Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ex Vivo ekspansion af hæmatopoietisk stamceller fra menneskelige navlestrengen blod-afledte CD34+ celler ved hjælp af valproinsyre

Published: April 11, 2019 doi: 10.3791/59532
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Hematology/Oncology, Tisch Cancer Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Her, vi beskrive ex vivo ekspansion af hæmatopoietisk stamceller fra CD34+ celler, der stammer fra navlestrengsblod behandlet med en kombination af en cytokin cocktail og VPA. Denne metode fører til en betydelig grad af ex vivo ekspansion af primitive HSCs for enten klinisk eller laboratorium applikationer.

Abstract

Navlestrengen blod (UCB) enheder giver en alternativ kilde til menneskelige hæmatopoietisk stamceller (HSCs) for patienter, der kræver allogen knoglemarvstransplantation. Mens UCB har flere unikke fordele, begrænser den begrænsede numre af HSCs inden for hver UCB enhed deres brug i regenerativ medicin og HSC transplantation hos voksne. Effektiv udvidelse af funktionelle menneskelige HSCs kan opnås ved ex vivo dyrkning af CD34+ celler isoleret fra UCBs og behandles med en deacetylase-hæmmer, valproat (VPA). Protokollen detaljeret her beskriver kultur betingelser og metode til hurtigt isolere CD34+ celler og udvide i høj grad en pulje af primitive HSCs. De udvidede HSCs er i stand til at etablere både kortsigtede og langsigtede engraftment og er i stand til at give anledning til alle typer af differentierede hæmatopoietisk celler. Denne metode også holder potentiale for klinisk anvendelse på autologe HSC genterapi og giver en attraktiv tilgang for at overvinde tabet af funktionelle HSCs forbundet med gen redigering.

Introduction

Ex vivo ekspansion af hæmatopoietisk stamceller (HSCs) fra navlestrengsblod (UCB) enheder besidder store løfte til HSC applikationer i regenerativ medicin og transplantation terapi. Transplantation med UCB enheder har flere unikke fordele som let samling, høj tilgængelighed, minimal risiko for infektion, lav risiko for sygdom tilbagefald, og lav frekvens af graft versus host sygdom (GVHD). Men de større ulemper ved deres anvendelse i kliniske indstillinger er det begrænsede antal HSCs stede i hver UCB enhed1. Det utilstrækkelige antal HSCs resultater i forsinket engraftment og hæmatopoietisk opsving, risikoen for graft afvisning og afvigende immun rekonstituering.

I øjeblikket, er forskellige metoder og strategier blevet udviklet for at ex vivo udvide det begrænsede antal HSCs fra UCBs. Kombinationer af forskellige cytokin cocktails med små molekyler eller forbindelser i ex vivo kulturer resulterer i forskellige grader af ekspansion i HSC numre2,3,4,5,6, 7,8. Vigtigere, ex vivo kultur fremkalde betingelser stress, fører til hurtige celleproliferation, øget metabolisk aktivitet og tab af de primitive kendetegn, der definerer primære HSCs. Derfor, udvikle protokoller, der fører til udvidelse af et stort antal funktionel HSCs med egenskaber, der ligner primære primitive HSCs er nødvendige.

Serumfrit kulturer af CD34+ celler isoleret fra UCBs og behandling med valproat syre (VPA) resultere i udvidelse af et stort antal primitive HSCs4,9,10. HSC ekspansion er ikke udelukkende på grund af spredningen af de eksisterende HSCs, afledt af UCBs. Denne udvidelse er derimod på grund af erhvervelse af en primitiv fænotype kombineret med et begrænset antal celledelinger og spredning9. Inden for de første 24-48 h inkubation med en kombination af cytokiner og VPA, CD34+ celler erhverve en transkriptom og fænotypiske profil, der karakteriserer langsigtede HSCs. Den betydelige stigning i procentdelen af HSCs er ledsaget af en hurtig stigning i antallet af HSCs (63 fold stigning inden for 24 timer af VPA behandling)9. Navnlig udvider VPA-ex vivo ekspansionsstrategi HSCs med lav metaboliske aktivitet, hvilket yderligere understreger deres primitive egenskaber.

Metoden beskrevet her giver betingelser og behandlinger, der fører til en betydelig grad af ex vivo ekspansion af primitive HSCs for enten klinisk eller laboratorium applikationer. Dette ex vivo ekspansionsstrategi bruger en cytokin cocktail kombineret med VPA behandling. VPA er en FDA godkendt lægemiddel til behandling af bipolar lidelser og andre neurologiske sygdomme. HSC ekspansion med VPA er lynhurtig og sker inden for 7 dage, minimere både tidspunktet for manipulation og risikoen for forurening. Vigtigst, denne protokol giver mulighed for erhvervelse af langsigtede HSC fænotypiske markører som CD90 og CD49f inden for 24-48 timer efter behandling med VPA9. Udvidet HSC grafts lavet med denne protokol har kapacitet til at regenerere hæmatopoietisk systemet, da de kan differentiere til alle hæmatopoietisk celle lineages og etablere langsigtede engraftment efter transplantation til myeloablated NSG mus modeller4. Desuden, denne protokol er yderst reproducerbare og giver mulighed for effektiv og hurtig isolation af levedygtige CD34+ celler fra UCBs, som er kritiske for industrialisering af denne procedure.

VPA ex vivo ekspansion protokollen har også potentiale til at overvinde betydelige tab af HSCs, som opstår under gen redigering11. Gen redigering kræver udsættelse for cytokiner, der er nødvendige for cykling celler og aktivering af DNA-reparations-mekanismer. På grund af hurtig virkningerne af VPA behandling, kunne denne metode være gavnlige for generation af et højere antal genetisk modificerede celler inden for en periode af tid, der er relevante for øjeblikket udnyttet gen ændring protokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

HSC ex vivo ekspansion protokol følger retningslinjerne i den videnskabsetisk komité på Mount Sinai School of Medicine.

1. buffer og medier forberedelse

  1. Forberede adskillelsen buffer 24 timer før isolation af CD34+ celler fra UBCs ved at tilføje 2 mL 0,5 M ethylen diamin Tetra-eddikesyre (EDTA) og 33 mL på 7,5% bovint serumalbumin (BSA) til 465 mL bufferet saltvand (1 x PBS). Bland forsigtigt og opretholde buffer natten over ved 4 ° C.
  2. Varm medier ved stuetemperatur på dagen for rensning.

2. isolering af mononukleære celler (multinationale selskaber) fra UCB enhed

  1. Dispensere hele UCB enheden i en 75 cm2 kolbe. Fortyndes og forsigtigt blandes UCB med et lige saa stort volumen af PBS ved stuetemperatur.
  2. Bestem antallet af rør, der er nødvendige for at behandle hele UCB enheden, (en 50 mL konisk rør kan bruges til at behandle 35 mL fortyndet UCB). Tilsættes 15 mL tæthed gradient media (Se Tabel af materialer) til hver tube og se bort fra den fortyndede UCB på toppen tæthed gradient medierne skaber to lag.
    Bemærk: Undvære den fortyndede UCB meget langsomt mens du holder røret i en 45° vinkel at forebygge sammenblanding af tæthed gradient media lag med UCB.
  3. Der centrifugeres ved 400 x g for 30 min til en lav acceleration og deceleration. Efter centrifugering Find multinationale selskaber i det hvide lag (buffy coat) mellem plasma og tæthed gradient media lag.
  4. Langsomt Aspirér 2/3 af plasmaet uden at forstyrre buffy coat lag. Omhyggeligt overføre buffy coat lag ind i en ny 50 mL rør. Indsamle alle multinationale selskaber fra samme UCB enhed i en 50 mL tube indtil nå 25 mL. Brug en ny tube, hvis indsamlet Middelhavstredjelandene, overstiger 25 mL.
  5. Tilsættes 25 mL koldt PBS ind i røret, der indeholder 25 mL af multinationale selskaber og bland godt. Der centrifugeres ved 400 x g i 10 min. ved 4 ° C.
    Bemærk: Kolde PBS er vigtigt at forhindre udjævningen af antistoffer på celleoverfladen og reducere ikke-specifik mærkning.
  6. Omhyggeligt Aspirér supernatanten og forsigtigt genopslæmmes celle pellet i 50 mL koldt PBS.
  7. Fjerne 20 μL cellesuspension til optælling. Grev celle nummer farves med acridin orange/propidium Iodid farvning ved hjælp af en automatiseret celle counter. Beregn det samlede antal multinationale selskaber.
    Bemærk: Celletal kan også udføres af metoden trypan blå udstødelse ved hjælp af en hemocytometer.
  8. Der centrifugeres ved 400 x g i 15 min. ved 4 ° C.
    Bemærk: Hvis ikke krævede straks, kan multinationale selskaber indefryses på dette stadium.

3. isolering af CD34+ celler fra UCBs

  1. Forberede CD34+ antistof kombineret med magnetiske perler løsning til isolering af CD34+ celler fra Middelhavspartnerlandene. Mix 300 µL af adskillelse buffer med 100 µL af menneskelige FcR humant IgG (blokerende reagens) og 100 µL af CD34 magnetiske perler til isolation af CD34 + celler fra hver 108 Middelhavspartnerlandene. Til isolering af et højere antal CD34+ celler fra (> 108) Middelhavstredjelandene, skalere op reagenser i overensstemmelse hermed.
  2. Omhyggeligt Aspirér supernatanten fra røret centrifugeres ved trin 2.8. Resuspenderes i opløsningen CD34 magnetiske perler forberedt i trin 3.1 (bruge 500 µL opløsning pr. 108 celler).
  3. Bland forsigtigt og inkuberes ved 4 ° C i 30 min.
    Bemærk: Forberede celle separator enheden (Se Tabel af materialer) under inkubationstiden. Erstatte storage-løsning med bufferen, der arbejder som angivet af fabrikantens anvisninger og køre en vask programmet efterfulgt af et føres program.
  4. Tilføje kolde celle separator kører buffer til glasset indeholder celle blandingen indtil røret er helt fyldt. Der centrifugeres ved 400 x g i 15 min. ved 4 ° C.
  5. Opsug supernatanten og resuspenderes celle i kolde celle separator kører buffer (2 mL/108 celler). 2 mL af celle suspension blanding overføres til 15 mL rør.
  6. Læg 3 sæt af 15 mL rør i celle separator rack prechilled ved 4 ° C. Et sæt rør indeholder Middelhavstredjelandene, det andet sæt af rør vil blive brugt til at indsamle den negative brøkdel og det tredje sæt af rør vil blive brugt til at indsamle renset CD34+ celler.
  7. Indlæse rack i celle separator enhed og køre programmet posseld2 forudindstillede.
    Bemærk: En alternativ metode, der udnytter manuel magnetisk separator kan bruges til at erstatte celle separator enheden12 .
  8. Centrifugeglas med den positive brøkdel ved 400 x g i 15 min. ved 4 ° C. Opsug supernatanten og resuspend renset CD34+ celler i 1 mL serum-frie medier.
  9. Tælle celler farves med acridin orange/propidium Iodid ved hjælp af en automatiseret celle counter.
    Bemærk: Hvis det ikke kræves omgående, renset CD34+ celler kan indefryses på dette stadium.

4. VPA Ex Vivo ekspansion af renset UCB-CD34+ celler

  1. Forberede sig tilstrækkeligt volumen af medier til plade den renset CD34+ celler med en tæthed på 3,3 x 104 celler/mL. Kultur medier sammensætning er serum gratis næringssubstratet (Se Tabel af materialer) suppleret med 10 µL/mL pen/strep, 150 ng/mL stamcelle faktor (SCF), 100 ng/mL fms-lignende tyrosin kinase receptor 3 (FLT3 ligand), 100 ng/mL thrombopoietin (TPO), og 50 ng/mL interleukin 3 (IL-3).
  2. Plade renset CD34+ celler i en 12-godt plade (5 x 104 CD34+ celler / 1,5 mL af medier / godt) og kultur ved 37 ° C i en 5% CO2 befugtet inkubator.
  3. Vurdere renhedsgraden af isolerede CD34+ celler og celle sammensætning af FACS analyse som beskrevet nedenfor i trin 6.3.
  4. Tilføje VPA i en endelig koncentration på 1 mM i kulturer af celler behandles for 16 h med cytokin cocktail.
  5. Kultur cellerne for yderligere 7 dage ved 37 ° C i en 5% CO2 befugtet inkubator.
    Bemærk: Medier er uændret under varigheden af ex vivo ekspansion.

5. antistof farvning for Flow flowcytometri analyse

  1. Forberede antistoffarvning løsning på pletten 2 x 104–6 x 104 celler og isotype løsning til at bestemme FACS gating strategi og fastlægge omfanget af ikke-specifik binding. Fortynd antistoffer (1/100 APC anti-CD34, 1/200 FITC anti-CD90) og de respektive isotypes i 50 µL af adskillelse buffer (sammensætning af adskillelse buffer er defineret i trin 1.1).
    Bemærk: Udfør enkelt farvning af celler med hver antistof for en FMO gating strategi. Samlede antistof kompensation perle kit kan (Se Tabel af materialer) bruges til Kompensationsopsætning.
  2. Homogeniseres cellekultur af pipettering flere gange. Tælle celler og med pipette overfoeres 5 x 104 celler ind i en 1,5 mL rør.
  3. Der tilsættes 1 mL af adskillelse buffer, og der centrifugeres ved 400 x g i 15 min. ved stuetemperatur.
  4. Opsug supernatanten og resuspenderes i 50 µL af Farvningsopløsningen. Inkuber celler i 30 min. ved stuetemperatur.
  5. Tilføje 450 µL af adskillelse buffer, og der centrifugeres ved 400 x g i 15 min. ved stuetemperatur.
  6. Opsug supernatanten og resuspenderes i 100 µL af adskillelse buffer. Hold celler på køl i mindst 5 min. indtil udføre FACS-analyse. Tilføj 1 µL af 7-AAD til gate levedygtige celler.
  7. Indlæse farves celle prøven på FACS maskine og erhverve celler til den laveste sats, flow.
  8. For hver fluorophore, analysere isotype kontrol og enkelt farvede celler til at konfigurere gating for FITC (CD90), APC (CD34) og PerCP/Cy5.5 (7-AAD) farvning.
  9. Gate PerCP/Cy5.5 negative fraktion og plot APC vs FITC at bestemme procentdelen af levedygtige CD34+, CD90+, og CD34+CD90+ celler, der definerer HSPC/HSC befolkningen i kulturen.

6. antistof farvning for Flow flowcytometri celle sortering

  1. Resuspend udvidet cellerne af pipettering flere gange. Antal celle og overføre hele kulturen i en 15 mL eller 50 mL tube.
  2. Fylde røret med kolde adskillelse buffer
  3. Der centrifugeres ved 400 x g i 15 min. ved 4 ° C.
  4. Forberede antistoffarvning løsning at plette 5 x 105– 2 x 106 celler og isotype løsning at plette 1 x 105 cellerne og bestemme FACS gating. Fortyndet 1: 10 (APC anti-CD34), 1/20 (FITC-CD90) antistoffer og den tilsvarende isotypes til 500 µL af adskillelse buffer pr. hver tilstand.
  5. Forberede enkelt farve kompensation kontrol ved hjælp af en total antistof kompensation perle kit ifølge producentens anvisninger.
  6. Overføre supernatanten fra trin 5.2 ind i et nyt rør og holde det ved 37 ° C. Denne kultur medier vil blive genanvendt for at kultur de sorterede celler.
  7. Resuspenderes celle i kolde adskillelse buffer til at opnå en koncentration af 5 x 105 celler / mL. Overføre 1 x 105 celler i 1,5 mL rør til isotype farvning og de resterende celler, der skal sorteres i andre 1,5 mL rør.
  8. Centrifugeres rør ved 400 x g i 15 min. ved 4 ° C.
  9. Supernatanten og resuspend pellets af celler i isotype farvning løsning og pellet af celler, der skal sorteres i antistof farvning løsning.
  10. Inkuber i 30 min. ved 4 ° C.
  11. Tilføje 450 µL af adskillelse buffer, og der centrifugeres ved 400 x g i 15 min. ved 4 ° C.
  12. Resuspend pellets med 2 mL koldt adskillelse buffer.
  13. For at forhindre træsko, filtrere prøverne gennem en 40 μm celle si og sted på is indtil FACS.
  14. Set-up celle sorteringsanlæg til sortering med de korrekte parametre.
  15. Køre isotype prøver for at angive spænding og gevinst til fremad og side scatter og identificere negative fluorescens populationer.
  16. Kør enkelt farve kontrolelementer til at angive kompensation koefficienter og anvende kompenseret parameter til samling protokol.
  17. Køre en lille alikvot af eksemplet (Ab) (~ 50.000 begivenheder) at fastlægge de gating strategi.
  18. Oprette slags beslutninger til at indsamle CD34+ CD90- celle brøkdel.
  19. Slags celler i indsamling rør belagt med 2 mL adskillelse buffer.
  20. Efter sortering, tælle cellerne og centrifugeres dem ved 400 x g i 15 min. ved 4 ° C.
  21. Supernatanten og resuspenderes i medierne inddrives i trin 5.5 at nå frem til en endelig koncentration på 3 x 104 celler/mL.
  22. Plade CD34+ CD90- renset celler i 12-godt plader med 1,5 mL medium/brønd (5 x 104 CD34+ CD90- celler/1,5 mL af medier/brønd).
  23. Vurdere renheden af FACS analyse ved hjælp af 50 µL af medier indeholdende celler.
  24. Behandle kulturer af CD34+CD90- celler med VPA på 1mM endelige koncentration.
  25. Der inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2 befugtet inkubator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den ex vivo protokollen beskrevet her stiger antallet af primitive HSCs genereret fra CD34+ celler isoleret fra UCBs (figur 1). Priming af CD34+ celler til 16 h med en cocktail, cytokin efterfulgt af behandling med VPA for en ekstra 7 dage, fører til en stor grad af HSC ekspansion. Bemærkelsesværdigt, pulje af udvidet celler er stærkt beriget til HSCs, der defineres fænotype af CD34+CD90+ markører. Det samlede antal nukleeret celler (transnationale selskaber) i kulturer behandlet med cytokin cocktail alene er betydeligt højere end antallet af celler i kulturer behandlet med cytokin cocktail og VPA (figur 2A). Trods det højere antal transnationale virksomheder, antallet af HSCs i de kulturer, modtager cytokin cocktail alene forbliver lav under hele ekspansion periode i forhold til kulturer behandlet med cytokin cocktail og VPA (figur 2B). Det største antal af HSCs er genereret i kulturer behandlet med en kombination af cytokin cocktail og VPA (figur 2B). Navnlig nås den største udvidelse i antallet af HSCs efter 5-7 dage efter VPA behandling (figur 2B). Det øgede antal HSCs korrelerer med en hurtig stigning i andelen af HSCs, som er kendt inden for 24 timer af VPA behandling (figur 2 c). Mens stigningen i procentdelen af HSCs er høj og vedligeholdt i de første 4 dage af ex vivo kultur, falder det gradvist efter 5-7 dages behandling med VPA (figur 2 c). Dette fald er dog omvendt korreleret med en stigning i det absolutte antal af HSCs.

Vigtigere, skyldes den hurtige stigning i andelen af HSCs observeret i VPA behandlet kulturer erhvervelse af CD90 fænotype. CD34+ celler, der udtrykker CD90 fænotypiske markør når næsten 40%-45% af celler udvidet i ex vivo kulturer behandlet med cytokin cocktail og VPA i 4 dage (figur 2 c,D). Erhvervelse af CD90 fænotype er yderligere bekræftet af ex vivo ekspansion af den højt oprenset CD34+ celler at manglende udtryk for CD90 markør. Inden for 24 timer af VPA behandling, næsten 75% af ex vivo udvidet celler i kulturer indledt med sorterede CD34+CD90- celler express CD90 mod 0% af cellerne i kulturer, der indeholder cytokin cocktail alene (figur 2E). Vigtigere, er CD90 fænotype meget bevaret i de første 4 dage i ex vivo kulturer behandlet med VPA (figur 2E).

Figure 1
Figur 1: skematisk præsentation af ex vivo ekspansion kultur. Renset CD34+ celler fra UCBs er primet for 16 h i ex vivo kultur suppleret med en kombination af den angivne cytokiner. Kulturer er behandlet med VPA (1mM) for yderligere 7 dage. Den ex vivo udvidet cellerne kan derefter transplanteres ind myoablated NSG mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: VPA behandling udløser for erhvervelse af CD90 resulterer i udbygningen af et stort antal HSCs. (A) absolutte antal samlede levedygtige nukleeret celler udvidet i ex vivo kulturer9. Renset CD34+ celler fra UCBs beskrevet i afsnit 3 behandlet med cytokin cocktail alene eller en kombination af cytokin cocktail og VPA som beskrevet i afsnit 4 blev talt af acridin orange/propidium Iodid farvning (n = 16). Tal betegne dages behandling med VPA, hvorimod PC betegner den primære ukultiveret CD34+ celler isoleret fra UCBs. (B, C) Absolut antallet og procentdelen af CD34+CD90+ celler udvidet hele 7 dage i ex vivo kulturer behandlet med cytokin cocktail alene eller en kombination af cytokin cocktail og VPA (n = 21). Procentdel af CD34+CD90+ celler bestemmes af flow flowcytometri analyse af celler farves som beskrevet i afsnit 4. (D) fænotypiske analyser af sorterede CD34+ celler fra UCBs (trin 5.3) udvidet i ex vivo kulturer behandles som anført i 4 dage. Venstre panel angiver gating strategien ved hjælp af isotype farvning, hvorimod de andre paneler viser farvede celler udvidet i kulturer der indeholder cytokin cocktail alene eller en kombination af cytokin cocktail med VPA. Tal angiver procentdelen af CD34-CD90+ celler, CD34+CD90- celler og CD34+CD90+ celler. (E) procent af CD34+CD90+ celler i kulturer indledt med udvidet sorteret CD34+CD90- -celler fra UBCs og behandlet med cytokin cocktail alene eller en kombination af cytokin cocktail og VPA for den angivne dage. Procentdel bestemmes ved analyse af handelsstrømmen flowcytometri (n = 4). N: antal biologiske replikater. Fejllinjer med SEM; p ≤ 0,0001 som fastsat af negativ-binomial modeller for A og B, Beta modeller for D og 2-vejs ANOVA for panelet E. paneler A-C og E er blevet ændret fra Papa et al.9venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heri, præsenterer vi en protokol for at hurtigt udvide i væsentlig grad antallet af funktionelle menneskelige HSCs fra UCBs. Pilot og kinetiske undersøgelser bruger denne protokol angiver at den ex vivo udvidet celler hurtigt erhverve og bevare udtryk for flere HSC fænotypiske markører herunder CD90 samt primitive HSC metaboliske egenskaber9.

Dette ex vivo ekspansion protokol er relativt enkel og pålidelig. Rensning af CD34+ celler med celle separator enhed (Se Tabel af materialer) er yderst reproducerbar og hurtigt, giver mulighed for hurtig inddrivelse af isolerede celler. Denne metode resulterer i et højt udbytte af renset CD34+ celler (> 90%) i modsætning til manuel immunomagnetic adskillelse. Desuden, dette ex vivo ekspansion protokollen ikke kræver særlige og komplekse enheder eller fed-batch kultur-systemer, der har brug for kontinuerlige forsyninger af store mængder af friske medier suppleret med cytokiner3,13. Derfor, denne metode begrænser omkostningerne. Vigtigst, denne protokol giver mulighed for udvidelse af HSC pool inden for en kort tid, som er en central begrænsende faktor for kontaminering frekvens.

Flere punkter bør overvejes for at opnå primitive HSCs fra CD34+ celler ved hjælp af denne protokol. CD34+ celler udvidet til 4 dage i kulturer behandlet med cytokin cocktail og VPA bly generation af en pulje af primitive langsigtede HSCs. Disse HSCs er karakteriseret ved høj udtryk niveauet af CD34, CD90 og CD49f, men også af en meget primitiv metaboliske profil, som overvejende bygger på glykolyse9. Ved mere forlænget inkubering med VPA for 7 dage, udvidet kulturer men er mere heterogene og indeholder et større antal både langsigtede og kortsigtede som differentierede celler i modsætning til celler udvidet til 4 dage. Dette resultat skyldes især konsumption af VPA i kultur og øget antal celledelinger9. Således, denne protokol kan bruges til at opnå udvidelse af to forskellige puljer af celler: 4 dage og 7-dages udvidet celler. 7-dages udvidelse produkt kan bruges til allogene HSC transplantation hvor hurtig så godt som vedvarende multilineage engraftment er påkrævet. 4-dages udvidelse-protokollen kan være bedst egnet til genetisk modifikation strategier, der er rettet mod langsigtede genindsættelse celler. Det er også sandsynligt, at denne kombination af VPA og cytokin cocktail kan udvide puljen af HSCs fra CD34+ celler på samme grad eller højere, når du bruger medier i end media (Se Tabel af materialer) anvendes i denne protokol.

Aktuelle gen redigering procedurer er forbundet med et betydeligt tab af HSCs, som begrænser deres kliniske anvendelse. Det store antal primitive HSCs opnås inden for 2-4 dage af VPA behandling i ex vivo kulturer har potentiale til at overvinde dette tab i HSC numre. Således, denne protokol kan være gavnligt for at forbedre den eksisterende gene redigering protokoller og aktiverer korrektion af genetiske mutationer i HSC transplantation-baserede terapier for β-thalassæmi og seglcelleanæmi. Desuden kan det anvendes for at bevare store mængder af HSCs under gen manipulationer for undersøgelser fokuseret på udredning af genet funktioner i HSCs og bloddannelsen.

Afslutningsvis metoden beskrevet her kan bruges til ex vivo ekspansion af både menneskelige og murine HSCs og kan være skræddersyet til specifikke kliniske anvendelser samt om et bredt spektrum af undersøgelser inden for grundforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NYSTEM give C030136 til R.H. Vi vil gerne takke Bartek Jablonski for hans feedback og revision af håndskriftet

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expansion Media Sigma-Aldrich Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML
AO/PI (acridine orange/propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. Nexcelom CS2-0106-25mL
APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 BD BIOSCIENCE 555824
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 BD BIOSCIENCE 555751
autoMACS Rinsing Solution MACS Miltenyi Biotec 130-091-222
BD Falcon 15 mL Tube BD Biosciences 352097
BD Falcon 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube BD Biosciences 352063
BD Falcon 50 mL Tube BD Biosciences 352098
Bovine serum albumine solution Sigma-Aldrich A8412
CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human Miltenyi Biotec 130-046-703
Cell analyzer BD Biosciences FACS Canto II
Cell analyzer and sorter BD Biosciences FACS Aria II
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter
Cell separator device autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec
Counting Chambers Nexcelom CHT4-PD100-002
Density gradient media GE Healthcare Bio-Sciences AB 17-1440-03
Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E8008-100ML
FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 BIOLEGEND 328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody BIOLEGEND 400109
Inverted microscope
PBS Corning cellgro 21-040-CV
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein R&D Systems 308FKN
Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) R&D Systems 203-IL
Recombinant Human SCF Protein R&D Systems 255-SC
Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) R&D Systems 288-TP
Total Antibody Compensation Bead Kit thermofisher A10497
Umbilical Cord-blood Placental Blood Program at the New York Blood Center http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/
Valproic acid sodium salt Sigma-Aldrich P4543

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Broxmeyer, H. E. Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation. Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).
  2. Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
  3. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  4. Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D'Souza, S., Hoffman, R. Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells. Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).
  5. Wagner, J. E. Jr, et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).
  6. Peled, T., et al. Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment. Experimental Hematology. 40 (4), 342-355.e1 (2012).
  7. Nikiforow, S., Ritz, J. Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants? Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).
  8. Mehta, R. S., et al. Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials. Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).
  9. Papa, L., et al. Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation. Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).
  10. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. , In press (2019).
  11. Genovese, P., et al. Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells. Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).
  12. Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
  13. Fares, I., et al. EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells. Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).

Tags

Medicin spørgsmål 146 navlestrengsblod CD34+ celler ex vivo kultur VPA HSCs ex vivo ekspansion transplantation genterapi
Ex Vivo ekspansion af hæmatopoietisk stamceller fra menneskelige navlestrengen blod-afledte CD34<sup>+</sup> celler ved hjælp af valproinsyre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R.… More

Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid. J. Vis. Exp. (146), e59532, doi:10.3791/59532 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter