Summary
هنا، يمكننا وصف السابقين فيفو توسيع نطاق من الخلايا الجذعية المكونة للدم من CD34+ الخلايا المشتقة من دم الحبل السري تعامل مع مزيج سيتوكين كوكتيل وجيش فيتنام الشعبي. ويؤدي هذا الأسلوب إلى درجة كبيرة من السابقين فيفو توسيع هسكس البدائية أما السريرية أو التطبيقات المختبرية.
Abstract
توفير وحدات الدم (UCB) الحبل السري مصدر بديل للخلايا الجذعية المكونة للدم البشري (HSCs) للمرضى الذين يحتاجون إلى زرع نخاع العظام متمكنة. بينما UCB له العديد من المزايا الفريدة، محدودية عدد هسكس داخل كل وحدة UCB يحد من استعمالها في الطب التجديدي، وزرع HSC في البالغين. توسيع الكفاءة الوظيفية هسكس البشرية يمكن أن تحققه السابقين فيفو استزراع من CD34+ خلايا معزولة من أوكبس وتعامل مع مثبط ديسيتيلاسي، حمض فالبرويك (جيش فيتنام الشعبي). البروتوكول بالتفصيل هنا يصف ظروف الثقافة والمنهجية لعزل سرعة CD34+ الخلايا، وتوسيع مجموعة هسكس البدائية إلى درجة عالية. هسكس الموسعة قادرة على إنشاء engraftment قصيرة الأجل وطويلة الأجل على حد سواء وهي قادرة على أن تؤدي إلى جميع أنواع متباينة من الخلايا المكونة للدم. هذا الأسلوب أيضا يحمل إمكانات للتطبيق السريري في العلاج الجيني HSC ذاتي ويوفر نهج جذابة للتغلب على فقدان هسكس الوظيفية المرتبطة بتحرير الجينات.
Introduction
السابقين فيفو توسيع نطاق من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) من دم الحبل السري وحدات (UCB) يحمل وعدا كبيرا للتطبيقات HSC في الطب التجديدي، والعلاج بزرع. وقد زرع مع وحدات UCB عدة مزايا فريدة مثل مجموعة سهلة، وتوافر عالية، الحد الأدنى من المخاطر للعدوى، وانخفاض خطر الانتكاس المرض، والتردد المنخفض للابتزاز مقابل المرض المضيف (GVHD). ومع ذلك، هي المساوئ الرئيسية لاستخدامها في إعدادات السريرية عدد محدود من هسكس موجودة داخل كل وحدة UCB1. عدم كفاية عدد النتائج هسكس engraftment تأخر والاسترداد المكونة للدم، وخطر رفض الابتزاز، وإعادة تشكيل المناعية الشاذة.
حاليا، قد وضعت مختلف أساليب واستراتيجيات للسابقين فيفو توسيع في عدد محدود من هسكس من أوكبس. تركيبات من الكوكتيل سيتوكين مختلفة مع جزيئات صغيرة أو المركبات في السابقين فيفو الثقافات نتيجة في درجات مختلفة من التوسع في HSC الأرقام2،،من34،،من56، 7،8. الأهم من ذلك، حمل الشروط السابقين فيفو ثقافة الإجهاد، مما يؤدي إلى تكاثر الخلايا السريع وزيادة النشاط الأيضي وفقدان الخصائص البدائية التي تحدد هسكس الأولية. ولذلك، هناك حاجة إلى وضع البروتوكولات التي تؤدي إلى التوسع في عدد كبير من هسكس الفنية ذات الخصائص التي تشبه هسكس البدائية الأولية.
الثقافات المصل خالية من CD34+ الخلايا المعزولة من أوكبس وتعامل مع النتيجة (جيش فيتنام الشعبي) حمض فالبرويك في التوسع في عدد كبير من البدائية هسكس4،،من910. توسيع HSC ليس فقط بسبب انتشار هسكس القائمة المستمدة من أوكبس. بدلاً من ذلك، يرجع هذا التوسع في الحصول النمط الظاهري البدائية جنبا إلى جنب مع عدد محدود من انقسامات الخلية وانتشار9. ضمن ح 24 – 48 الأولى من الحضانة مع مزيج من السيتوكينات وجيش فيتنام الشعبي، CD34+ اكتساب الخلايا من ترانسكريبتوميك والمظهرية الشخصية التي تميز هسكس طويلة الأجل. ويرافق الزيادة الكبيرة في نسبة هسكس حدوث زيادة سريعة في عدد هسكس (زيادة إضعاف 63 خلال 24 ساعة علاج جيش فيتنام الشعبي)9. جدير بالذكر أن يوسع استراتيجية التوسع في جيش فيتنام الشعبي السابقين فيفو هسكس مع انخفاض النشاط الأيضي، الذي يبرز كذلك خصائصها البدائية.
الأسلوب الموصوفة هنا يوفر الظروف والعلاجات التي تؤدي إلى درجة كبيرة من السابقين فيفو توسيع هسكس البدائية أما السريرية أو التطبيقات المختبرية. يستخدم هذا السابقين فيفو استراتيجية التوسع كوكتيل سيتوكين جنبا إلى جنب مع العلاج جيش فيتنام الشعبي. جيش فيتنام الشعبي هو المخدرات إدارة الأغذية والعقاقير المعتمدة للعلاج من اضطرابات القطبين، وغيرها من الأمراض العصبية. توسيع HSC مع جيش فيتنام الشعبي هو موجه، وتحدث في غضون 7 أيام، تقليل وقت المعالجة وخطر التلوث. الأهم من ذلك، يتيح هذا البروتوكول للحصول على المدى الطويل HSC علامات المظهرية مثل CD90 و CD49f داخل ح 24-48 بعد العلاج مع جيش فيتنام الشعبي9. ترقيع HSC موسعة تم إنشاؤها بواسطة هذا البروتوكول لديها القدرة على تجديد النظام المكونة للدم نظراً لأنها تفرق في جميع الخلايا المكونة للدم الأنساب وإنشاء انجرافتمينت طويلة الأجل بعد زرع في الفئران مجموعة موردي المواد النووية ميلوابلاتيد نماذج4. وعلاوة على ذلك، هذا البروتوكول هو استنساخه بدرجة عالية ويسمح لعزل CD34 قابلة للتطبيق الفعال والسريع+ الخلايا من أوكبس، الذي هو حاسم بالنسبة للتصنيع في هذا الإجراء.
جيش فيتنام الشعبي السابقين فيفو توسيع البروتوكول أيضا لديه القدرة على التغلب على فقدان كبير هسكس الذي يحدث أثناء تحرير11الجينات. الجينات التحرير يتطلب التعرض السيتوكينات، وضرورية للخلايا الدراجات وتفعيل آليات إصلاح الحمض النووي. بسبب آثار فورية معاملة جيش فيتنام الشعبي، قد يكون هذا الأسلوب مفيداً توليد عدد أكبر من الخلايا المحورة وراثيا ضمن فترة زمنية حاليا ذات الصلة لاستخدام البروتوكولات التعديل الجيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HSC السابقين فيفو توسيع البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية "اللجنة أخلاقيات البحوث" في "جبل سيناء كلية الطب".
1-المخزن المؤقت وإعداد وسائل الإعلام
- إعداد المخزن المؤقت للفصل 24 ساعة قبل عزلة CD34+ الخلايا من أوبكس بإضافة 2 مل من حامض Diamine الإثيلين م رباعي الخليك 0.5 (يدتا) و 33 مل من 7.5% ألبومين المصل البقري (BSA) لمل 465 مخزنة المالحة (1 x PBS). المزيج بلطف والمحافظة على المخزن المؤقت بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- وسائط دافئة في درجة حرارة الغرفة في اليوم لتنقية.
2-عزل الخلايا وحيدات النوى (الشركات المتعددة الجنسيات) من وحدة UCB
- الاستغناء عن وحدة UCB كاملة في قارورة2 75 سم. تمييع ولطف مزيج UCB مع زيادة حجم برنامج تلفزيوني متساوية في درجة حرارة الغرفة.
- تحديد عدد الأنابيب اللازمة لتجهيز وحدة UCB كاملة (واحدة 50 مل الأنبوبة المخروطية يمكن استخدامها لمعالجة 35 مل UCB المخفف). إضافة 15 مل من الكثافة المتدرجة (انظر الجدول للمواد) وسائط الإعلام إلى كل أنبوبة والاستغناء عن UCB المخفف أعلى كثافة وسائل الإعلام التدرج خلق طبقتين.
ملاحظة: الاستغناء عن UCB المخفف ببطء شديد أثناء الضغط على الأنبوب بزاوية 45 درجة لمنع خلط طبقة كثافة وسائل الإعلام التدرج مع UCB. - الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 30 دقيقة في انخفاض معدل التسارع والتباطؤ. بعد الطرد المركزي، تحديد الشركات المتعددة الجنسيات في طبقة بيضاء (بافي معطف) بين البلازما وكثافة الطبقة التدرج في وسائل الإعلام.
- نضح 2/3 البلازما ببطء دون الإخلال بطبقة معطف بافي. نقل طبقة معطف بافي بعناية في أنبوب 50 مل جديدة. جمع جميع الشركات المتعددة الجنسيات من نفس الوحدة UCB في أنبوب 50 مل حتى وصلت إلى 25 مل. استخدام أنبوب جديد إذا تجاوز حجم الشركات المتعددة الجنسيات التي جمعت 25 مل.
- إضافة 25 مل من برنامج تلفزيوني الباردة في أنبوب يحتوي على 25 مل من الشركات المتعددة الجنسيات ومزيج جيد. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: برنامج تلفزيوني الباردة مهم لمنع فرض حد أقصى للأجسام المضادة على سطح الخلية وتقليل العلامات غير محددة. - نضح المادة طافية بعناية ولطف إعادة تعليق بيليه الخلية في 50 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
- إزالة 20 ميكروليتر من تعليق خلية للعد. حساب عدد الخلايا ملطخة يوديد propidium البرتقالي/أكريديني التلوين باستخدام عداد الآلي خلية. حساب العدد الإجمالي للشركات المتعددة الجنسيات.
ملاحظة: يمكن أن يؤديها عدد الخلايا أيضا بطريقة الاستبعاد الأزرق تريبان استخدام هيموسيتوميتير. - أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: إذا كان غير مطلوب فورا، يمكن تجميد الشركات المتعددة الجنسيات في هذه المرحلة.
3-عزل CD34 الخلايا+ من أوكبس
- إعداد CD34+ جسم مقترنة بالحل الخرز المغناطيسي لعزل CD34 الخلايا+ من الشركات المتعددة الجنسيات-مزيج 300 ميليلتر فصل المخزن المؤقت مع 100 ميليلتر من البشر FcR البشرية مفتش (كاشف حظر) و 100 ميليلتر من الخرز CD34 المغناطيسي لعزل CD34 + الخلايا من كل الجنسيات8 10. لعزل عدد أعلى من CD34+ الخلايا من (> 108) الشركات المتعددة الجنسيات، الارتقاء الكواشف تبعاً لذلك.
- نضح المادة طافية من أنبوب تثفيل في خطوة 2.8 بعناية. ريسوسبيند بيليه في الحل الخرز المغناطيسي CD34 إعدادها في الخطوة 3.1 (استخدام 500 ميليلتر لحل كل 108 خلايا).
- المزيج بلطف واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: تحضير جهاز فاصل الخلايا (انظر الجدول للمواد) خلال فترة الحضانة. استبدال حل تخزين المخزن المؤقت العامل كما هو مبين بتعليمات الشركة المصنعة وتشغيل برنامج غسيل يليه برنامج شطف. - إضافة فاصل الخلية الباردة تشغيل المخزن المؤقت للأنبوب الذي يحتوي على خليط الخلية حتى يتم ملء الأنبوب تماما. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه خلية في الخلية الباردة فاصل تشغيل المخزن المؤقت (2 مل/108 خلايا). نقل 2 مل مزيج تعليق خلية في أنابيب 15 مل.
- تحميل 3 مجموعات من الأنابيب 15 مل في الرف فاصل الخلية بريتشيليد في 4 درجات مئوية. يحتوي على مجموعة واحدة من أنابيب الشركات المتعددة الجنسيات، والمجموعة الثانية من الأنابيب التي ستستخدم لجمع الكسر السلبية وستستخدم المجموعة الثالثة من أنابيب لجمع CD34 المنقي+ الخلايا.
- تحميل الرف إلى الجهاز فاصل الخلية وقم بتشغيل برنامج الإعداد المسبق posseld2 .
ملاحظة: يمكن استخدام أسلوب بديل يستخدم فاصل مغناطيسي يدوي لاستبدال الجهاز فاصل الخلية12 . - أنابيب الطرد المركزي مع الكسر الإيجابية في 400 x ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. نضح المادة طافية وريسوسبيند CD34 المنقي+ الخلايا في 1 مل من المصل مجاناً وسائل الإعلام.
- عد الخلايا ملطخة يوديد propidium البرتقالي/أكريديني عداد الآلي خلية باستخدام.
ملاحظة: إذا كان غير مطلوب فورا، تنقية CD34+ يمكن أن تجمد الخلايا في هذه المرحلة.
4-جيش فيتنام الشعبي "السابقين فيفو توسيع" المنقي UCB-CD34+ الخلايا
- إعداد حجم كاف من وسائل الإعلام لوحة CD34 المنقي+ الخلايا في كثافة 3.3 × 104 خلايا/مل. تكوين ثقافة وسائل الإعلام هو المصل مجاناً الثقافة المتوسطة (انظر الجدول للمواد) وتستكمل مع 10 ميليلتر/مل القلم/بكتيريا، 150 عامل الخلايا الجذعية نانوغرام/مليلتر (SCF)، 100 نانوغرام/مليلتر fms مثل تيروزين كيناز مستقبلات 3 (يجند FLT3)، 100 نانوغرام/مل ثرومبوبويتين (TPO)، و 50 نانوغرام/مل انترلوكين 3 (إيل-3).
- لوحة تنقية CD34+ الخلايا في صفيحة 12-جيدا (5 × 104 CD34+ الخلايا/1.5 مل من وسائل الإعلام/جيد) والثقافة في 37 درجة مئوية في 5%2 CO حاضنة هوميديفيد.
- تقييم نقاء CD34 المعزولة+ الخلايا وتكوين خلية بنظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل كما هو موضح أدناه في الخطوة 6.3.
- إضافة جيش فيتنام الشعبي في تركيز نهائي من 1 ملم إلى ثقافات الخلايا علاج ح 16 مع سيتوكين كوكتيل.
- ثقافة الخلايا 7 أيام إضافية عند 37 درجة مئوية في 5%2 CO حاضنة هوميديفيد.
ملاحظة: وسائل الإعلام لم يتغير خلال مدة السابقين فيفو التوسع.
5-جسم تلطيخ لتحليل التدفق الخلوي
- إعداد الحل تلطيخ جسم وصمة عار 2 × 104–6 × 104 خلايا والحل ايستب لتحديد نظام مراقبة الأصول الميدانية النابضة الاستراتيجية وتحديد مستوى الربط غير محددة. تضعف من الأجسام المضادة (1/100 APC المضادة-CD34، 1/200 فيتك المضادة-CD90) وإيسوتيبيس كل منهما إلى 50 ميليلتر من فصل المخزن المؤقت (يتم تعريف تكوين المخزن المؤقت للانفصال في الخطوة 1، 1).
ملاحظة: أداء تلطيخ واحدة من الخلايا مع كل جسم ل FMO النابضة الاستراتيجية. جسم مجموع التعويض حبة كيت (انظر الجدول للمواد) يمكن استخدامها لإعداد التعويض. - مجانسة الثقافة خلية من بيبيتينج عدة مرات. عد الخلايا وبيبيت 5 × 104 خلايا في أنبوب 1.5 مل.
- أضف 1 مل من المخزن المؤقت للفصل والطرد المركزي في 400 x ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 50 ميليلتر من الحل المصبوغة. احتضان خلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 450 ميليلتر من المخزن المؤقت للفصل والطرد المركزي في 400 x ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت للانفصال. تبقى الخلايا على الجليد لمدة 5 دقائق على الأقل حتى إجراء تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. أضف 1 ميليلتر من 7-عاد بوابة خلايا قابلة للحياة.
- تحميل نموذج خلية الملون على الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية واكتساب الخلايا في أدنى معدل التدفق.
- لكل فلوروفوري، وتحليل ايستب عناصر التحكم والخلايا الملون واحد لإعداد النابضة فيتك (CD90)، وآسيا والمحيط الهادئ (CD34)، وتلطيخ بيركب/Cy5.5 (7-الإغراق).
- بيركب/Cy5.5 السلبية الكسر وارسم APC مقابل فيتك لتحديد النسبة المئوية من CD34 قابلة للحياة من بوابة+، CD90+، و CD34+CD90+ الخلايا التي تعرف السكان هسبك/HSC في الثقافة.
6-جسم تلطيخ للتدفق الخلوي الخلية الفرز
- ريسوسبيند توسيع نطاق الخلايا من بيبيتينج عدة مرات. حساب عدد الخلايا ونقل ثقافة كاملة في أنبوب 15 مل أو 50 مل.
- ملء الأنبوب مع المخزن المؤقت لفصل البرد
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إعداد حل ايستب وصمة عار 1 × 105 خلايا وتحديد نظام مراقبة الأصول الميدانية النابضة وتلطيخ جسم حل لوصمة عار55 × 10-2 × 106 خلايا. تمييع 1/10 (آسيا والمحيط الهادئ مكافحة-CD34)، 1/20 الأجسام المضادة (فيتك-CD90) وإيسوتيبيس المقابلة إلى 500 ميليلتر من فصل المخزن المؤقت في كل حالة.
- إعداد ضوابط تعويض لون واحد باستخدام مجموعة حبة جسم مجموع تعويض طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة.
- نقل المادة طافية من الخطوة 5.2 في أنبوب جديد وإبقائه عند 37 درجة مئوية. ستتم إعادة استخدام هذه الوسائط الثقافة ثقافة فرز الخلايا.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في فصل البرد المخزن المؤقت للحصول على تركيز من 5 × 105 خلايا/مل. نقل 1 × 105 الخلايا في أنابيب 1.5 مل لتلطيخ ايستب والخلايا المتبقية التي سيتم فرز في أنابيب 1.5 مل الأخرى.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في 400 x ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الكريات الخلايا في ايستب تلطيخ بيليه من الخلايا التي سيتم فرز في جسم تلطيخ الحل والحل.
- احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إضافة 450 ميليلتر من المخزن المؤقت للفصل والطرد المركزي في 400 x ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- ريسوسبيند الكريات مع 2 مل من المخزن المؤقت للفصل البارد.
- لمنع قباقيب، تصفية العينات من خلال 40 ميكرومتر خلية مصفاة ومكان على الجليد حتى نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- إنشاء خلية فارز للفرز مع المعلمات الصحيحة.
- تشغيل عينات ايستب تعيين الجهد والكسب للأمام والجانب مبعثر وتحديد السكان fluorescence السلبية.
- تعويض لون واحد تشغيل عناصر التحكم لتعيين معاملات التعويض وتطبيق المعلمة لجمع البروتوكول.
- تشغيل من قاسمة صغيرة من العينة (Ab) (~ 50,000 الأحداث) وضع استراتيجية النابضة.
- إعداد قرارات الفرز لجمع CD34+ CD90– الخلية الكسر.
- فرز الخلايا في أنابيب جمع مغطاة بطبقة عازلة الفصل 2 مل.
- وبعد الفرز، فرز الخلايا والطرد المركزي لهم في 400 x ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في وسائط استرداد في الخطوة 5، 5 للوصول إلى تركيز نهائي من 3 × 104 خلايا/مل.
- لوحة CD34+ CD90– تنقية الخلايا في لوحات 12-جيدا مع 1.5 مل المتوسطة/البئر (5 × 104 CD34+ CD90– الخلايا/1.5 مل من وسائل الإعلام/جيد).
- تقييم النقاء بتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام 50 ميليلتر من الخلايا التي تحتوي على وسائط الإعلام.
- التعامل مع ثقافات CD34+CD90– الخلايا مع جيش فيتنام الشعبي بتركيز نهائي 1 مم.
- احتضان عند 37 درجة مئوية في 5%2 CO حاضنة هوميديفيد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
السابقين فيفو البروتوكول المذكورة هنا على زيادة عدد هسكس البدائية التي تم إنشاؤها من CD34+ الخلايا المعزولة من أوكبس (الشكل 1). فتيلة من CD34+ الخلايا ح 16 مع سيتوكين كوكتيل، تليها المعاملة مع جيش فيتنام الشعبي لاضافي 7 أيام، يؤدي إلى درجة كبيرة من التوسع HSC. بشكل ملحوظ، تجمع الخلايا الموسع هو التخصيب هسكس التي تم تعريفها بواسطة CD34 فينوتيبيكالي+CD90+ علامات. العدد الإجمالي للخلايا المنواه (الشركات عبر الوطنية) في الثقافات التي تعامل مع سيتوكين كوكتيل وحدها أعلى بكثير من عدد الخلايا التي لوحظت في الثقافات التي تعامل مع سيتوكين كوكتيل وجيش فيتنام الشعبي (الشكل 2A). وعلى الرغم من ارتفاع عدد من الشركات عبر الوطنية، العدد من هسكس في الثقافات المستقبلة سيتوكين كوكتيل وحدها لا يزال منخفضا خلال فترة التوسع الكامل مقارنة بالثقافات تعامل مع سيتوكين كوكتيل وجيش فيتنام الشعبي (الشكل 2). يتم إنشاء عدد أكبر من هسكس في الثقافات التي تعامل مع مزيج من سيتوكين كوكتيل وجيش فيتنام الشعبي (الشكل 2). على وجه الخصوص، هو التوصل إلى توسع أكبر في إعداد هسكس بعد 5-7 أيام بعد العلاج جيش فيتنام الشعبي (الشكل 2). زيادة عدد هسكس يرتبط بزيادة عاجلة في النسبة المئوية هسكس، وملحوظ خلال 24 ساعة علاج جيش فيتنام الشعبي (الشكل 2). بينما الزيادة في النسبة المئوية هسكس عالية وصيانتها خلال أول 4 أيام من السابقين فيفو ثقافة، فإنه ينخفض تدريجيا بعد 5 – 7 أيام علاج مع جيش فيتنام الشعبي (الشكل 2). ومع ذلك، هذا الانخفاض يرتبط ارتباطاً عكسيا مع زيادة في العدد المطلق هسكس.
الأهم من ذلك، الزيادة السريعة في نسبة هسكس لوحظت في جيش فيتنام الشعبي تعامل الثقافات بسبب الحصول على النمط الظاهري CD90. CD34+ الخلايا معربا عن CD90 المظهرية ماركر يبلغ تقريبا 40%-45% خلايا التي توسعت في السابقين فيفو الثقافات تعامل مع سيتوكين كوكتيل وجيش فيتنام الشعبي لمدة 4 أيام (الشكل 2،د). الحصول على النمط الظاهري CD90 أخرى أكدتها السابقين فيفو توسيع CD34 المنقاة العالية+ الخلايا أن الافتقار إلى التعبير عن علامة CD90. خلال 24 ساعة معاملة جيش فيتنام الشعبي، 75 في المائة تقريبا من السابقين فيفو توسيع نطاق الخلايا في الثقافات التي بدأت مع فرز CD34+CD90 الخلايا– إكسبريس CD90 بدلاً من 0% الخلايا في الثقافات التي تتضمن سيتوكين كوكتيل وحدها (الشكل 2E). الأهم من ذلك، يتم الاحتفاظ بالنمط الظاهري CD90 عالية خلال الأيام الأولى 4 في السابقين فيفو الثقافات تعامل مع جيش فيتنام الشعبي (الشكل 2E).
رقم 1: العرض التخطيطي للسابقين فيفو توسيع الثقافة- تنقية CD34+ الخلايا من أوكبس معبي ح 16 في السابقين فيفو الثقافة تستكمل مع مزيج من السيتوكينات المشار إليها. وتعامل الثقافات مع جيش فيتنام الشعبي (1 ملم) لمدة 7 يوما إضافيا. السابقين فيفو ثم يكون زرع الخلايا الموسعة في الفئران ميوابلاتيد مجموعة موردي المواد النووية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: معاملة جيش فيتنام الشعبي مشغلات اقتناء CD90 أدى إلى التوسع في عدد كبير من هسكس. (أ) العدد المطلق لمجموع الخلايا المنواه قابلة للتطبيق الموسع في السابقين فيفو الثقافات9. تنقية CD34+ الخلايا من أوكبس الموصوفة في المقطع 3 تعامل مع سيتوكين كوكتيل وحدها أو مزيج من سيتوكين كوكتيل وجيش فيتنام الشعبي كما هو موضح في القسم 4 تم حسابها عن طريق تلطيخ يوديد propidium البرتقالي/أكريديني (n = 16). الأرقام تدل يوما من العلاج مع جيش فيتنام الشعبي، بينما يدل PC CD34 جاهل الأولية+ الخلايا المعزولة من أوكبس. (ب، ج) العدد المطلق والنسبة المئوية ل CD34+CD90+ الخلايا وسعت طوال 7 أيام في السابقين فيفو الثقافات تعامل مع الكوكتيل سيتوكين وحدها أو مزيج من سيتوكين كوكتيل وجيش فيتنام الشعبي (ن = 21). النسبة المئوية ل CD34+CD90+ هو تحديد الخلايا بتحليل التدفق الخلوي للخلايا الملون كما هو موضح في القسم 4. (د) تحليل المظهرية CD34 فرز الخلايا+ من أوكبس (الخطوة 5.3) توسعت في السابقين فيفو الثقافات تعامل كما هو مبين لمدة 4 أيام. اللوحة اليسرى يشير إلى أن استراتيجية النابضة باستخدام التلوين ايستب حين لوحات أخرى تشير إلى توسيع نطاق الخلايا الملون في الثقافات التي تحتوي على كوكتيل سيتوكين وحدها أو مزيجاً من سيتوكين كوكتيل مع جيش فيتنام الشعبي. الأرقام تدل على النسبة المئوية ل CD34–CD90+ الخلايا CD34+CD90– الخلايا و CD34+CD90+ الخلايا. (ﻫ) النسبة المئوية من CD34+CD90+ فرز الخلايا التي توسعت في الثقافات التي بدأت مع CD34+CD90– الخلايا من أوبكس وتعامل مع الكوكتيل سيتوكين وحدها أو مزيج من سيتوكين كوكتيل وجيش فيتنام الشعبي الأيام المشار إليها. تتحدد النسبة المئوية بتحليل التدفق الخلوي (n = 4). N: عدد البيولوجية وإنشاء نسخ متماثلة. أشرطة الخطأ مع وزارة شؤون المرأة؛ p ≤ 0.0001 حسبما يقرره نماذج ذات الحدين السلبي لتم تعديل A و B، نماذج بيتا د و ANOVA للفريق هاء لوحات أ – ج 2-الطريق ه من بابا et al.9الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهنا، نقدم بروتوكولا للتوسع السريع لدرجة كبيرة عدد هسكس البشرية الفنية من أوكبس. تشير الدراسات التجريبية والحركية باستخدام هذا البروتوكول السابقين فيفو الخلايا الموسع على الفور الحصول على والاحتفاظ بالتعبير عن عدة علامات HSC المظهرية بما في ذلك CD90، فضلا عن الخصائص الأيضية HSC البدائية9.
وهذا حكم فيفو توسيع بروتوكول بسيط نسبيا ويمكن الاعتماد عليها. تنقية CD34+ الخلايا مع الجهاز فاصل الخلية (انظر الجدول للمواد) استنساخه للغاية وسريعة، مما يسمح لانتعاش سريع للخلايا المعزولة. هذا الأسلوب يؤدي إلى ارتفاع عائد من CD34 المنقي+ الخلايا (> 90%) بدلاً من الانفصال إيمونوماجنيتيك اليدوي. وعلاوة على ذلك، لا يتطلب هذا السابقين فيفو توسيع بروتوكول الأجهزة الخاصة والمعقدة أو نظم دفعة تغذية الثقافة التي تحتاج إلى إمدادات مستمرة من كميات كبيرة من وسائط جديدة تستكمل مع السيتوكينات3،13. وبناء على ذلك، هذا الأسلوب يحد من التكاليف. الأهم من ذلك، يتيح هذا البروتوكول لتوسيع نطاق مجمع HSC في فترة زمنية قصيرة، وعامل يحد رئيسية للتلوث بالتردد.
ينبغي النظر في عدة نقاط لتحقيق هسكس البدائية من CD34+ الخلايا باستخدام هذا البروتوكول. CD34+ الخلايا الموسع لمدة 4 أيام في الثقافات تعامل مع سيتوكين كوكتيل وجيش فيتنام الشعبي تؤدي إلى توليد مجموعة من بدائية هسكس طويلة الأجل. هذه هسكس وتتسم بمستويات عالية من التعبير CD34، CD90، و CD49f، بل أيضا بملف تعريف الأيض بدائية جداً، الذي يعتمد أساسا على تحلل9. أثناء حضانة أطول مع جيش فيتنام الشعبي لمدة 7 أيام، الثقافات الموسعة ولكن غير متجانسة أكثر وتحتوي على عدد أكبر من كلا طويلة الأجل وقصيرة الأجل، وكذلك التمييز بين الخلايا بدلاً من الخلايا الموسع لمدة 4 أيام. هذه النتيجة أساسا بسبب استنفاد جيش فيتنام الشعبي في الثقافة، وزيادة عدد أقسام الخلية9. وهكذا، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحقيق التوسع في اثنين من مجمعات مختلفة من الخلايا: الخلايا الموسع 4 أيام وسبعة أيام. يمكن استخدام المنتج 7 أيام التوسع متمكنة HSC زرع فيها مطلوب انجرافتمينت مولتيلينيجي كذلك المطرد السريع أكثر. قد يكون من الأنسب لاستراتيجيات التعديل الوراثي أن الهدف الطويل الأجل إعادة تعمير الخلايا بروتوكول توسيع 4 أيام. كما أنه من المحتمل أن هذا الجمع بين جيش فيتنام الشعبي وسيتوكين الكوكتيل يمكن توسيع مجمع هسكس من CD34+ الخلايا في نفس الدرجة أو أعلى عند استخدام وسائط بخلاف وسائل الإعلام (انظر الجدول للمواد) المستخدمة في هذا البروتوكول.
الإجراءات الحالية لتحرير الجينات المرتبطة بخسارة كبيرة من هسكس التي تحد من تطبيقها السريري. العدد الكبير من هسكس البدائية التي تحققت في غضون 2-4 يوما معاملة جيش فيتنام الشعبي في السابقين فيفو الثقافات لديه القدرة على التغلب على هذه الخسارة في أرقام HSC. وهكذا، قد تكون مفيدة لتحسين الجينات القائمة تحرير بروتوكولات هذا البروتوكول وتمكين تصحيح الطفرات الوراثية في العلاج القائم على زرع HSC لبيتا ثلاسيميا ومرض الخلية المنجلية. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن تطبيقها للحفاظ على إعداد كبيرة من هسكس خلال التلاعب الجيني للدراسات ركزت على توضيح وظائف الجينات في هسكس وفي هيماتوبويسيس.
وفي الختام، يمكن استخدامها للسابقين فيفو توسيع هسكس سواء البشرية أو مورين الأسلوب الموصوفة هنا ويمكن تكييفها لمحددة التطبيقات السريرية، وكذلك فيما يتعلق بطائفة واسعة من التحقيقات في البحوث الأساسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها نيستيم منح C030136 للصحة الإنجابية أننا نود أن أشكر جابلونسكي Bartek للتغذية المرتدة ومراجعة المخطوطة
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expansion Media | Sigma-Aldrich | Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML | |
| AO/PI (acridine orange/propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. | Nexcelom | CS2-0106-25mL | |
| APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 | BD BIOSCIENCE | 555824 | |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 | BD BIOSCIENCE | 555751 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| BD Falcon 15 mL Tube | BD Biosciences | 352097 | |
| BD Falcon 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352063 | |
| BD Falcon 50 mL Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Bovine serum albumine solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-046-703 | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cell analyzer and sorter | BD Biosciences | FACS Aria II | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter | |
| Cell separator device | autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec | ||
| Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-PD100-002 | |
| Density gradient media | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 | BIOLEGEND | 328108 | |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | BIOLEGEND | 400109 | |
| Inverted microscope | |||
| PBS | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 308FKN | |
| Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) | R&D Systems | 203-IL | |
| Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC | |
| Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) | R&D Systems | 288-TP | |
| Total Antibody Compensation Bead Kit | thermofisher | A10497 | |
| Umbilical Cord-blood | Placental Blood Program at the New York Blood Center | http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/ | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | P4543 |
References
- Broxmeyer, H. E. Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation. Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
- Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D'Souza, S., Hoffman, R. Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells. Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).
- Wagner, J. E. Jr, et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).
- Peled, T., et al. Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment. Experimental Hematology. 40 (4), 342-355.e1 (2012).
- Nikiforow, S., Ritz, J. Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants? Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).
- Mehta, R. S., et al. Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials. Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).
- Papa, L., et al. Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation. Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. , In press (2019).
- Genovese, P., et al. Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells. Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).
- Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
- Fares, I., et al. EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells. Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).
