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Cancer Research

黒色腫患者由来異種移植片モデル

doi: 10.3791/59508 Published: May 20, 2019

Summary

患者由来異種移植片(PDX)は、黒色腫の分子および生物学的特徴をより強固に要約し、従来のプラスチック組織培養ベースのアッセイと比較して治療応答のより予測的である。ここでは、新しいPDXモデルの確立と既存のPDXモデルの特性/実験のための標準的な動作プロトコルについて説明します。

Abstract

蓄積された証拠は、従来の2次元組織培養容器で増殖した黒色腫細胞とヒト患者の生体内での分子および生物学的特性が異なっていることを示唆している。これは、生理学的条件がない場合にインビトロで強く成長することができる黒色腫細胞のクローン集団のボトルネック選択によるものです。さらに、2次元組織培養における治療に対する反応は、全体的に黒色腫患者における治療に対する反応を忠実に反映しておらず、臨床試験の大半は治療的組み合わせの有効性を示すことができなかった。Vitro。マウスへの黒色腫細胞の異種移植は、2次元組織培養アッセイに欠ける生体内の生理的な文脈を提供するが、生体細胞は、移植に使用される細胞のボトルネック選択を既に受けている。細胞株が確立された時の2次元条件。ボトルネックの結果として発生する不可逆的な変更には、成長および侵入特性の変化、および特定の亜集団の損失が含まれます。したがって、生体内のヒトの状態をより良く要約するモデルは、転移性黒色腫患者の全体的な生存率を効果的に増加させる治療戦略をより良く予測することができる。患者由来異種移植片(PDX)技術は、ヒト患者からマウスレシピエントへの腫瘍細胞の直接移植を含む。このようにして、腫瘍細胞は生体内の生理的ストレスの下で一貫して成長し、腫瘍がヒト患者にあったときに存在する分子および生物学的特性を維持する2次元ボトルネックを受けることはありません。注目すべきは、転移の臓器部位(すなわち、脳)に由来するPDXモデルは同様の転移能を示し、一方、PDXモデルは治療に対する素朴な患者および治療に対する後天性抵抗性を有する患者(すなわち、BRAF/MEK阻害剤療法)に由来する。治療と同様の感受性。

Introduction

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前臨床モデルは、疾患の特徴付け、癌と正常細胞に特有の実行可能な脆弱性の発見、および悪用する有効な治療法の開発を含む、翻訳癌研究のすべての側面において重要である。これらの脆弱性は、患者の全体的な生存率を高めるために.黒色腫分野では、何万もの細胞株モデルが薬物スクリーニングに多く利用されており、グループだけでも4,000人が貢献しています(WMXXXシリーズ)。これらの細胞株モデルは、様々な形態の皮膚黒色腫(すなわち、皮膚、腹部、表在性広がりを有する黒色腫患者)および多様な遺伝子型(すなわち、BRAF V600-変異および神経芽細胞腫RASウイルス腫瘍遺伝子ホモロ) に由来した。NRASQ61R-変異体])、これは、診療所1、2に存在する疾患のスペクトルにまたがる。

明らかに、黒色腫分野における最も成功した標的治療戦略は、1)黒色腫3の約50%でBRAF変異を同定する患者の腫瘍のゲノム特性を明らかにし、2)前臨床調査から出現した。黒色腫細胞株モデル4を活用する。BRAF/MEK阻害剤の組み合わせは、黒色腫がBRAFV600E/K変異を活性化し、>75%の応答率5を誇る患者の治療のために2014年に承認された食品医薬品局(FDA)でした。この初期の有効性にもかかわらず、多重固有および獲得した抵抗機構および腫瘍内不均一性のために、ほぼすべてのケースで抵抗が急速に生じる。残念ながら、細胞株モデルは、プラスチック容器内の2次元培養中に成長した場合の代表的な生物学的不均一性を要約しない。黒色腫6の特定の形態または遺伝子型を有する患者に有効であるかもしれない療法。腫瘍内不均一性を最適にモデル化する方法を理解することは、研究者が現在の標準的なケア療法に失敗を駆動する治療耐性の亜集団を殺すことができる治療モダリティをより良く開発することを可能にします。

セルラインモデルの限られた予測値に最も重要なのは、それらが最初にどのように確立されるかです。患者の腫瘍の単細胞懸濁液が2次元のプラスチック組織培養血管上で増殖すると、腫瘍クローンの景観において不可逆的な変化が起こり、増殖性および侵襲性の変化を含む、特異的な排除亜集団、および遺伝情報の改変7.これらの黒色腫細胞株モデルのマウスへの異種移植片は、前臨床試験のための生体内プラットフォームで最も頻繁に使用される。しかし、この戦略はまた、臨床的に観察される複雑な腫瘍の不均一性の貧弱な要約に苦しんでいる。この欠点を克服するために、PDXモデルを含む、より洗練された前臨床モデルの黒色腫を組み込むことに関心が高まっています。PDXモデルは>30年にわたり利用されており、肺癌患者における精液研究は、細胞傷害性薬剤に対する患者の応答と同じ患者8由来のPDXモデルの応答との間の一致を実証した。近年、PDXモデルを業界や学術センターの前臨床調査に最適なツールとして活用する動きが見られます。PDXモデルは、ヒト患者における腫瘍の不均一性の優れた要約のために、細胞株異種移植片9よりも治療最適化の取り組みにおいて使用することにより臨床的に関連している。黒色腫では、高度疾患10の治療管理を鈍らせる巨大なハードルがある。臨床的に関連するPDXモデルは、臨床的耐性をモデル化し、治療抵抗性腫瘍11、12を治療するために臨床的に利用可能な薬剤を用いて治療戦略を同定するために使用されてきた。簡単に言えば、PDXモデルを生成するためにここに提示されたプロトコルは、NOD/scid/IL2受容体ヌル(NSG)マウスへの原発性または転移性黒色腫(生検または手術によって収集される)からの新鮮な組織の皮下移植を必要とする。方法論的アプローチの異なるバリエーションは、異なるグループによって使用されます。ただし、基本的なコアは13が存在します。

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Protocol

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以下の動物プロトコルは、ウィスター研究所の人道倫理委員会および動物ケアガイドラインのガイドラインに従っています。

1. 黒色腫腫瘍組織採取

  1. 以下の手術または生検方法のいずれかによって黒色腫患者から腫瘍組織(通行0と呼び)を採取する。
    1. 外科的切除組織の場合は、4°Cまたは氷上で輸送貯蔵媒体(RPMI 1640 + 0.1%真菌度+0.2%ゲンタマイシン)で少なくとも1gの組織(切除転移および原発性病変)を維持する。
    2. 外科生検組織の場合、4°Cまたは氷上の輸送貯蔵媒体で、1g未満の組織(しばしば皮下転移およびリンパ節[LN]転移のパンチ生検)を維持する。
    3. コア生検組織の場合は、約10mm x 1mm(多くの場合、肝生検)の組織のシリンダー(コア)を4°Cまたは氷上で5mLの輸送貯蔵媒体を含む15 mLチューブに洗い流します。
    4. 細かい針吸引(FNA)組織の場合は、患者から直接針と注射器で4°Cまたは氷の上で直接採取した非常に少量の組織(サイズが1mm未満)を保ちます。
  2. 4 °Cまたは氷の上で、または外科的切除または生検後の夜間出荷で輸送貯蔵媒体で組織を送送る。分娩の1-2時間以内に組織を処理する。

2. マウス移植のための腫瘍組織処理

  1. 外科的切除または外科生検組織処理
    1. 無菌ペトリ皿に組織を移し、腫瘍組織を可能な限り周囲の正常組織から分離する。
    2. 壊死組織(通常は腫瘍内の中央に位置する薄い白っぽい組織として同定される)を残りの腫瘍から可能な限り除去する。
    3. メスを使用して、最初の腫瘍の塊を、外科的マウス移植のためにほぼ等しい部分(約3 mm x 3mm)に細分化します(図2)。
    4. 必要に応じて、十分な腫瘍組織が利用可能な場合は、下流アッセイ(RNAシーケンシング[RNASeq]、全エキソメシーケンシング[WES]など)のために組織をスナップフリーズする。
    5. 2つのメスの刃とのクロスブレード技術を使用して腫瘍組織をミンチすることによって腫瘍スラリーを作る。腫瘍の塊を可能な限り細かくミンチしてスラリーを形成し、手術用マウス移植の準備が整いました。
    6. あるいは、腫瘍組織が機械的解離に対して硬すぎる場合は、消化解離手順を使用してゲル状スラリーを形成し、移植および/または注射のための単細胞懸濁液を形成する。
      1. 腫瘍塊を可能な限り細かくミンチしてスラリーを形成する。
      2. 冷たいハンクのバランス塩溶液(HBSS)-/-(Ca++とMg++なし)で50 mLチューブにスラリーを入れてください。その後、遠心分離機とペレットを220 x gで4°Cで4分間使用します。
      3. 腫瘍組織の1g当たり1gにつき、10mLの温められた新鮮なダイジェスト媒体(200 U/mLコラゲナーゼIV+5 mM CaCl2 + 50 U/mL DNase in HBSS-/-)でスラリーを再中断する。
      4. チューブを37°Cの水風呂に20分間入れ、使い捨てピペットで5分ごとに激しく混ぜます。
      5. HBSSの最大50 mLで洗浄-/-;その後、遠心分離機を220 x gで4°Cで4分間使用します。
      6. 予温められたTEGの5 mLを加える(0.025%トリプシン+40 μg/mLエチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N、N'、N'、N'-四面体酸[EGTA]+10μg/mLポリビニルアルコール[PVA])腫瘍の1g当たり1g ゆっくりと再び振り直し、チューブを混合せずに2分間37°Cに置きます。
      7. 少なくとも1つの等しい量の冷間染色培布(1%ウシ血清アルブミン[BSA]+10 mM 4-(2-ヒドロキセチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸[HEPES]+L15培中のペニシリン-ストレプトマイシン1xペニシリン-ストレプトマイシン)をm2でクエンシンを4°m2でクエンチするC。
      8. 腫瘍組織の1g当たり10mLの染色培養培養液でサンプルを再懸濁し、40μmの細胞ストレーナーを通して濾過し、マウス注射用の単細胞懸濁液を得る(図2)。
      9. 細胞ストレーナーの上に残っているスラリーはまた外科マウスの移植のために集めることができる。
  2. C鉱石生検組織処理
    1. 5 cmペトリ皿に組織輸送チューブにコアシリンダー組織を注ぎます。
    2. 余分な液体を取り除き、ペトリ皿の端に組織を擦り、腫瘍組織を細かくミンチし、腫瘍組織の上に〜100〜150 μLのHBSS-/-加え、HBSS/腫瘍組織懸濁液を1mLシリンジに素早く引き込む。
    3. 1 mL注射器に23Gの針を取り付け、1.5 mLのスピンチューブに針を通してHBSS/腫瘍組織懸濁液を渡します。
    4. 腫瘍懸濁液を注射器に引き込み、針を通り抜けるまで針を引き続き刺します。
    5. 最後に腫瘍懸濁液を注射器に戻し、23G針を取り外します。
    6. 27Gの針を取り付け、人工細胞外マトリックス(材料の表を参照)の等しい体積(〜100〜150 μL)を注射器に引き込みます。
    7. 腫瘍/HBSS-/-懸濁液を用いて1.5 mLのスピンチューブにゆっくりと人工細胞外マトリックスの等しい体積を加え、気泡の形成を慎重に回避します。
    8. 最後に1回注射器に戻って描画し、コア生検腫瘍組織は、マウス注射の準備が整いました。
  3. FNA組織加工
    1. FNAサンプル(針に閉じ込められた)を含む注射器を氷の上に置きます。
    2. 注射器から針(FNA組織を含む)を分離し、注射器からプランジャーを取り出し、HBSS-/-約150〜200 μLを注射器の上部に加えます。
    3. プランジャーを注射器と針(FNA組織を含む)に再挿入し、HBSS-/-針を通して1.5 mLのスピンチューブに押し出します。このステップは針からFNA腫瘍を取り除く。
    4. HBSS-/-/FNA懸濁液を同じ注射器を使用して2回ステップ2.3.3を繰り返し、針からの腫瘍組織の検索を最大化します。
    5. HBSS/FNA懸濁液を含む1.5 mLスピンチューブに人工細胞外マトリックスの等しい体積(~100~150 μL)を追加します。
    6. 人工細胞外マトリックス/HBSS-/---/FNAサスペンションを23G針にゆっくりと引き戻し、2回繰り返すことで十分に混合します。
    7. 人工細胞外マトリックス/HBSS-//FNA体積全体を注射器に戻し、23G針を27G針に交換し、FNAサンプルをマウス注射の準備が整いました。

3. マウスの腫瘍移植と注射

  1. 外科的切除または外科生検組織の移植
    注:すべての手術器具がオートクレーブまたは事前滅菌可能な使い捨て機器の使用によって無菌であることを確認してください。
    1. NSG 6-8週の雄または雌マウスの下部背部から毛を剃り、髪のない約1.5cm x 3cmの領域を残します。イゾフランを用いてマウスを麻酔し、応答性の試験として足を静かに絞って確認する。乾燥を防ぐために、目に獣医の歯を使用してください。
    2. 個々のマウスを麻酔機の鼻コーンのヒートパッドに置き、クロルヘキシジンで剃った領域をスクラブする。その後、70%エタノールで使用し、蒸発することを可能にする。
    3. チャンクを準備するか、外科的移植のための個々のマウンドにペトリ皿の腫瘍スラリーを分割する(すなわち、3匹のマウスに移植される場合は3つの等しいマウンドに)。
    4. メスブレードを使用して、マウスの背面の中心に約5mmの長さの切開を行い、1組の鉗子を取り、オペレータの反対側の切開部の皮膚を持ち上げる。
    5. もう一方の手にハサミを取り、小さなはさみカットで筋膜を優しく切断することにより、筋肉層から皮膚を分離し、それによって腫瘍組織のための「ポケット」を作成します。
    6. メスブレードで腫瘍スラリー組織の1つの腫瘍チャンクまたは1つの個々のマウンドをピックアップし、作成されたポケットに組織を穏やかに配置します。
    7. ポケットの腫瘍組織マウンドに人工細胞外マトリックスの100 μLを投与する。
    8. 2組の鉗子を使用して、傷口の端が近づくように両端の切開部を引き上げ、1つまたは2つの創傷クリップを適用して創傷を閉じる。
    9. 皮下注射 1-5 mg/kg メロキシカムは、手術後のマウスの鎮痛剤として.
    10. マウスをノーズコーンから取り出し、元のケージに戻し、目を覚ます間にマウスを観察します。完全に回復するまでケージに戻らないで下さい。
    11. 約7日後に傷ついたクリップを取り外します。治癒が7日後に完了しない場合は、さらに1〜2日間創傷クリップを中に残します。
      注:外科的切除または外科的生検組織処理から単一の細胞懸濁液を使用する場合、マウス注射のための人工細胞外マトリックス(1:1比)と混合します。
  2. FNAまたはコア生検組織の注射
    1. NSGマウスをスチールグリッドラックに置き、マウスを尾部でしっかりと保持し、マウスをゆっくりと引き戻します。それは前脚でグリッドをしっかりとつかむでしょう。または、非支配的な手でマウスを拘束し、側面領域を表示させます。
    2. アルコール予備綿棒で脇腹の皮膚を消毒し、マウスの皮膚の下に注射器の内容物をゆっくりと着実に注入する。
    3. 針を引き抜き、マウスをケージに戻します。

4. 腫瘍の増殖を監視する

  1. マウスを週に1回監視し、触知可能な腫瘍をチェックします。
  2. 腫瘍が測定可能なサイズ(約50 mm3)になったら、キャリパーを使用して腫瘍の寸法を記録します。腫瘍体積を計算するには、次の式を使用します: (幅 x 幅 x 長さ) / 2.
  3. 腫瘍の体積が約1.5 cm3(約4〜10週間)に達すると、腫瘍を収穫する。腫瘍はマウス通路1(MP1)と呼ばれるようになりました。

5. バンキング組織の腫瘍の収穫、再移植、実験/特性化

  1. CO2チャンバーでマウスを安楽死させ、バイタルサインをチェックして死亡を確認し、Virkon溶液にマウスを沈め、バイオキャビネット内で30sの皮膚を殺菌します。
  2. 湾曲したはさみと外科鉗子を使用して、腫瘍に隣接する皮膚を持ち上げ、水平方向のカットを行います。
  3. 鈍い分離技術を使用して、腫瘍の両側と腫瘍の上に皮膚を動員し、腫瘍を露出させる。
  4. はさみまたはメスブレードを使用して、腫瘍を筋膜から分離します。
  5. 腫瘍を切除し、滅菌ペトリ皿に腫瘍を移し、腫瘍を小片に切り取り、腫瘍から壊死組織を除去する。
  6. 将来の移植のための銀行腫瘍組織。
    1. 2~3個の小さな腫瘍片を~10mm x 10mmより小さく取り、~1mm x 1mmより小さい部分にミンチします。
    2. すべてのミンチ組織を2 mL低温バイアルに移し、凍結培養剤の1 mL(10%DMSO+90%FBS)を加加える。
    3. よく混ぜ、ドライアイスの上に予め冷却されたイソプロパノールベースの細胞凍結容器に低温バイアルを置きます。
    4. 容器を-80°C冷凍庫に一晩保管し、低温バイアルを液体窒素(LN2)貯蔵に移します。
  7. 下流アッセイ用スナップ凍結組織(RNASeq、WESなど)。
    1. 腫瘍組織片(約3mm x 3mm)を低温バイアルに入れ、直ちにLN2に低温バイアルを入れます。バイアルを-80°Cの冷凍庫に保管してください。

6. PDX療法試験

注:治療試験に必要な数のPDXベアリングマウスを生成するのに十分な腫瘍組織を成長させるには、2つの膨張段階が必要です。

  1. LN2からバンクされたPDX組織を含む凍結を取り出し、腫瘍組織を含む凍結培地が溶け始めるまで37°Cの水浴に凍結を入れます。
  2. クライオビアルの内容物を50mLチューブで予め温めたHBSS-/-に空にし、ティッシュを洗浄する。
  3. 1,200 rpmで5分間遠心分離によるペレット組織。
  4. パスツールピペで真空吸引により腫瘍サンプルからHBSS-/-除去します。
  5. 50 mLチューブからPDX組織を5cmまたは10cmのペトリ皿にスライドさせ、濡れた氷の上に置きます。
  6. PDX腫瘍拡張の第1ラウンドのために、低温バイアルから5つのNSGマウスにバンクされた組織を移植するために上記の移植プロトコルに従ってください。
  7. 腫瘍が〜600〜800mm3に達すると、腫瘍組織処理のための上記のプロトコルで単一の細胞懸濁液を得るために1-2腫瘍を収穫する:機械的解離、コラゲナーゼ消化解離手順。
  8. ペレット細胞およびHBSS-//人工細胞外マトリックスの6mLで再中断し、皮下注射〜50 NSGマウス、PDX腫瘍拡張の第2ラウンドのためのマウス当たり100μLの細胞混合物を有する。
  9. 隔週キャリパーで腫瘍サイズを測定します。
  10. 3〜5週間で〜100mm3の腫瘍サイズを待ち、マウスを群に無作為化し、治療を開始する。
  11. 腫瘍のサイズがIACUC承認の最大体積に達したら、治療を中止してください。
  12. 上記の収穫腫瘍プロトコルに従って、スナップ凍結腫瘍片、パラフィンブロック用の腫瘍片を収集します。

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Representative Results

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黒色腫PDXモデルの腫瘍組織は、様々な異なる供給源から来ることができ、また、個々のモデルの成長力学およびPDX組織の所望の使用に応じて処理することができる。PDXモデルを確立する際の優先事項は、将来の使用のために銀行に十分な材料を持ち、キャラクタライゼーションのためのDNAを持つことです(図1)。

十分な材料がバンクされると、腫瘍組織は、正式な治療研究を行うのに十分な腫瘍を成長させる3つの主要な方法のいずれかで拡張することができる(図2A)。ここに記載されている各方法は、PDX(図2B)からの腫瘍の拡大を可能にする。酵素消化(コラゲナーゼIV)を用いて腫瘍細胞の単細胞懸濁液を作製すると、より迅速な腫瘍増殖が可能になり、1つの初期腫瘍を10~20匹のマウスに拡張できるのに対し、腫瘍チャンクとスラリーは10~20匹に拡大できるというのが私たちの経験です。方法は5~10匹のマウスにしか展開できません(図2C)。他の腫瘍タイプで以前に実証されているように、黒色腫PDXモデルは、多くの場合、治療時に患者が表示される薬物感受性を反映する。ここに示すのは、BRAFV600E変異型黒色腫を持つ色腫患者の代表的な治療曲線であり、最初はBRAF阻害剤に反応したが、最終的に再発した。この患者に由来するPDXはまた、BRAF阻害(Rx1)に加えて追加阻害剤(Rx2)に対する初期感受性を示した。しかし、腫瘍は最終的に再発した(図3)。

Figure 1
図 1: 腫瘍組織のバンキングと治療研究を行うためのPDXモデル生成ワークフロー。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 代替移植方法。(A) 腫瘍は、チャンク、スラリー懸濁液、または単細胞懸濁液として処理することができる。(B) 3つの方法はすべて、生体内の腫瘍の増殖を可能にする。ここに示すのは、腫瘍を皮下に移植し、移植後12日目に画像化したマウスである。(C)3つの移植方法の1つを注射したマウスに対する腫瘍増殖曲線を示す。N = アームあたり 5;エラー バーは標準エラーです。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: PDX療法試験の代表的なデータ。マウスをPDX腫瘍に移植し、BRAF阻害剤とMEK阻害剤の車両対照または2阻害剤の組み合わせのいずれかで治療した。アームあたり N=6。無作為化は、マウスを研究群に置くために使用された。なお、この例では治療開始用腫瘍体積として~500mm3が用いられたが、PDX腫瘍が積極的であり、大きすぎると増殖を阻害するのが難しいため、PDX研究を開始するルーチン体積は100~200mm3である。サイズ (>300mm 3)この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

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我々は、原発性および転移性腫瘍、コア生検、およびFNAに由来する患者組織を有する黒色腫のPDXモデルの生成について説明した。NSGマウスに直接移植されると、腫瘍は患者で観察されるものと同様の形態学的、ゲノム的、および生物学的特性を有する。FNAで頻繁に発生する少量の組織しか研究者が利用できない場合、PDX技術はDNA、RNA、タンパク質の特性特性に対する腫瘍組織の拡大を可能にするとともに、前臨床薬を可能にする治療試験を可能にする。開発。

PDXの移植の成功に不可欠なのは、材料研究者の品質から始まる。腫瘍組織がセクション1および2で可能な限り適切に保存されるように注意する必要があります。重要なことに、PDX黒色腫モデルの治療に対する応答は、ドナー患者の感受性をより的に要約し、治療抵抗性と戦うための改善された治療戦略を開発し、改善する堅牢な前臨床研究を可能にする。応答の耐久性。ほとんどの転移性黒色腫患者は、既存の標準のケア(SOC)療法5で治療を受けていない。私たちのPDX黒色腫コレクションには、標的治療および免疫療法1、2で再発した患者に由来するものを含む500以上の異なるモデルが含まれています。このリソースは、現在のSOCに対する耐性を克服する治療モダリティの開発に不可欠です。CRISPR-Cas9スクリーンは、異なる遺伝子型(すなわち、BRAF V600E、NRAS Q61R)および亜型(すなわち、uveal、acral)の黒色腫14に対する新規有効戦略を同定する。

PDX技術の1つの制限は、腫瘍材料が生着の成功を確実にするために免疫系なしでマウスに移植される必要性である1.したがって、PDXは、治療抵抗性と戦うための治療戦略を最適化する研究は、新しい治療戦略が免疫系および/または抗腫瘍免疫応答にプラスまたはマイナスの影響を与える方法に対処していません。幸いなことに、ヒト免疫系を用いてマウスヒト化の分野における進歩がなされ、ヒトの微小環境15をより良く要約するマウスにおけるより理想的なPDX研究を可能にする。

要約すると、PDXモデルは、診療所で観察された腫瘍の不均一性および黒色腫の攻撃性をより良く要約する黒色腫細胞の前臨床研究を可能にする(他の2次元および標準的な異種移植片アプローチに対して)。PDXモデルは、どの遺伝子が治療抵抗性に関与しているのかをより深く理解し、転移性黒色腫患者の全体的な生存率を高めるためにより効果的な治療法を開発できる、より臨床的に関連するモデルを提供します。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

著者らは、ウィスター研究所動物施設、顕微鏡検査施設、ヒストテクノロジー施設、研究サプライセンターに感謝しています。この研究は、U54(CA224070-01)、SPORE(CA174523)、P01(CA114046-07)、ミリアム博士とシェルドン・G・アデルソン医学研究財団、メラノーマ研究財団からの助成金の一部を受け取りました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Hepes SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # H0887-100ML
100x PenStrep  Invitrogen Cat # 15140163
1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++) MED Cat # MT21-023-CV
2.5% Trypsin  SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # T4549-100ML 10 mL aliquots stored at –20oC
BSA SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # A9418-500G
Chlorhexidine Fisher Scientific Cat# 50-118-0313
Collagenase IV (2,000 u/mL) Worthington  Cat #4189 make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1
DMSO SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # C6295-50ML
DNase SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # D4527
EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid) Merck Cat # 324626.25
FBS INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES Cat # 16000-044
Fungizone INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES Cat # 15290-018
Gentamicin FISHER SCIENTIFIC Cat # BW17518Z
Isoflurane HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH Cat # 050031
Leibovitz's L15 media  Invitrogen Cat # 21083027
Matrigel Corning Cat # 354230 Artificial extracellular matrix
Meloxicam HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein Cat # 025115 1-5mg/kg, as painkiller
NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice The Wistar Institute, animal facility breeding
PVA (polyvinyl alcohol) SIGMA-ALDRICH CORPORATION Cat # P8136-250G
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine Fisher Scientific Cat# MT10041CM
Scalpel Feather Cat # 2976-22
Virkon GALLARD-SCHLESINGER IND Cat # 222-01-06
Wound clips MikRon Cat #427631

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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黒色腫患者由来異種移植片モデル
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Xiao, M., Rebecca, V. W., Herlyn, M. A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model. J. Vis. Exp. (147), e59508, doi:10.3791/59508 (2019).More

Xiao, M., Rebecca, V. W., Herlyn, M. A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model. J. Vis. Exp. (147), e59508, doi:10.3791/59508 (2019).

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