Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

EX Vivo insan göbek kordon kanı elde edilen CD34 hematopoetik kök hücrelerden genişlemesi+ hücreleri kullanarak Valproik asit

Published: April 11, 2019 doi: 10.3791/59532
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Hematology/Oncology, Tisch Cancer Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Burada, biz eski tarif CD34 hematopoetik kök hücrelerden genişlemesi vivo+ hücreleri göbek kordon kanı türetilmiş bir sitokin kokteyl ve VPA kombinasyonu ile tedavi. Bu yöntem eski ilkel HSCs vivo genişlemesi için de önemli bir ölçüde yol açar klinik veya laboratuvar uygulamaları.

Abstract

Göbek Kordon kanı (UCB) birimleri alternatif kaynağı insan hematopoetik kök hücre (HSCs) allojenik kemik iliği nakli gerektiren hastalar için sağlar. UCB birkaç benzersiz avantajları olsa da, HSCs sınırlı sayıda her UCB birimi içinde rejeneratif tıp kullanımları ve erişkinlerde HSC nakli sınırlar. Fonksiyonel insan HSCs verimli genişlemesi elde edilebilir tarafından vivo CD34 kültür+ hücreleri izole--dan UCBs ve bir deacetylase inhibitörü, Valproik asit (VPA) ile tedavi. CD34 hızla yalıtmak için metodoloji ve kültür koşulları burada ayrıntılı protokolünü açıklar+ hücreleri ve yüksek bir dereceye kadar ilkel HSCs bir havuz genişletin. Genişletilmiş HSCs kısa ve uzun vadeli engraftment kurma yeteneğine ve farklılaştırılmış hematopoetik hücrelerin her türlü ortaya çıkmasına edebiliyoruz. Bu yöntem Ayrıca Otolog HSC gen tedavisi için klinik uygulama potansiyel tutar ve fonksiyonel HSCs gen düzenleme ile ilişkili kaybı üstesinden gelmek için çekici bir yaklaşım sağlar.

Introduction

Ex vivo genişleme hematopoetik kök hücre (HSCs) göbek kordon kanı (UCB) birim tutar HSC uygulamalar için büyük söz rejeneratif tıp ve nakli terapisi. UCB birimleri ile ekimi kolay koleksiyonu, yüksek kullanılabilirlik, en az tehlike-in hastalık, hastalık nüks düşük risk ve düşük frekans Greft versus host hastalığı (GVHD) gibi çeşitli benzersiz avantajları vardır. Ancak, bunların kullanımı klinik ayarları'nda önemli dezavantajları HSCs içinde her UCB birim1mevcut sınırlı sayıda vardır. HSCs sonuçları gecikmeli engraftment ve hematopoetik kurtarma, riski greft reddi ve anormal bağışıklık sulandırma yetersiz sayıda.

Şu anda, çeşitli yöntemler ve stratejiler ex vivo HSCs UCBs gelen sınırlı sayıda genişletmek için geliştirilmiştir. Farklı sitokin kokteyller küçük moleküller veya ex vivo kültürler sonucu genişleme HSC numaraları2,3,4,5,6değişik derecelerde bileşikler ile kombinasyonları, 7,8. Önemlisi, ex vivo kültür koşulları hızlı hücre çoğalması, artmış metabolik aktivite ve birincil HSCs tanımlamak ilkel özellikleri kaybı için önde gelen stres, ikna etmek. Bu nedenle, fonksiyonel HSCs yakından birincil ilkel HSCs benzer özelliklere sahip çok sayıda genişlemesi yol gelişmekte olan iletişim kurallarına gerek.

Serum-Alerjik kültürleri CD34+ hücreleri UCBs izole ve Valproik asit (VPA) sonucu çok sayıda ilkel HSCs4,9,10genişlemesi ile tedavi. HSC genişleme yalnızca UCBs türetilen varolan HSCs yayılması nedeniyle değil. Bunun yerine, bu genişleme sınırlı sayıda hücre bölünmeler ve nükleer silahların yayılmasına karşı9. ile kombine bir ilkel fenotip edinimi kaynaklanmaktadır İlk 24-48 h, sitokinler ve VPA, CD34 kombinasyonu ile kuluçka içinde+ hücreleri elde bir transcriptomic ve uzun vadeli HSCs karakterize fenotipik profil. HSCs yüzdesi önemli artış HSCs (VPA tedavinin 24 h içinde 63 kat artış)9sayısındaki hızlı artış eşlik ediyor. Özellikle, VPA-ex vivo genişleme stratejisi HSCs daha fazla vurgulamaktadır ilkel özellikleri düşük metabolik aktivite ile genişler.

Koşullar ve ex vivo genişlemesi ilkel HSCs için de önemli bir ölçüde yol tedavileri burada anlatılan yöntem sağlar klinik veya laboratuvar uygulamaları. Bu ex vivo genişleme stratejisi VPA tedavi ile kombine bir sitokin kokteyl kullanır. VPA bipolar bozukluklar ve diğer nörolojik hastalıkların tedavisi için FDA onaylı bir ilaçtır. HSC genişleme VPA ile komut istemi ve zaman manipülasyon ve bulaşma riskini en aza indirerek 7 gün içinde gerçekleşir. Önemlisi, bu iletişim kuralı uzun vadeli HSC fenotipik işaretleri CD90 ve CD49f gibi 24-48 h VPA9ile tedavi aşağıdaki içinde edinimi için izin verir. Bu iletişim kuralı ile oluşturulan genişletilmiş HSC Greftler onlar tüm hematopoietik hücre soy ayırt etmek ve uzun vadeli engraftment myeloablated NSG fareler nakli takip kurmak beri hematopoetik sistem yeniden kapasitesine sahiptir modelleri4. Ayrıca, bu iletişim kuralını son derece tekrarlanabilir ve uygun CD34 verimli ve hızlı yalıtım için sağlar+ hücreleri UCBs hangi bu yordamı sanayileşme için önemlidir.

VPA ex vivo genişletme protokolü de HSCs gen11düzenleme sırasında oluşur önemli kaybı üstesinden gelmek için potansiyele sahiptir. Düzenleme Gene Bisiklete binme hücreleri ve DNA tamir mekanizmaları harekete geçirmek için gerekli olan sitokinlerin maruz gerektirir. Gen değişikliği protokolleri genetiği değiştirilmiş hücreler daha yüksek bir sayı üretimi için uygun olan bir süre içinde kullanılması için VPA tedavisinin istemi üzerine etkileri nedeniyle, bu yöntem yararlı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

HSC ex vivo genişletme protokolü Mount Sinai Tıp Fakültesi araştırma Etik Kurulu kuralları izler.

1. arabellek ve medyası hazırlama

  1. Ayrılık arabellek CD34 yalıtım önce 24 h hazırlamak+ hücreleri UBCs 2 mL 0.5 M etilen diamin Tetra Asetik asit (EDTA) ve % 7.5 33 mL ekleyerek sığır Serum Albumin (BSA) 465 arabelleğe alınmış mL serum fizyolojik (1 x PBS). Karışımı yavaşça ve arabellek gecede 4 ° C'de korumak
  2. Sıcak ortam arınma günü oda sıcaklığında.

2. izolasyon UCB biriminden mononükleer hücrelerin (çok uluslu şirketler)

  1. Bütün UCB birim bir 75 cm2 şişesi dağıtmak. Sulandırmak ve UCB PBS eşit bir birimdeki oda sıcaklığında karışımı yavaşça.
  2. Bütün UCB birim (50 mL konik tüp seyreltilmiş UCB 35 mL işlemek için kullanılan bir) işlemek için gereken tüpler sayısını belirleyin. Yoğunluk gradient medya ( Tablo malzemelerigörmek) 15 mL her tüpün ekleyin ve üst kısmında iki katman oluşturma yoğunluk gradient medya seyreltilmiş UCB dağıtmak.
    Not: Seyreltilmiş UCB çok yavaş yoğunluk gradient media tabakası ile UCB karıştırma önlemek için bir 45 ° açıyla tüp tutarken dağıtmak.
  3. 400 x g oranı düşük bir hızlanma ve yavaşlama, 30 dk, santrifüj kapasitesi. Santrifüjü sonra çok uluslu şirketler plazma ve yoğunluk gradient medya katmanı arasındaki beyaz katmanda (buffy ceket) bulun.
  4. Yavaş yavaş 2/3 plazma buffy kat tabaka bozmadan Aspire edin. Dikkatle buffy kat katman yeni bir 50 mL tüp içine aktarın. Tüm çok uluslu şirketler aynı UCB biriminden 25 mL erişene dek 50 mL tüp içine toplamak. Toplanan ÇUŞ 'un hacmi 25 mL aşarsa, yeni bir tüp kullanın.
  5. 25 mL soğuk PBS ÇUŞ 'un 25 mL içeren tüp içine ekleyin ve iyice karıştırın. 4 ° C'de 10 dakika için 400 x g , santrifüj
    Not: Soğuk PBS antikorlar hücre yüzeyinde kapatma önlemek ve non-spesifik etiketleme azaltmak önemlidir.
  6. Dikkatle süpernatant Aspire ve yavaşça hücre Pelet yeniden 50 mL soğuk PBS askıya alma.
  7. Sayım için hücre süspansiyon 20 μL kaldırın. Akridin turuncu/propidium iyodür bir otomatik hücre sayaç kullanarak boyama ile lekeli hücre saymak. Çok uluslu şirketler toplam sayısını hesaplayın.
    Not: Hücre sayısı da bir hemasitometre kullanarak trypan mavi dışlama yöntemi tarafından gerçekleştirilir.
  8. 4 ° C'de 15 dakika için 400 x g , santrifüj
    Not: Eğer hemen gerekli değil, çok uluslu şirketler bu aşamada donmuş olabilir.

3. yalıtım CD34+ hücreleri UCBs

  1. CD34 hazırlamak+ antikor birleştiğinde CD34 yalıtım için manyetik boncuklar çözüm ile+ hücreleri ayırma arabellek çok uluslu şirketler. Mix 300 µL insan FcR insan IgG (engelleme reaktif) 100 µL ve CD34 manyetik boncuklar CD34 yalıtım için 100 µL ile gelen + hücrelerden her 108 çok uluslu şirketler. Yalıtım CD34 daha yüksek bir dizi için+ hücreleri (> 108) çok uluslu şirketler, buna göre reaktifler ölçeklendirme.
  2. Dikkatli adım 2.8 centrifuged tüp süpernatant Aspire edin. Pelet (çözüm 500 µL başına 108 hücre kullanın) 3.1. adımda hazırlanan CD34 manyetik boncuklar solüsyona resuspend.
  3. Karışımı yavaşça ve 30 dk için 4 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Hücre ayırıcı cihazını hazırlayın ( Tablo malzemelerigörmek) kuluçka dönemi sırasında. Depolama çözümü ile çalışma tampon üretici yönergelerine tarafından belirtildiği şekilde değiştirin ve yıkama programı tarafından takip bir yıkama programı.
  4. Tampon tüp tamamen doldurulana kadar hücre karışımı içeren tüp çalışan soğuk hücre ayırıcı ekleyin. 4 ° C'de 15 dakika için 400 x g , santrifüj
  5. Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet arabellek (2 mL/108 hücreleri) çalışan soğuk hücre ayırıcısı olarak resuspend. Hücre süspansiyon karışımı 2 mL 15 mL tüpler içine aktarın.
  6. 3 set 15 mL tüpler 4 ° C'de prechilled hücre ayırıcı raf yüklemek Tüpler bir kümesini içeren çok uluslu şirketler, tüpler ikinci kümesi negatif kesir toplamak için kullanılacak ve üçüncü sette tüplerinin arıtılmış CD34 toplamak için kullanılan+ hücreleri.
  7. Raf hücre ayırıcı cihazın içine yük ve posseld2 hazır ayar programını çalıştırın.
    Not: El ile manyetik ayırıcı kullanır alternatif bir yöntem hücre ayırıcı cihaz12 değiştirmek için kullanılabilir.
  8. Santrifüj tüpleri ile 400 x g 4 ° C'de 15 dakika de olumlu kesir Süpernatant Aspire edin ve arıtılmış CD34 resuspend+ hücreleri 1 mL serum-Ücretsiz medya.
  9. Bir otomatik hücre sayaç akridin turuncu/propidium iyodür ile lekeli hücreleri saymak.
    Not: Eğer hemen gerekli değil, CD34 saf+ hücreleri bu aşamada donmuş.

4. VPA Ex Vivo genişleme arıtılmış UCB-CD34+ hücre

  1. Arıtılmış CD34 plaka ortamının yeterli hacim hazırlamak+ hücreleri bir yoğunluğu 3.3 x 104 hücre/mL. Kültür medya kompozisyon serum serbest kültür ortamıdır ( Tablo malzemelerigörmek) takıma 10 µL/mL kalem/strep, 150 ng/mL kök hücre faktörü (SCF), 100 ng/mL fms benzeri tirozin kinaz reseptör 3 (FLT3 ligand), 100 ng/mL thrombopoietin (TPO), ve 50 ng/mL İnterlökin 3 (IL-3).
  2. Plaka saf CD34+ hücreleri bir 12-şey tabak içinde (5 x 104 CD34+ hücreler / medya 1,5 mL / de) ve kültür bir % 5 CO2 oksijen kuluçka 37 ° C'de.
  3. İzole CD34 saflığı değerlendirmek+ hücreleri ve hücre kompozisyon FACS analizi tarafından aşağıda açıklandığı gibi adım ' 6.3.
  4. VPA 1 mM son bir konsantrasyon sitokin kokteyl ile 16 h için tedavi hücre kültürleri içine ekleyin.
  5. Bir ek 7 günlük bir % 5 CO2 oksijen kuluçka 37 ° C'de hücreler kültür.
    Not: Medya eski süresi sırasında değişmeden kalır vivo genişleme.

5. antikor Akış Sitometresi Analizi için boyama

  1. 2 x 104–6 x 104 hücreleri ve strateji çoğunluğuna FACS belirlemek için izotip çözüm leke ve non-spesifik bağlama düzeyini belirlemek için antikor boyama çözüm hazırlamak. Antikorlar (1/100 APC anti-CD34, 1/200 FITC anti-CD90) ve ilgili isotypes ayrılık arabellek 50 µL seyreltik (ayrılık arabellek bileşimi 1.1 adımda tanımlanır).
    Not: Tek her antikor içeren hücrelerin strateji çoğunluğuna FMO için boyama. gerçekleştirmek. Toplam antikor tazminat boncuk Kiti ( Tablo malzemelerigörmek) tazminat kurulum için kullanılabilir.
  2. Hücre kültürü birden çok kez pipetting homojenize. Hücreleri ve damlalıklı 5 x 104 hücreleri 1,5 mL tüp içine saymak.
  3. Ayrılık arabellek ve santrifüj 1 mL 400 x g oda sıcaklığında 15 dakika ekleyin.
  4. Süpernatant Aspire edin ve Pelet boyama çözüm 50 µL içinde resuspend. Hücreler, oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
  5. Ayrılık arabellek ve santrifüj 450 µL 400 x g oda sıcaklığında 15 dakika ekleyin.
  6. Süpernatant Aspire edin ve Pelet ayrılık arabellek 100 µL içinde resuspend. Hücreler için en az 5 dakika buzda FACS çözümlemesini kadar tutmak. Hücrelerin kapısı için 7-AAD 1 µL ekleyin.
  7. Lekeli hücre örnek FACS makine üzerinde yük ve hücreleri en düşük akış hızı elde etmek.
  8. Her fluorophore için izotip denetimleri ve tek lekeli hücreleri FITC (CD90), APC (CD34) ve PerCP/Cy5.5 (7-AAD) boyama için geçişi ayarlamak için analiz.
  9. PerCP/Cy5.5 negatif kesir ve arsa APC vs FITC uygun CD34 yüzde belirlemek için kapı+, CD90+ve CD34+CD90+ HSPC/HSC nüfus kültüründe tanımlar hücreleri.

6. antikor Akış Sitometresi sıralama hücre için boyama

  1. Genişletilmiş hücreleri birden çok kez pipetting tarafından resuspend. Hücre saymak ve bütün kültür 15 mL veya 50 mL tüp içine aktarın.
  2. Tüp soğuk ayrılık arabelleği ile doldurmak
  3. 4 ° C'de 15 dakika için 400 x g , santrifüj
  4. Antikor boyama eriyik-e doğru 5 x 105– 2 x 106 hücre leke ve izotip çözüm 1 x 105 hücreleri leke ve FACS geçişi belirlemek için hazır olun. Seyreltik 1/10 (APC anti-CD34), 1/20 (FITC-CD90) antikor ve karşılık gelen isotypes 500 µL ayrılık içine her koşul arabellek.
  5. Üreticinin talimatlarına göre toplam antikor tazminat boncuk kiti kullanarak tek renk tazminat denetim hazırlayın.
  6. Süpernatant 5.2 adımından yeni bir tüp içine aktarmak ve 37 ° C'de tutmak Bu kültür ortamı sıralanmış hücreler kültür için yeniden.
  7. Hücre Pelet soğuk ayrılık arabellekte bir konsantrasyon 5 x 105 hücreleri elde etmek için resuspend / mL. 1 x 105 hücreleri izotip boyama için 1,5 mL tüpler ve sıralanmış olacak kalan hücreleri diğer 1,5 mL tüpler içine aktarın.
  8. 400 x g 4 ° C'de 15 dakika, tüpler santrifüj kapasitesi
  9. Süpernatant atın ve granül çözüm ve Pelet çözüm boyama antikor sıralanır hücre boyama izotip hücrelerinin resuspend.
  10. 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
  11. Ayrılık arabellek ve santrifüj 450 µL 400 x g 4 ° C'de 15 dakika ekleyin
  12. Granül 2 mL soğuk ayrılık arabelleği ile resuspend.
  13. Takunya önlemek için FACS kadar örnekleri bir 40 mikron hücre süzgeç ve buz üzerinde yer filtreleyin.
  14. Set-up hücre sıralayıcısı doğru parametrelerle sıralama için.
  15. Gerilim ve kazanç için ileri ve yan dağılım ayarlamak ve negatif Floresans örneğin alınma olasılığını belirlemek için izotip örneklerini çalıştırma.
  16. Tazminat katsayıları hem çalışma tek renk denetimleri parametre koleksiyonu iletişim kuralı için telafi.
  17. Perdeleme strateji kurmak için (Ab) örnek (~ 50.000 olaylar) küçük bir aliquot çalıştırın.
  18. CD34 toplamak için sıralama kararlar ayarla+ CD90- hücre kesir.
  19. Sıralama hücrelere koleksiyonu tüpler 2 mL ayrılık arabellek ile kaplı.
  20. Sıralama sonra hücreleri anlatmak ve onları vasıl 400 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi
  21. Süpernatant atın ve adım 3 x 104 hücre/mL nihai bir konsantrasyon ulaşmak için 5.5 kurtarılan medya Pelet resuspend.
  22. Plaka CD34+ CD90- saf 12-şey pilakalar ve 1,5 mL orta/iyi hücrelerde (5 x 104 CD34+ CD90- hücreleri/1.5 mL medya/iyi).
  23. Saflık medya içeren hücre 50 µL FACS analizi tarafından değerlendirmek.
  24. CD34 kültürleri tedavi+CD90- hücreleri VPA ile 1mM son konsantrasyon.
  25. Bir % 5 CO2 oksijen kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ex vivo burada açıklanan protokol ilkel HSCs CD34 oluşturulan sayısını artırır.+ UCBs (şekil 1) izole hücreler. CD34 macun+ hücreler için 16 h ile bir sitokin kokteyl, ardından VPA ile tedavi için bir ek 7 gün, HSC genişleme büyük bir ölçüde yol açar. Dikkat çekici, havuzun genişletilmiş hücrelerin son derece phenotypically CD34 tarafından tanımlanmış olan HSCs için zenginleştirilmiştir+CD90+ işaretleri. Anlamlı sayılar hücre kültürlerinde sitokin kokteyl ve VPA (şekil 2A) ile tedavi gözlenen daha yüksek çekirdekli hücrelerde (TNCs) kokteyl sitokin ile yalnız tedavi kültürler, toplam sayısıdır. TNCs, sayı daha yüksek sayısına rağmen HSCs sitokin alma kültürlerde kokteyl yalnız sitokin kokteyl ve VPA (şekil 2B) ile tedavi kültürlere göre tüm genişleme döneminde düşük kalır. HSCs en fazla bir kokteyl sitokin kombinasyonu ve VPA (şekil 2B) ile tedavi kültürlerde oluşturulur. Özellikle, en büyük genişleme HSCs sayısında 5-7 gün sonra VPA tedavi (2B rakam) aşağıdaki ulaşılır. HSCs sayısının artmasına VPA tedavi (şekil 2C) 24 saat içinde önemli olan HSCs, yüzdesi hızlı bir artış ile ilişkilendirir. HSCs yüzdesi artış ex vivo kültür ilk 4 gün boyunca yüksek ve bakımlı olmakla birlikte, VPA (şekil 2C) ile tedavi 5-7 gün sonra giderek azalır. Ancak, bu düşüş ters HSCs mutlak sayısındaki bir artış ile ilişkilidir.

Önemlisi, CD90 fenotip edinimi nedeniyle tedavi VPA kültürlerde gözlenen HSCs yüzdesi hızlı artış gözleniyor. CD34fenotipik CD90 ifade hücreleri marker ulaşır neredeyse % 40-%45 hücre + ex vivo kültürler sitokin kokteyl ve VPA ile 4 gündür (şekil 2C,D) tedavi genişletilmiş. CD90 fenotip edinimi daha fazla+ CD90 işaretin bu eksikliği ifade hücreleri tarafından yüksek oranda saflaştırılmış CD34 ex vivo genişlemesi doğruladı. VPA tedavi, eski neredeyse % 75'i 24 saat içinde vivo hücre kültürlerinde sıralanmış CD34 ile başlatılan genişletilmiş+CD90- hücreleri aksine kültürlerin sitokin içeren hücrelerin % 0 CD90 ifade kokteyl yalnız (şekil 2E). Önemlisi, CD90 fenotip son derece ilk 4 gün içinde ex vivo kültürler VPA (şekil 2E) ile tedavi sırasında korunur.

Figure 1
Şekil 1: ex vivo genişleme kültür şematik sunumunu. Saf CD34+ UCBs hücrelerden ex vivo kültür belirtilen sitokinler bir kombinasyonu ile desteklenen 16 h için astarlanmalıdır. Kültürler VPA (1 mM) ile bir ek 7 gün süreyle tedavi edilir. Ex vivo genişletilmiş hücreleri sonra myoablated NSG fareler nakledilen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: VPA tedavi tetikler HSCs çok sayıda genişlemesi sonucu CD90 edinimi. (A)mutlak ex vivo kültürler9genişletilmiş toplam çekirdekli hücrelerin sayısı. Saf CD34+ hücreleri sitokin kokteyl ile yalnız tedavi bölümünde 3 açıklanan UCBs üzerinden veya bir sitokin kokteyl kombinasyonu ve 4 bölümde açıklandığı gibi VPA akridin turuncu/propidium iyodür boyama tarafından sayıldı (n = 16). Sayıları göstermek gün tedavi ile VPA, PC birincil kültürsüz CD34 gösterir, ancak+ UCBs izole hücreler. (B, C) Mutlak sayı ve CD34 yüzdesi+CD90+ ex vivo kültürler içinde 7 gün boyunca genişletilmiş hücreleri tedavi sitokin kokteyl tek başına veya bir sitokin kokteyl kombinasyonu ve VPA ile (n = 21). CD34 yüzdesi+CD90+ hücreleri Akış Sitometresi Analizi 4 bölümde açıklandığı gibi lekeli hücre tarafından belirlenir. (D) sıralanmış CD34 fenotipik analizi+ hücreleri ex vivo kültürler 4 gündür belirtildiği gibi tedavi genişletilmiş UCBs (Adım 5.3) üzerinden. Sol panelde ise diğer panellerin lekeli hücre kültürlerinde sitokin kokteyl tek başına ya da sitokin VPA ile kokteyl bir arada içeren genişletilmiş belirtmek izotip boyama kullanarak gating stratejisi gösterir. Numaraları belirtmek CD34 yüzdesi-CD90+ hücreleri, CD34+CD90- hücreleri ve CD34+CD90+ hücreleri. (E) CD34 yüzde+CD90+ hücreleri ile başlatılan kültürlerde genişletilmiş sıralanmış CD34+CD90- hücreleri UBCs ve sitokin kokteyl tek başına veya bir sitokin kokteyl kombinasyonu ve VPA için ile tedavi Belirtilen gün. Yüzde Akış Sitometresi Analizi ile belirlenir (n = 4). N: sayısı biyolojik çoğaltır. Hata çubukları SEM ile; p ≤ A ve B, D ve 2 yönlü ANOVA panelinin E. paneller A – C ve E için Beta modelleri baba vd.9' dan değiştirildi için negatif binom modelleri tarafından belirlenen 0,0001Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, biz hızla önemli bir dereceye UCBs fonksiyonel insan HSCs sayısını artırmak için bir protokol mevcut. Bu iletişim kuralını kullanan pilot ve Kinetik çalışmalar belirtmek ex vivo genişletilmiş hücreleri derhal elde etmek ve CD90 yanı sıra ilkel HSC metabolik özellikleri9dahil olmak üzere birkaç HSC fenotipik işaretleri ifade korumak.

Bu ex vivo genişletme protokolü nispeten basit ve güvenilir olduğunu. CD34 arıtma+ hücreleri hücre ayırıcı cihazla (bakınız Tablo reçetesi) olduğunu son derece tekrarlanabilir ve hızlı, izole hücreler hızlı kurtarma için izin. Bu yöntem arıtılmış CD34 yüksek bir verim içinde sonuç+ hücreleri (> % 90) Manuel immunomagnetic ayrılmaya karşı. Ayrıca, bu ex vivo genişletme protokolü özel ve karmaşık cihazlar ve taze medya sitokinler3,13ile desteklenen geniş hacimli sürekli sarf malzemeleri ihtiyaç beslenen-toplu kültür sistemler gerektirmez. Buna göre bu yöntem maliyetleri sınırlar. Önemlisi, bu iletişim kuralını HSC havuzun kirlenme frekans için anahtar bir sınırlayıcı faktördür bir kısa süre içinde genişlemesi için verir.

Birkaç puan CD34 gelen ilkel HSCs ulaşmak için düşünülmesi gereken+ bu iletişim kuralını kullanan hücreleri. CD34+ hücre kültürlerinde 4 gün için genişletilmiş tedavi sitokin kokteyl ve ilkel uzun vadeli HSCs bir havuz nesil VPA yol açabilir. Bu HSCs en yüksek ifade düzey CD34, CD90 ve CD49f tarafından hem de ağırlıklı olarak Glikoliz9tarihinde dayanır çok ilkel bir metabolik profili tarafından karakterize edilmektedir. 7 gün için daha uzun süreli kuluçka VPA ile sırasında genişletilmiş kültür ancak daha heterojen ve uzun vadeli her ikisi de daha fazla sayıda içerir ve kısa vadeli olarak 4 gündür genişletilmiş hücreleri karşı hücreleri ayrıştırılan. Bu sonucun çok VPA tükenme kültür ve hücre bölünmeler9sayısının artmasına kaynaklanmaktadır. Böylece, bu iletişim kuralını hücre iki farklı havuzu genişlemesi elde etmek için kullanılabilir: 4 gün ve 7 gün genişletilmiş hücreleri. 7 günlük genişleme ürün daha hızlı de sürekli multilineage engraftment gerekli olduğu allojeneik HSC ekimi için kullanılabilir. 4 günlük genişletme protokolü en uzun vadeli repopulation hücreleri hedef genetik değişiklik stratejileri için uygun olabilir. Bu da VPA ve sitokin kokteyl birleşimindeki HSCs CD34 üzerinden havuzu genişletebilirsiniz olasıdır+ hücreleri veya daha az aynı derecede bu protokol için kullanılan medyaları (bkz. Tablo reçetesi) medya dışında kullanırken.

Geçerli gen düzenleme yordamları klinik uygulama sınırı HSCs önemli bir kayıp ile ilişkilidir. İlkel HSCs ex vivo kültürler VPA tedavi 2-4 gün içinde elde çok sayıda bu kayıp HSC sayıda üstesinden gelmek için potansiyele sahiptir. Böylece, bu protokolü protokolleri düzenleme mevcut gen geliştirmek için yararlı ve HSC nakli tabanlı terapiler β-talasemi ve Orak hücre hastalığı genetik mutasyonların düzeltmeyi etkinleştir. Ayrıca, HSCs çok sayıda gen manipülasyonları aydınlatma gen fonksiyonların HSCs ve hematopoiesis odaklı çalışmalar sırasında korumak için uygulanabilir.

Sonuç olarak, burada açıklanan yöntemi insan ve fare HSCs ex vivo genişlemesi için kullanılabilir ve belirli klinik uygulamaların de geniş bir spektrum soruşturmaların temel araştırma için uygun olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser NYSTEM tarafından desteklenen C030136 R.H. için vermek Bartek Jablonski onun geribildirim ve el yazması revizyonu için teşekkür etmek istiyorum

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expansion Media Sigma-Aldrich Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML
AO/PI (acridine orange/propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. Nexcelom CS2-0106-25mL
APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 BD BIOSCIENCE 555824
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 BD BIOSCIENCE 555751
autoMACS Rinsing Solution MACS Miltenyi Biotec 130-091-222
BD Falcon 15 mL Tube BD Biosciences 352097
BD Falcon 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube BD Biosciences 352063
BD Falcon 50 mL Tube BD Biosciences 352098
Bovine serum albumine solution Sigma-Aldrich A8412
CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human Miltenyi Biotec 130-046-703
Cell analyzer BD Biosciences FACS Canto II
Cell analyzer and sorter BD Biosciences FACS Aria II
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter
Cell separator device autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec
Counting Chambers Nexcelom CHT4-PD100-002
Density gradient media GE Healthcare Bio-Sciences AB 17-1440-03
Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E8008-100ML
FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 BIOLEGEND 328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody BIOLEGEND 400109
Inverted microscope
PBS Corning cellgro 21-040-CV
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein R&D Systems 308FKN
Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) R&D Systems 203-IL
Recombinant Human SCF Protein R&D Systems 255-SC
Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) R&D Systems 288-TP
Total Antibody Compensation Bead Kit thermofisher A10497
Umbilical Cord-blood Placental Blood Program at the New York Blood Center http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/
Valproic acid sodium salt Sigma-Aldrich P4543

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Broxmeyer, H. E. Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation. Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).
  2. Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
  3. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  4. Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D'Souza, S., Hoffman, R. Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells. Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).
  5. Wagner, J. E. Jr, et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).
  6. Peled, T., et al. Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment. Experimental Hematology. 40 (4), 342-355.e1 (2012).
  7. Nikiforow, S., Ritz, J. Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants? Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).
  8. Mehta, R. S., et al. Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials. Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).
  9. Papa, L., et al. Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation. Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).
  10. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. , In press (2019).
  11. Genovese, P., et al. Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells. Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).
  12. Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
  13. Fares, I., et al. EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells. Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).

Tags

Tıp sayı: 146 göbek kordon kanı CD34+ hücreleri ex vivo kültür VPA HSCs ex vivo genişleme nakli gen tedavisi
EX Vivo insan göbek kordon kanı elde edilen CD34 hematopoetik kök hücrelerden genişlemesi<sup>+</sup> hücreleri kullanarak Valproik asit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R.… More

Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid. J. Vis. Exp. (146), e59532, doi:10.3791/59532 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter