולים pdx הם אגרסיביים הצמיחה שלהם קשה לעכב פעם הם גדולים מדי גודל (> 300 מ"מ3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

יש לנו במסמך זה תיאר הפקת מודלים PDX של מלנומה עם רקמת החולה נגזר גידולים ראשוניים וגרורתי, ביופסיות ליבה, ו FNAs. כאשר העפילו ישירות לתוך עכברי NSG, הגידולים מציגים את המאפיינים המיורפולוגיים הדומים, גנומית ותכונות ביולוגיים לאלה שנצפו בחולה. במקרה כאשר רק כמות קטנה של רקמות זמין לחוקרים, כפי שקורה לעתים קרובות עם FNAs, טכניקת PDX מאפשר הרחבה של רקמת הגידול עבור DNA, RNA, ואפיון חלבונים, כמו גם עבור ניסויים תרפיה כדי לאפשר תרופות פרה-קליניים פיתוח.

ביקורת על ההצלחה של העפיב PDX היא איכות החוקרים החומריים מתחילים. טיפול יש לנקוט כדי להבטיח רקמת הגידול נשמר כראוי ככל האפשר בסעיפים 1 ו 2. חשוב מכך, התגובה לטיפול של מודלים מלנומה PDX יותר לסדר את הרגישות של החולה התורם, המאפשר חקירות קדם קלינית חזקה לפתח אסטרטגיות טיפוליות משופרות כדי להילחם התנגדות תרפיה ולשפר את עמידות לתגובה. רוב חולי מלנומה גרורתית לא חווים תרופות עם תקן קיים של טיפול (SOC) טיפולים5. אוסף מלנומה pdx שלנו מכיל יותר מ 500 מודלים נפרדים, כולל אלה הנגזרים מחולים אשר הישנות על טיפול ממוקד חיסוני1,2. משאב זה יהיה קריטי לפיתוח השיטות הטיפוליות התגברות על התנגדות ל-SOC הנוכחי. יישומים עתידיים עבור מודל pdx ייתמכו בגישות חסכוניות בעלות תפוקה גבוהה המינוף מודלים pdx במסכי התרופות ו CRISPR-Cas9 מסכי כדי לזהות אסטרטגיות אפקטיביות הרומן עבור גנוטיפים שונים (כלומר, BrafV600E, nrasQ61R) ו תת סוגים (כלומר, uveal, acral) של מלנומה14.

מגבלה אחת של טכניקת PDX היא הצורך כי חומר הגידול מחולק לעכברים ללא מערכת חיסונית כדי להבטיח הצלחה מראש1. לכן, מחקרים PDX אופטימיזציה אסטרטגיות טיפוליות להילחם התנגדות תרפיה לא מטפלים איך אסטרטגיות טיפול חדשות עשוי באופן חיובי או שלילי השפעה על המערכת החיסונית ו/או התגובה החיסונית אנטי הגידול. למרבה המזל, ההתקדמות בתחום של הומניזציה של העכבר עם מערכת החיסון האנושית נעשו ויאפשר מחקרים אידיאליים יותר PDX בעכברים, כי טוב יותר ללכוד את מיקרו הסביבה האנושית15.

לסיכום, מודלים pdx לאפשר חקירות טרום קליני של תאים מלנומה כי טוב יותר לכידה של טרוגניות הגידול ותוקפנות מלנומה נצפתה במרפאה (לעומת הגישות דו מימדי השני והסטנדרטי מבע). PDX מודלים לאפשר הבנה עמוקה יותר של אילו גנים מעורבים התנגדות תרפיה ולספק מודל קליני יותר רלוונטי שממנו טיפולים יעילים יותר ניתן לפתח כדי להגדיל את ההישרדות הכוללת של חולים עם מלנומה גרורתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מודים למכון החיות של מכון וויסטאר, למתקן המיקרוסקופיה, למתקן היסטולטכנולוגי ולמרכז לאספקת מחקר. מחקר זה מומן בחלקו על ידי מענקים U54 (CA224070-01), נבג (CA174523), P01 (CA114046-07), ד ר מרים ושלדון ג. אדלסון הקרן למחקר רפואי, ואת קרן המחקר מלנומה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Hepes SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # H0887-100ML
100x PenStrep  Invitrogen Cat # 15140163
1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) MED Cat # MT21-023-CV
2.5% Trypsin  SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # T4549-100ML 10 mL aliquots stored at –20oC
BSA SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # A9418-500G
Chlorhexidine Fisher Scientific Cat# 50-118-0313
Collagenase IV (2,000 u/mL) Worthington  Cat #4189 make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1
DMSO SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # C6295-50ML
DNase SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # D4527
EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) Merck Cat # 324626.25
FBS INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES Cat # 16000-044
Fungizone INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES Cat # 15290-018
Gentamicin FISHER SCIENTIFIC Cat # BW17518Z
Isoflurane HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH Cat # 050031
Leibovitz's L15 media  Invitrogen Cat # 21083027
Matrigel Corning Cat # 354230 Artificial extracellular matrix
Meloxicam HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein Cat # 025115 1-5mg/kg, as painkiller
NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice The Wistar Institute, animal facility breeding
PVA (polyvinyl alcohol) SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # P8136-250G
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine Fisher Scientific Cat# MT10041CM
Scalpel Feather Cat # 2976-22
Virkon GALLARD-SCHLESINGER IND Cat # 222-01-06
Wound clips MikRon Cat #427631

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garman, B., et al. Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines. Cell Reports. 21, (7), 1936-1952 (2017).
  2. Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21, (7), 1953-1967 (2017).
  3. Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, (6892), 949-954 (2002).
  4. Paraiso, K. H., et al. Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy. British Journal Of Cancer. 102, (12), 1724-1730 (2010).
  5. Long, G. V., et al. Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib. Journal of Clinical Oncology. 36, (7), 667-673 (2018).
  6. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, (9), 998-1013 (2014).
  7. Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 333, (1), 216-222 (2005).
  8. Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
  9. Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, (10), 2595-2605 (2017).
  10. Shi, H., et al. Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy. Cancer Discovery. 4, (1), 80-93 (2014).
  11. Monsma, D. J., et al. Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms. American Journal of Cancer Research. 5, (4), 1507-1518 (2015).
  12. Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, (7436), 251-255 (2013).
  13. Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77, (21), 62-66 (2017).
  14. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, (11), 1318-1325 (2015).
  15. De La Rochere, P., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends in Immunology. 39, (9), 748-763 (2018).
מלנומה מטופלת-נגזר מודל Xenograft
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, M., Rebecca, V. W., Herlyn, M. A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model. J. Vis. Exp. (147), e59508, doi:10.3791/59508 (2019).More

Xiao, M., Rebecca, V. W., Herlyn, M. A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model. J. Vis. Exp. (147), e59508, doi:10.3791/59508 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter