Summary
Aquí, describimos la ex vivo expansión de células madre hematopoyéticas de CD34+ en células de sangre de cordón umbilical trataron con una combinación de un cytokine cóctel y VPA. Este método conduce a un grado significativo de ex vivo expansión de HSCs primitivo ya sea clínica o aplicaciones de laboratorio.
Abstract
Unidades de cordón umbilical sangre (UCB) proporcionan una fuente alternativa de humanos las células madre hematopoyéticas (HSCs) para pacientes que requieren trasplante de médula ósea alogénica. Mientras que la UCB tiene varias ventajas únicas, un número limitado de HSCs dentro de cada unidad UCB limita su uso en medicina regenerativa y el trasplante de HSC en adultos. Expansión eficiente de HSCs humanas funcionales puede lograrse ex vivo cultivo de CD34+ de las células aisladas de UCBs y tratados con un inhibidor de la deacetilasa, ácido valproico (VPA). El protocolo detallado aquí describe la metodología para aislar rápidamente a CD34 y condiciones de cultivo+ células y ampliar a un alto grado un grupo de primitivos HSCs. Las HSCs ampliadas son capaces de establecer engraftment tanto a corto como a largo plazo y son capaces de dar lugar a todos los tipos de células hematopoyéticas diferenciadas. Este método también tiene potencial para el uso clínico en terapia del gene de autólogo HSC y ofrece un enfoque atractivo para superar la pérdida de HSCs funcionales asociados con la edición de genes.
Introduction
Ex vivo expansión de células madre hematopoyéticas (HSCs) de sangre de cordón umbilical unidades (UCB) es muy prometedor para aplicaciones de HSC en medicina regenerativa y terapia de trasplante. Trasplante con unidades de la UCB tiene varias ventajas únicas como colección easy, alta disponibilidad, mínimo riesgo de infección, bajo riesgo de recaída de la enfermedad y la baja frecuencia de injerto contra enfermedad del anfitrión (GVHD). Sin embargo, las principales desventajas de su uso en contextos clínicos son el limitado número de HSCs presentes dentro de cada unidad UCB1. El número insuficiente de HSCs resultados en retardada injerto y recuperación hematopoyética, riesgo de rechazo al injerto y reconstitución inmune aberrante.
En la actualidad, ha desarrollado diversos métodos y estrategias ex vivo ampliar el limitado número de HSCs de UCBs. Combinaciones de citoquinas diferentes cócteles con pequeñas moléculas o compuestos en ex vivo culturas dan como resultado diferentes grados de expansión en HSC números2,3,4,5,6, 7,8. Lo importante es ex vivo cultura condiciones inducen estrés, llevando a la proliferación celular rápida, aumento de la actividad metabólico y pérdida de las características primitivas que definen HSCs primarias. Por lo tanto, están necesario desarrollar protocolos que conducen a la expansión de un gran número de HSCs funcionales con características que asemejan HSCs primitivo primarias.
Cultivos libres de suero de CD34+ las células aisladas de UCBs y tratamiento con valproico ácido (VPA) dan como resultado la expansión de un gran número de primitivos HSCs4,9,10. La expansión de HSC no es únicamente debido a la proliferación de las HSCs existentes derivados de UCBs. En cambio, esta expansión es debido a la adquisición de un fenotipo primitivo combinado con un número limitado de divisiones celulares y proliferación9. Dentro de la inicial 24-48 h de incubación con una combinación de citocinas y VPA, CD34+ células adquieren un perfil fenotípico que caracterizan a las HSCs a largo plazo y transcriptómicos. El aumento significativo en el porcentaje de HSCs es acompañado por un aumento rápido del número de HSCs (63 veces aumento dentro de las 24 h de tratamiento de VPA)9. En particular, la estrategia de expansión de VPA-ex vivo expande HSCs con baja actividad metabólica, que resalta aún más sus características primitivas.
El método aquí descrito ofrece condiciones y tratamientos que conducen a un grado significativo de ex vivo expansión de HSCs primitivo ya sea clínica o aplicaciones de laboratorio. Este ex vivo estrategia de expansión utiliza un cóctel de cytokine combinado con el tratamiento de VPA. VPA es un fármaco aprobado por la FDA para el tratamiento de trastornos bipolares y otras enfermedades neurológicas. La expansión de HSC con VPA es rápida y ocurre dentro de 7 días, minimizando el tiempo de manipulación y el riesgo de contaminación. Lo importante, este protocolo permite la adquisición de los marcadores fenotípicos a largo plazo de HSC como CD90 y CD49f dentro de las 24-48 h después del tratamiento con VPA9. Injertos HSC ampliados con este protocolo tienen la capacidad de regenerar el sistema hematopoyético, puesto que pueden diferenciarse en todos los linajes de células hematopoyéticas y establecer a largo plazo injerto tras trasplante en los ratones del grupo de myeloablated modelos4. Por otra parte, este protocolo es altamente reproducible y permite un aislamiento eficiente y rápido de CD34 viable+ células de UCBs, que es fundamental para la industrialización de este procedimiento.
La APV ex vivo protocolo de expansión también tiene el potencial para superar la pérdida significativa de HSCs que ocurre durante la edición11del gene. Gen de edición requiere exposición a citoquinas, que son necesarios para ciclismo las células y la activación de mecanismos de reparación del ADN. Debido a la rápida de tratamiento de VPA, este método podría ser beneficioso para la generación de un mayor número de células genéticamente modificadas en un período de tiempo que es relevante para la actualidad utiliza protocolos de modificación génica.
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Protocol
El HSC ex vivo protocolo de expansión sigue las pautas del Comité de ética de investigación en el Mount Sinai School of Medicine.
1. tampón y preparación de los medios de comunicación
- Preparar el tampón de separación 24 h antes de la aislamiento de CD34+ células de UBCs añadir 2 mL de ácido 0,5 M etileno diamina Tetra-acético (EDTA) y 33 mL de 7,5% albúmina de suero bovino (BSA) con solución salina 465 mL tamponada (1 x PBS). Mezclar suavemente y mantener el buffer durante la noche a 4 ° C.
- Medios calientes a temperatura ambiente en el día de la purificación.
2. aislamiento de células mononucleares (empresas multinacionales) de la UCB unidad
- Dispensar la unidad entera de UCB en un matraz de2 75 cm. Diluir y mezclar suavemente la UCB con un volumen igual de PBS a temperatura ambiente.
- Determinar el número de tubos necesarios para el procesamiento de la unidad entera de UCB (un tubo cónico de 50 mL se puede utilizar para procesar 35 mL de UCB diluido). Añadir 15 mL de medio de gradiente de densidad (véase Tabla de materiales) a cada tubo y dispensar la UCB diluida en la parte superior de los medios de gradiente de densidad creando dos capas.
Nota: Dosificar la UCB diluido muy despacio mientras sostiene el tubo en un ángulo de 45° para evitar la mezcla de la capa de media de gradiente de densidad con la UCB. - Centrifugar a 400 x g durante 30 min a una tasa baja de aceleración y desaceleración. Después de la centrifugación, multinacionales localizan en la capa blanca (buffy coat) entre la capa de gradiente media densidad y plasma.
- Aspirar lentamente 2/3 del plasma sin alterar la capa de la capa anteada. Cuidadosamente transfiera la capa de la capa anteada en un nuevo tubo de 50 mL. Recoge todas las multinacionales de la misma unidad UCB en un tubo de 50 mL hasta 25 mL. Utilizar un tubo nuevo si el volumen de recogida multinacionales supera los 25 mL.
- Añadir 25 mL de PBS frío al tubo que contiene 25 mL de corporaciones multinacionales y mezclar bien. Centrifugar a 400 x g durante 10 min a 4 ° C.
Nota: PBS frío es importante para evitar el tapado de los anticuerpos en la superficie celular y reducir no específicos de etiquetado. - Cuidadosamente aspirar el sobrenadante y Resuspenda suavemente el sedimento celular en 50 mL de PBS frío.
- Quitar 20 μL de la suspensión celular para el recuento. Contar el número de células teñido con acridina naranja/propidio tinción utilizando un contador de células automatizado. Calcular el número total de las empresas multinacionales.
Nota: El conteo de células se puede realizar también por el método de exclusión azul de tripano usando un hemocitómetro. - Centrifugar a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.
Nota: Si no es necesario inmediatamente, se pueden congelar las empresas multinacionales en esta etapa.
3. aislamiento de CD34 de las células+ de UCBs
- Preparar el CD34+ anticuerpos junto con solución de bolas magnéticas para aislamiento de CD34 de MNCs. Mix 300 μL de tampón de separación con 100 μl de humano FcR de IgG humana (reactivo de bloqueo) y 100 μl de granos magnéticos de CD34 para aislamiento de CD34 de las células+ + las células de cada 10 empresas multinacionales de8 . Para el aislamiento de un mayor número de CD34 células+ de (> 108) multinacionales, escalar de reactivos por consiguiente.
- Cuidadosamente aspirar el sobrenadante del tubo que se centrifugó a paso 2.8. Resuspender el precipitado en la solución de granos magnéticos de CD34 preparada en el paso 3.1 (use 500 μl de la solución por 108 células).
- Mezclar suavemente e incubar a 4 ° C por 30 minutos.
Nota: Prepare el dispositivo separador de células (véase Tabla de materiales) durante el período de incubación. Reemplazar la solución de almacenamiento con el buffer de trabajo como se indica en las instrucciones del fabricante y ejecutar un programa de lavado seguido de un programa de lavado. - Añadir separador celular frío funcionamiento tampón al tubo que contiene la mezcla de células hasta que el tubo se llena completamente. Centrifugar a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en separador celular frío funcionamiento tampón (2 mL/108 células). Transferir 2 mL de la mezcla de suspensión celular en tubos de 15 mL.
- Carga 3 conjuntos de tubos de 15 mL en el rack de separador celular prechilled a 4 ° C. Un sistema de tubos contiene las empresas multinacionales, el segundo conjunto de tubos se utilizarán para recoger la fracción negativa y el tercer conjunto de tubos se utilizarán para recoger purificada CD34+ las células.
- La parrilla de carga en el dispositivo de separador celular y ejecutar el programa preestablecido de posseld2 .
Nota: Un método alternativo que utiliza el separador magnético manual puede utilizarse para reemplazar el celular de dispositivo separador12 . - Tubos de centrífuga con la fracción positiva a 400 x g durante 15 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender purificada CD34+ de las células en 1 mL de medio sin suero.
- Contar las células teñidas con acridina naranja/propidio usando un contador de células automatizado.
Nota: Si no es necesario inmediatamente, purificada CD34+ las células pueden ser congeladas en este momento.
4. VPA Ex Vivo expansión de células purificadas de UCB-CD34+
- Preparar un volumen suficiente de medios de comunicación a la placa de la purificada CD34 de las células+ en una densidad de 3.3 x 104 células/mL. La composición de medios de cultivo es medio de cultivo libre de suero (véase Tabla de materiales) suplementado con 10 μl/mL pluma/strep, factor de células madre de 150 ng/mL (SCF), 100 ng/mL fms-like tyrosine receptor de la cinasa 3 (FLT3 ligando), 100 ng/mL trombopoyetina (TPO), y 50 ng/mL interleucina 3 (IL-3).
- Placa purificada CD34+ de las células en una placa de 12 pozos (5 x 104 CD34+ células / mL 1,5 de media / bien) y cultivo a 37 ° C en una incubadora humidificada 5% CO2 .
- Evaluar la pureza de CD34 aislado+ las células y la composición de la célula de análisis FACS como se describe a continuación en el paso 6.3.
- Añadir VPA en una concentración final de 1 mM en las culturas de las células tratadas por 16 h con citocina cóctel.
- Las células de la cultura por un adicional de 7 días a 37 ° C en una incubadora humidificada 5% CO2 .
Nota: Los medios permanece inalterado durante la duración de la ex vivo de expansión.
5. anticuerpos de tinción para análisis de citometría de flujo
- Preparar solución de tinción de anticuerpo a manchar 2 x 104– 6 x 104 células y solución de isotipo para determinar FACS gating estrategia y determinar el nivel de fijación no específica. Diluir los anticuerpos (APC anti-CD34 de 1/100, 1/200 FITC anti-CD90) y los respectivos isotipos en 50 μl de buffer de separación (composición del buffer de separación se define en el paso 1.1).
Nota: Realizar solo la coloración de células con cada anticuerpo de un FMO gating estrategia. Anticuerpo total compensación grano kit (véase Tabla de materiales), se puede utilizar para la configuración de la compensación. - Homogeneizar el cultivo celular mediante pipeteo varias veces. Contar las células y pipeta 5 x 104 células en un tubo de 1,5 mL.
- Añadir 1 mL de tampón de separación y centrifugar a 400 x g durante 15 min a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 50 μl de la solución de tinción. Incube las células durante 30 min a temperatura ambiente.
- Añadir 450 μl de tampón de separación y centrifugar a 400 x g durante 15 min a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 100 μl de buffer de separación. Mantener las células en hielo durante al menos 5 minutos hasta realizar análisis FACS. Añadir 1 μl de 7-AAD para células viables de la puerta.
- Carga la muestra de células teñidas en la máquina de FACS y adquirir las células en el caudal más bajo.
- Para cada fluoróforo, analizar los controles de isotipo y las células manchadas para configurar compuerta para FITC (CD90), APC (CD34) y PerCP/Cy5.5 (7-AAD) tinción.
- Puerta PerCP/Cy5.5 negativo fracción y parcela APC vs FITC para determinar el porcentaje de CD34 viable+, CD90+y CD34+CD90+ células que define la población de la HSPC/HSC en la cultura.
6. anticuerpos de tinción para citometría de flujo celular clasificación
- Resuspender las células ampliadas mediante pipeteo varias veces. Contar el número de celular y transferir la cultura entera en un tubo de 15 mL o 50 mL.
- Llenar el tubo con tampón de separación fría
- Centrifugar a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Preparar solución de tinción de anticuerpos a la mancha de 5 x 105– 2 x 106 células e isotipo solución para tinción de 1 x 105 células y determinar FACS que bloquean. Diluir 1/10 (APC anti-CD34), 1/20 (FITC-CD90) los anticuerpos y los isotipos correspondientes en 500 μl de separación tampón por cada condición.
- Preparar los controles de compensación de color solo usando un anticuerpo total compensación grano kit según las instrucciones del fabricante.
- Transferir el sobrenadante del paso 5.2 a un tubo nuevo y mantenerla a 37 ° C. Se reutilizará este medio de cultivo para las células ordenadas de la cultura.
- Resuspender el precipitado de células en tampón de separación fría para obtener una concentración de 5 x 105 células / mL. Transferencia de 1 x 105 células en tubos de 1,5 mL para la tinción de isotipo y las células restantes que se ordenarán en otros tubos de 1,5 mL.
- Centrifugar los tubos a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet de células en la coloración de la solución y el pellet de células que se ordenará en el solución de tinción del anticuerpo isotipo.
- Incubar durante 30 min a 4 ° C.
- Añadir 450 μl de tampón de separación y centrifugar a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Resuspender el pellet con 2 mL de tampón de separación fría.
- Para evitar que se bloquee, filtrar las muestras a través de 40 μm filtro de célula y lugar en el hielo hasta el FACS.
- Clasificador de celular de instalación para la clasificación con los parámetros correctos.
- Ejecutar ejemplos de isotipo para crear tensión y ganancia para el avance y la dispersión lateral e identificar poblaciones de fluorescencia negativa.
- Controles de ejecución solo color para establecer coeficientes de compensación y aplicar compensación parámetro de protocolo de extracción.
- Ejecute una pequeña alícuota de la muestra (Ab) (~ 50.000 eventos) para establecer la estrategia bloquea.
- Establecer las decisiones de la clase para recoger la CD34+ CD90– fracción de la célula.
- Células de la especie en tubos con 2 mL de tampón de separación.
- Después de su clasificación, recuento de las células y centrifugar a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en los medios de comunicación recuperados en paso 5.5 para llegar a una concentración final de 3 x 104 células/mL.
- Placa de CD34+ CD90– purificado de células en placas de pocillos 12 con 1,5 mL de medio/Pozo (5 x 104 CD34+ CD90– células/1.5 mL de medios de comunicación/pozo).
- Evaluar la pureza análisis FACS con 50 μl de las células que contienen los medios de comunicación.
- Tratar las culturas de CD34+CD90 células– con VPA en concentración final de 1mM.
- Incubar a 37 ° C en una incubadora humidificada 5% CO2 .
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Representative Results
El ex vivo protocolo descrito aquí aumenta el número de primitivas HSCs generados a partir de CD34+ células aisladas de UCBs (figura 1). Cebado de CD34+ células por 16 h con una citoquina coctel, seguida por el tratamiento con VPA para otros 7 días, conduce a un gran grado de expansión de HSC. Notablemente, el conjunto de células mayores es altamente enriquecido de HSCs, que fenotípicamente son definidas por CD34+CD90+ marcadores. El número total de células nucleadas (ETN) en cultivos tratados con la citocina cóctel solo es significativamente mayor que el número de células observadas en cultivos tratados con el cóctel del cytokine y VPA (figura 2A). A pesar del mayor número de las empresas transnacionales, el número de HSCs en las culturas reciben el cytokine cóctel solo permanece baja durante el período de extensión entera en comparación con las culturas de tratados con el cóctel del cytokine y VPA (figura 2B). Se genera el mayor número de HSCs en cultivos tratados con una combinación de la citocina cóctel y VPA (figura 2B). En particular, la mayor expansión en el número de HSCs se alcanza después de 5 a 7 días después del tratamiento de VPA (figura 2B). El número creciente de HSCs se correlaciona con un aumento rápido en el porcentaje de HSCs, que destaca dentro de las 24 h de tratamiento de VPA (figura 2). Mientras que el aumento en el porcentaje de HSCs es alta y mantenida durante los primeros 4 días de ex vivo cultura, declina progresivamente después de 5 – 7 días del tratamiento con VPA (figura 2). Sin embargo, esta disminución se correlaciona inversamente con un aumento en el número absoluto de HSCs.
El rápido aumento en el porcentaje de HSCs observado en culturas VPA Tratado es importante, debido a la adquisición del fenotipo CD90. CD34+ las células que expresan el CD90 fenotípica marcador alcanza casi el 40%-45% de células ampliado en ex vivo las culturas tratados con el cóctel del cytokine y VPA durante 4 días (figura 2,D). La adquisición del fenotipo CD90 es más confirmada por ex vivo de expansión de la altamente purificada CD34 de las células+ que falta la expresión del marcador CD90. Dentro de las 24 h de tratamiento de VPA, casi el 75% de la ex vivo ampliado células en culturas con CD34 ordenados+CD90– las células expresan CD90 frente al 0% de las células en culturas con la citocina cóctel solo (Figura 2E). Lo importante es el fenotipo CD90 altamente se mantiene durante los primeros 4 días en ex vivo culturas tratadas con VPA (Figura 2E).
Figura 1: presentación esquemática de ex vivo cultura de expansión. Purificada CD34+ células de UCBs son preparadas por 16 h en ex vivo cultura complementada con una combinación de las citoquinas indicadas. Las culturas son tratadas con VPA (1mM) para 7 días adicionales. El ex vivo ampliadas células entonces pueden trasplantarse en ratones del grupo de myoablated. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: tratamiento de VPA desencadena la adquisición de CD90 dando por resultado la expansión de un gran número de HSCs. (A) número absoluto de células nucleadas viables total ampliado en ex vivo las culturas9. Purificada CD34 células+ de UCBs descritos en la sección 3 tratada con citocinas cóctel solo o una combinación de citocinas cóctel y VPA como se describe en la sección 4 se contaron por la coloración de propidio de naranja de acridina (n = 16). Números indican días de tratamiento con VPA, mientras que PC denota el CD34 inculto primaria+ células aisladas de UCBs. (B, C) Número absoluto y porcentaje de CD34+CD90+ ampliadas a lo largo de 7 días en ex vivo de culturas de células trataron con citocinas cóctel solo o una combinación de citocinas cóctel y VPA (n = 21). Porcentaje de CD34+CD90+ células se determina por análisis de citometría de flujo de células teñidas como se describe en la sección 4. (D) análisis fenotípico de CD34 ordenados+ células de UCBs (paso 5.3) ampliados en ex vivo culturas tratadas como se indica durante 4 días. Panel de la izquierda indica la bloquea estrategia de isotipo tinción mientras que los otros paneles indican células ampliaron en culturas que contiene citoquinas cóctel solo o una combinación de citocinas cóctel con VPA. Los números indican el porcentaje de CD34–CD90+ células de CD34,+CD90 células– y CD34+CD90+ las células. (E) porcentaje de CD34+CD90+ células en culturas con clasifican CD34+CD90– células de UBCs y tratadas con citocinas cóctel solo o una combinación de citocinas cóctel y VPA para el días indicados. Porcentaje se determina por análisis de citometría de flujo (n = 4). N: número de réplicas biológicas. Barras de error con SEM; p ≤ 0.0001 según lo determinado por los modelos binomial negativo para A y B, modelos de Beta para D y 2-way ANOVA para el panel E. paneles A, C y E han sido modificados de Papa et al.9por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Adjunto, presentamos un protocolo para ampliar rápidamente a un grado significativo el número de HSCs humanos funcionales de UCBs. Los estudios piloto y cinéticos utilizando este protocolo indican que el ex vivo ampliado las células rápidamente adquirir y conservar la expresión de varios marcadores fenotípicos de HSC como CD90 primitivo HSC características metabólicas9.
Ex vivo protocolo de expansión es relativamente simple y confiable. Purificación de CD34 células+ con el dispositivo separador de células (véase Tabla de materiales) es altamente reproducible y rápida, permitiendo una recuperación rápida de células aisladas. Este método resulta en una alta producción de purificada CD34+ las células (> 90%) a diferencia de la separación inmunomagnética manual. Por otra parte, este ex vivo protocolo de expansión no requiere dispositivos especiales y complejos o sistemas de cultivo fed-batch que necesitan suministros continuadas de grandes volúmenes de medios frescos complementados con citoquinas3,13. Por consiguiente, este método limita los costos. Lo importante, este protocolo permite la expansión de la piscina HSC en poco tiempo, que es una limitante clave para la frecuencia de la contaminación.
Varios puntos deben ser considerados para lograr primitivo HSCs de CD34+ las células usando este protocolo. CD34+ ampliadas durante 4 días en cultivos de células trataron con el cóctel del cytokine y VPA a la generación de un conjunto de primitivas HSCs a largo plazo. Las HSCs se caracterizan no sólo por los niveles de alta expresión de CD34, CD90 y CD49f, sino también por un perfil metabólico muy primitivo, que se basa predominante en glucólisis9. Durante la incubación más prolongada con VPA durante 7 días, ampliado las culturas sin embargo son más heterogéneas y contienen un número mayor de ambos a largo plazo y a corto plazo, así como distingue las células a diferencia de las células para 4 días. Este resultado es principalmente debido al agotamiento de VPA en la cultura y el aumento del número de divisiones celulares9. Así, este protocolo puede utilizarse para lograr la expansión de las dos piscinas diferentes de células: células ampliadas 4 días y 7 días. El producto de la expansión de 7 días se puede utilizar para trasplante allogeneic HSC donde engraftment del multilineage sostenido así como más rápido se requiere. El protocolo de expansión de 4 días podría ser más adecuado para las estrategias de modificación genética que las células de repoblación a largo plazo. También es probable que esta combinación de VPA y cóctel del cytokine puede ampliar la piscina de HSCs de CD34+ de las células en el mismo grado o superior cuando utilice medios distintos de los medios de comunicación (véase Tabla de materiales) utilizados en el presente Protocolo.
Procedimientos actuales de la edición del gene se asocian a una pérdida significativa de HSCs, que limitan su aplicación clínica. El gran número de primitivos HSCs alcanzado dentro de 2 a 4 días del tratamiento con VPA en ex vivo culturas tiene el potencial para superar esta pérdida en números HSC. Así, este protocolo podría ser beneficioso para mejorar el gen existente edición protocolos y permitir la corrección de mutaciones genéticas en terapias basadas en el trasplante de HSC para β-Talasemia y enfermedad de células falciformes. Además, puede aplicarse para mantener grandes números de HSCs durante las manipulaciones gen estudios enfocados en la aclaración de las funciones del gene en HSCs y en la hematopoyesis.
En conclusión, el método aquí descrito puede ser utilizado para ex vivo expansión de HSCs humanas y murinas y puede adaptarse a las específicas aplicaciones clínicas así como a un amplio espectro de investigaciones en la investigación básica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por NYSTEM conceder C030136 a der. Nos gustaría dar las gracias Bartek Jablonski para su retroalimentación y revisión del manuscrito
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expansion Media | Sigma-Aldrich | Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML | |
| AO/PI (acridine orange/propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. | Nexcelom | CS2-0106-25mL | |
| APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 | BD BIOSCIENCE | 555824 | |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 | BD BIOSCIENCE | 555751 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| BD Falcon 15 mL Tube | BD Biosciences | 352097 | |
| BD Falcon 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352063 | |
| BD Falcon 50 mL Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Bovine serum albumine solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-046-703 | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cell analyzer and sorter | BD Biosciences | FACS Aria II | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter | |
| Cell separator device | autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec | ||
| Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-PD100-002 | |
| Density gradient media | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 | BIOLEGEND | 328108 | |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | BIOLEGEND | 400109 | |
| Inverted microscope | |||
| PBS | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 308FKN | |
| Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) | R&D Systems | 203-IL | |
| Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC | |
| Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) | R&D Systems | 288-TP | |
| Total Antibody Compensation Bead Kit | thermofisher | A10497 | |
| Umbilical Cord-blood | Placental Blood Program at the New York Blood Center | http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/ | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | P4543 |
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