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Medicine

Ex-Vivo Expansion von hämatopoetischen Stammzellen aus menschlichen Nabelschnur Blut abgeleitet CD34+ Zellen mit Valproinsäure

Published: April 11, 2019 doi: 10.3791/59532
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Hematology/Oncology, Tisch Cancer Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Hier beschreiben wir die Ex Vivo Expansion von hämatopoetischen Stammzellen CD34+ Zellen aus Nabelschnurblut behandelt mit einer Kombination aus einem Zytokin-cocktail und VPA. Diese Methode führt zu einem bedeutenden Grad von ex-Vivo Expansion der primitiven HSCs entweder für klinische oder Laboranwendungen.

Abstract

Nabelschnur Blut (UCB) Einheiten bieten eine alternative Quelle der humanen hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) für Patienten, die eine allogene Knochenmarktransplantation benötigen. UCB hat mehrere einzigartige Vorteile, begrenzt die begrenzte Anzahl von HSZ innerhalb jeder UCB-Einheit ihre Verwendung in der regenerativen Medizin und HSC-Transplantation bei Erwachsenen. Effizienten Ausbau der funktionalen menschlichen HSCs kann erreicht werden durch ex Vivo Kultivierung von CD34+ Zellen von UCBs isoliert und mit einer Deacetylase Inhibitor, Valproinsäure (VPA) behandelt. Das Protokoll hier detailliert beschreibt die Kulturbedingungen und Methodik schnell CD34 isolieren+ Zellen und einen Pool von primitiven HSCs in hohem Maße zu erweitern. Die erweiterte HSCs sind in der Lage sowohl kurzfristige als auch langfristige Engraftment und sind in der Lage, alle Arten von differenzierten hämatopoetischen Zellen hervorzubringen. Auch diese Methode birgt Potenzial für die klinische Anwendung in der autologen HSC-Gentherapie und bietet einen attraktiven Ansatz um den Verlust des funktionellen HSCs gen Bearbeitung zugeordnet.

Introduction

Ex-Vivo Expansion der hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut (HSCs) (UCB) Einheiten verspricht große für HSC-Anwendungen in der regenerativen Medizin und Transplantation Therapie. Transplantation mit UCB Einheiten hat mehrere einzigartige Vorteile wie einfache Sammlung, hohe Verfügbarkeit, minimales Risiko einer Infektion, geringes Risiko der Krankheit Rückfall und geringe Häufigkeit von Graft-versus-Host Erkrankung (GVHD). Die große Nachteile für ihre Verwendung in klinischen Umgebungen sind jedoch die begrenzte Anzahl von HSZ innerhalb jedes UCB Einheit1vorhanden. Die unzureichende Anzahl von HSZ führt zu verzögerter Engraftment und hämatopoetischen Erholung, Risiko von Transplantat Ablehnung und aberrante Immunrekonstitution.

Derzeit wurden verschiedene Methoden und Strategien entwickelt um die begrenzte Zahl von HSZ aus UCBs ex Vivo zu erweitern. Kombinationen von verschiedenen Zytokin Cocktails mit kleinen Molekülen oder Verbindungen in ex Vivo Kulturen führen in verschiedenen Graden der Expansion im HSC Zahlen2,3,4,5,6, 7,8. Ex-Vivo-Kultur induzieren Bedingungen vor allem Stress, führt zu schnellen Zellproliferation, erhöhte Stoffwechselaktivität und Verlust der primitive Merkmale, die primäre HSCs definieren. Daher brauchen wir entwickeln Protokolle, die zum Ausbau der zahlreichen funktionalen HSCs mit Eigenschaften führen, die primäre primitive HSCs ähneln.

Serum-freie Kulturen der CD34+ Zellen aus UCBs isoliert und mit Valproinsäure Säure (VPA) Ergebnis in den Ausbau einer großen Zahl von primitiven HSCs4,9,10behandelt. Die HSC-Erweiterung ist nicht allein durch die Verbreitung von den vorhandenen HSCs UCBs abgeleitet. Stattdessen ist diese Erweiterung durch den Erwerb eines primitiven Phänotyps, kombiniert mit einer begrenzten Anzahl von Zellteilungen und Verbreitung9. Innerhalb der ersten 24 – 48 h Inkubation mit einer Kombination von Zytokinen und VPA, CD34+ Zellen zu erwerben, ein transkriptomischen und phänotypischen Profil, die langfristige HSCs charakterisieren. Die deutliche Erhöhung des Anteils von HSZ begleitet eine schnelle Zunahme der Zahl von HSZ (63 fachen Anstieg innerhalb von 24 Stunden nach der Behandlung der VPA)9. Insbesondere wird die VPA-Ex Vivo Expansionsstrategie HSCs mit niedrigen Stoffwechselaktivität, die weitere ihrer primitiven Merkmale Höhepunkte erweitert.

Die hier beschriebene Methode bietet, Beschwerden und Behandlungen, die ein hohes Maß an ex-Vivo Expansion der primitiven HSCs entweder führen, klinische oder Laboranwendungen. Diese ex-Vivo-Expansions-Strategie nutzt einen Zytokin-Cocktail mit VPA-Behandlung kombiniert. VPA ist eine FDA zugelassene Medikament zur Behandlung von bipolaren Störungen und anderen neurologischen Erkrankungen. Die HSC-Erweiterung mit VPA ist Prompt und tritt innerhalb von 7 Tagen, die Zeit der Manipulation und das Risiko einer Kontamination zu minimieren. Wichtiger ist, können dieses Protokoll für den Erwerb von langfristigen HSC phänotypische Markierungen wie CD90 und CD49f innerhalb von 24-48 h nach der Behandlung mit VPA-9. Erweiterte HSC-Transplantate mit diesem Protokoll erstellt haben die Fähigkeit, das blutbildende System zu regenerieren, da sie alle Linien der hämatopoetischen Zellen differenzieren und etablieren langfristige Engraftment nach Transplantation in Myeloablated NSG Mäuse Modelle-4. Darüber hinaus dieses Protokoll ist sehr reproduzierbar und ermöglicht eine effiziente und schnelle Isolierung von lebensfähigen CD34+ Zellen aus UCBs, die kritisch für die Industrialisierung dieses Verfahrens ist.

Der VPA ex Vivo Expansion Protokoll hat auch das Potenzial, den erheblichen Verlust von HSZ zu überwinden, die während der Bearbeitung11gen auftritt. Gen, die Bearbeitung erfordert Belastung durch Zytokine, die zum Radfahren Zellen und Aktivierung der DNA-Reparatur-Mechanismen erforderlich sind. Durch die schnelle Wirkung der VPA Behandlung kann diese Methode vorteilhaft sein, für die Generation eine höhere Anzahl von genetisch veränderten Zellen innerhalb kurzer Zeit, die derzeit für relevant ist gen-Änderung-Protokolle verwendet.

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Protocol

Der HSC ex Vivo Expansion Protokoll folgt den Richtlinien der Ethik-Kommission Forschung am Mount Sinai School of Medicine.

1. Puffer und Medien-Vorbereitung

  1. Bereiten Sie Trennung Puffer 24 h vor der Isolierung von CD34+ Zellen von Aluminiumschrott durch Zugabe von 2 mL 0,5 M-Ethylen-Diamin-Tetra-acetic Acid (EDTA) und 33 mL 7,5 % Rinderserumalbumin (BSA), 465 mL gepufferte Kochsalzlösung (1 X PBS). Mischen Sie vorsichtig und pflegen Sie den Puffer über Nacht bei 4 ° C.
  2. Warmen Medien bei Raumtemperatur am Tag der Reinigung.

2. Isolierung von mononukleären Zellen (MNU) von UCB-Einheit

  1. UCB-Einheit in einem 75 cm2 Kolben zu verzichten. Verdünnen Sie und mischen Sie vorsichtig der UCB mit ein gleiches Volumen an PBS bei Raumtemperatur.
  2. Bestimmen Sie die Anzahl der Rohre für die Verarbeitung der gesamten UCB-Einheit (eine 50 mL konische Rohr 35 mL verdünnten UCB verarbeiten verwendet werden kann). Jedes Rohr 15 mL Dichte Gradienten Media (siehe Tabelle der Materialien) hinzu und verzichten Sie die verdünnte UCB auf der Oberseite der Dichte Gradienten Medien erstellen von zwei Layern zu.
    Hinweis: Verzichten Sie verdünnte UCB sehr langsam halten Sie das Rohr im 45° Winkel zum Mischen von die Dichte Gradienten Mittelschicht mit der UCB zu verhindern.
  3. Zentrifugieren Sie bei 400 X g für 30 min mit einer niedrigen Rate von Beschleunigung und Verzögerung. Nach Zentrifugation suchen Sie MNCs in die weiße Schicht (buffy Coat) zwischen Plasma und Dichte Gradienten Mittelschicht.
  4. Aspirieren Sie langsam 2/3 des Plasmas, ohne zu stören die buffy Coat-Schicht. Übertragen Sie sorgfältig die buffy Coat-Schicht in eine neue 50 mL Tube. Sammeln Sie alle multinationalen Unternehmen aus demselben UCB-Gruppe in ein 50 mL-Röhrchen bis hin zu 25 mL. Verwenden Sie einen neuen Schlauch, übersteigt die Menge der gesammelten MNCs 25 mL.
  5. 25 mL kaltem PBS in das Rohr mit 25 mL der multinationalen Unternehmen hinzufügen und gut verrühren. Zentrifuge bei 400 X g für 10 min bei 4 ° C.
    Hinweis: Kaltem PBS ist wichtig zur Vermeidung, Begrenzung von Antikörpern auf der Zelloberfläche und Verringerung unspezifische Kennzeichnung.
  6. Den Überstand vorsichtig Aspirieren und sanft wieder aussetzen der Zelle Pellet in 50 mL kaltem PBS.
  7. Entfernen Sie 20 μl Zellsuspension zum zählen. Zählen der Anzahl von Zellen mit Acridin Orange/Propidium Jodid Färbung mit einem automatisierten Zelle Zähler befleckt. Berechnen Sie die Gesamtzahl der multinationalen Konzerne.
    Hinweis: Die Zellzahl kann auch durch die Trypan blau Ausschluss-Methode mit einem Hemocytometer durchgeführt werden.
  8. Zentrifuge bei 400 X g für 15 min bei 4 ° C.
    Hinweis: Wenn nicht sofort benötigt, können multinationale Unternehmen zu diesem Zeitpunkt eingefroren werden.

3. Isolation der CD34+ Zellen aus UCBs

  1. Bereiten Sie die CD34+ Antikörper gekoppelt mit magnetischen Beads-Lösung für die Isolierung von CD34+ Zellen von MNCs. Mix 300 µL Puffer Trennung mit 100 µL der menschlichen FcR menschliche IgG (blocking Reagenz) und 100 µL CD34 magnetische Beads für die Isolierung von CD34 + Zellen aus jeden 108 MNCs. Für die Isolierung von einer höheren Anzahl von CD34+ von Zellen (> 108) MNCs, Reagenzien entsprechend skalieren.
  2. Aspirieren Sie sorgfältig den Überstand aus dem Röhrchen zentrifugiert bei Schritt 2,8. Aufschwemmen der Pellets in der CD34-magnetische Beads-Lösung im Schritt 3.1 (mit 500 µL Lösung pro 108 Zellen) vorbereitet.
  3. Vorsichtig mischen und bei 4 ° C für 30 min inkubieren.
    Hinweis: Bereiten Sie die Zelle Separator Gerät (siehe Tabelle der Materialien) während der Inkubationszeit. Ersetzen Sie die Storage-Lösung mit dem Puffer arbeiten gemäß den Anweisungen des Herstellers, und führen Sie ein Waschprogramm, gefolgt von einem Spülprogramm.
  4. Fügen Sie kalte Zelle Separator laufen Puffer in das Röhrchen mit der Zelle-Mischung, bis das Rohr vollständig gefüllt ist. Zentrifuge bei 400 X g für 15 min bei 4 ° C.
  5. Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zelle Pellet in kalte Zelle Separator Puffer (2 mL/108 Zellen) ausgeführt. Übertragen Sie die 2 mL der Zelle Aussetzung Mischung in 15 mL-Tuben.
  6. Laden Sie 3 Sätze von 15 mL Röhrchen in die Zelle-Separator-Rack prechilled bei 4 ° c Ein Set von Rohren enthält MNCs, wird der zweite Satz von Rohren verwendet werden, um der negative Anteil zu sammeln und die dritte Reihe von Röhren wird zur gereinigten CD34 sammeln+ Zellen.
  7. Laden Sie das Rack in der Zelle-Separator-Gerät und führen Sie das voreingestellte Programm von posseld2 .
    Hinweis: Eine alternative Methode, die manuelle Magnetabscheider nutzt lässt sich die Zelle Separator Gerät12 ersetzen.
  8. Zentrifuge Rohre mit dem positiven Bruch bei 400 X g für 15 min bei 4 ° C. Aspirieren überstand und gereinigten CD34 Aufschwemmen+ Zellen in 1 mL serumfreie Medien.
  9. Zählen der Zellen befleckt mit Acridin Orange/Propidium Jodid mit einem automatisierten Zelle Zähler.
    Hinweis: Wenn nicht sofort benötigt, gereinigt CD34+ Zellen zu diesem Zeitpunkt eingefroren werden können.

4. VPA Ex Vivo Expansion des gereinigten UCB-CD34+ Zellen

  1. Bereiten Sie ausreichendes Volumen von Medien auf die gereinigten CD34 Platte+ Zellen bei einer Dichte von 3,3 x 104 Zellen/mL. Die Nährmedien Zusammensetzung ist frei Kulturmedium Serum (siehe Tabelle der Materialien) mit 10 µL/mL Pen/Strep, 150 ng/mL Stammzell-Faktor (SCF), 100 ng/mL Fms-wie Tyrosin Kinase Rezeptor 3 (FLT3 Ligand), 100 ng/mL Thrombopoetin (TPO), ergänzt und 50 ng/mL Interleukin 3 (IL-3).
  2. Platte gereinigt CD34+ Zellen in einem 12-Well-Platte (5 x 104 CD34+ Zellen / 1,5 mL Medien / gut) und Kultur bei 37 ° C in einem 5 % CO2 befeuchteten Inkubator.
  3. Beurteilen Sie die Reinheit der isolierten CD34+ Zellen und Zelle Komposition von FACS Analyse wie unten beschrieben Schritt 6.3.
  4. Fügen Sie VPA an eine Endkonzentration von 1 mM in den Kulturen der Zellen für 16 h mit Zytokin cocktail behandelt.
  5. Kultur der Zellen für weitere 7 Tage bei 37 ° C in einem 5 % CO2 befeuchteten Inkubator.
    Hinweis: Medien bleibt unverändert während der Dauer der Ex Vivo Expansion.

5. Antikörper Färbung für Flow Cytometry Analysis

  1. Bereiten Sie Antikörper-Färbelösung zu färben, 2 x 104– 6 x 104 Zellen und Isotype Lösung für FACS Anspritzung Strategie ermitteln und bestimmen den Grad der unspezifischen Bindung. Antikörper (1/100 APC Anti-CD34, 1/200 FITC Anti-CD90) und die jeweiligen Klassen in 50 µL Trennung Puffer verdünnen (Zusammensetzung der Trennung Puffer wird im Schritt 1.1 definiert).
    Hinweis: Führen Sie einheitliche Färbung der Zellen mit jeder Antikörper für ein FMO Anspritzung Strategie. Insgesamt Antikörper Entschädigung Bead Kit kann (siehe Tabelle der Materialien) für Entschädigung Setup verwendet werden.
  2. Pipettieren mehrmals, um die Zellkultur zu homogenisieren. Zählen Sie und Pipettieren 5 x 104 Zellen in einem 1,5 mL-Tube.
  3. Fügen Sie 1 mL der Trennung Puffer und Zentrifuge bei 400 X g für 15 min bei Raumtemperatur.
  4. Den Überstand abgesaugt und das Pellet in 50 µL der Färbelösung Aufschwemmen. Inkubieren Sie Zellen für 30 min bei Raumtemperatur.
  5. Fügen Sie 450 µL Trennung Puffer und Zentrifuge bei 400 X g für 15 min bei Raumtemperatur.
  6. Aspirieren Sie überstand und Aufschwemmen Sie das Pellet in 100 µL Puffer Trennung. Bewahren Sie Zellen für mindestens 5 min auf Eis bis FACS Analyse durchführen. Fügen Sie 1 µL 7-AAD, lebensfähige Zellen Tor.
  7. Die gefärbten Zellprobe auf dem FACS-Rechner zu laden und Zellen mit den niedrigsten Volumenstrom zu erwerben.
  8. Analysieren Sie für jede Fluorophor die Isotype Kontrollen und gefärbten Einzelzellen eingerichtet FITC (CD90), APC (CD34) und PerCP/Cy5.5 (7-AAD) Färbung gating.
  9. PerCP/Cy5.5 negative Bruchteil und Plot APC Vs FITC zu bestimmen, den Prozentsatz der lebensfähigen CD34 Tor+, CD90+und CD34+CD90+ Zellen, die die HSPC/HSC-Bevölkerung in der Kultur definiert.

(6) Antikörper Färbung für Flow Cytometry Zelle sortieren

  1. Aufzuwirbeln Sie die erweiterte Zellen durch Pipettieren mehrfach. Zählen der Anzahl von Zellen und übertragen die gesamte Kultur in eine 15 mL oder 50 mL Tube.
  2. Füllen Sie den Schlauch mit kalten Trennung Puffer
  3. Zentrifuge bei 400 X g für 15 min bei 4 ° C.
  4. Bereiten Sie Antikörper-Färbelösung, 5 x 105– 2 x 106 Zellen zu beflecken und Isotype Lösung zu 1 x 105 Zellen färben und FACS gating zu bestimmen. Verdünnter 1/10 (APC Anti-CD34), 1/20 Puffer (FITC-CD90) Antikörper und die entsprechenden Klassen in 500 µL der Trennung pro jede Bedingung.
  5. Bereiten Sie die einzelne Farbe Entschädigung Steuerelemente mit einem total Antikörper Entschädigung Wulst-Kit nach Herstellerangaben.
  6. Übertragen Sie den Überstand von Schritt 5.2 zu einem neuen Schlauch und halten Sie es bei 37 ° C. Diese Nährmedien wird wiederverwendet werden, um die sortierten Zellen Kultur.
  7. Aufschwemmen der Zelle Pellet in kalten Trennung Puffer zu einer Konzentration von 5 x 105 Zellen / mL. 1 x 105 Zellen in 1,5 mL Röhrchen für Isotype Färbung und die restlichen Zellen, die sortiert werden soll in anderen 1,5 mL Röhrchen zu übertragen.
  8. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 400 X g für 15 min bei 4 ° C.
  9. Verwerfen Sie den Überstand und Aufschwemmen Sie Pellets von Zellen in Isotype Färbung Lösung und das Pellet von Zellen, die in der Färbelösung Antikörper in Ordnung gebracht werden.
  10. 30 min bei 4 ° c inkubieren
  11. Fügen Sie 450 µL Trennung Puffer und Zentrifuge bei 400 X g für 15 min bei 4 ° C.
  12. Die Pellets mit 2 mL kalte Trennung Puffer aufzuwirbeln.
  13. Zur Vermeidung von Clogs filtern Sie die Proben durch einen 40 μm Zelle Sieb und Platz auf dem Eis bis FACS.
  14. Set-up Cell Sorter für die Sortierung mit den richtigen Parametern.
  15. Ausführen von Isotype Beispielen um Spannung und Gewinn für Forward und Side Scatter und negative Fluoreszenz Populationen zu identifizieren.
  16. Ausführen einzelner Farbsteuerungen Entschädigung Koeffizienten festlegen und anwenden kompensiert Parameter Sammlung Protokolls.
  17. Führen Sie eine kleine aliquoten (Ab) Probe (~ 50.000 Veranstaltungen), gating Strategie festzulegen.
  18. Richten Sie Art Entscheidungen der CD34 sammeln+ CD90– Zelle Bruchteil.
  19. Art Zellen in Röhrchen mit 2 mL Trennung Puffer beschichtet.
  20. Erzählen Sie nach der Sortierung die Zellen und Zentrifugieren sie 400 X g für 15 min bei 4 ° C.
  21. Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Pellets in den Medien erholte sich im Schritt 5.5, eine Endkonzentration von 3 x 104 Zellen/mL zu erreichen.
  22. CD34-Platte+ CD90– Zellen in 12-Well-Platten mit 1,5 mL Medium/gut gereinigt (5 x 104 CD34+ CD90– Zellen/1,5 mL von Medien/weit).
  23. Die Reinheit von FACS Analyse mit 50 µL Medien enthaltenden Zellen zu beurteilen.
  24. Behandeln Sie die Kulturen der CD34+CD90– Zellen mit VPA bei 1mM Endkonzentration.
  25. Inkubation bei 37 ° C in einem 5 % CO2 befeuchteten Inkubator.

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Representative Results

Der ex-Vivo Protokoll hier beschriebenen erhöht die Anzahl der primitiven HSCs generiert aus CD34+ Zellen isoliert von UCBs (Abbildung 1). Grundierung der CD34+ Zellen für 16 h mit einem Zytokin-cocktail, gefolgt von der Behandlung mit VPA für weitere 7 Tage, zu einem großen Teil der HSC Expansion führt. Bemerkenswert ist, der Pool der erweiterten Zellen hochangereichertes für HSCs, die phänotypisch durch CD34 definiert sind+CD90+ Marker. Die Gesamtzahl der kernhaltigen Zellen (TNCs) in Kulturen mit den Zytokin-cocktail allein behandelt ist deutlich höher als die Zahl der Zellen beobachtet in Kulturen mit den Zytokin-cocktail und VPA (Abbildung 2A) behandelt. Trotz der höheren Zahl der TNCs, die Anzahl von HSZ in den Kulturen erhalten die Cytokine Cocktail allein bleibt niedrig, während der gesamten Expansionsphase im Vergleich zu Kulturen mit den Zytokin-cocktail und VPA (Abb. 2 b) behandelt. Die größte Anzahl von HSZ entsteht in Kulturen mit einer Kombination aus den Zytokin-cocktail und VPA (Abb. 2 b) behandelt. Insbesondere ist die größte Ausdehnung in den Zahlen von HSZ nach 5 – 7 Tage nach der Behandlung der VPA (Abbildung 2 b) erreicht. Die gestiegene Zahl der HSCs korreliert mit eine schnelle Erhöhung des Anteils von HSZ, die zeichnet sich innerhalb von 24 h VPA Behandlung (Abbildung 2). Während die Erhöhung des Anteils von HSZ hoch und gepflegt in den ersten 4 Tagen von ex-Vivo-Kultur ist, lehnt es schrittweise nach 5 – 7 Tagen Behandlung mit VPA (Abbildung 2). Dieser Rückgang ist jedoch umgekehrt mit einem Anstieg der absoluten Anzahl der HSCs korreliert.

Wichtig ist, ist die rasche Zunahme des Anteils von HSZ in VPA behandelt Kulturen beobachtet durch den Erwerb von CD90 Phänotyp. CD34+ Zellen, die mit dem Ausdruck der phänotypischen CD90 Marker erreicht fast 40 – 45 % der Zellen erweitert ex Vivo Kulturen mit den Zytokin-cocktail und VPA für 4 Tage (Abbildung 2,D) behandelt. Der Erwerb des Phänotyps CD90 ist weiter bestätigt durch ex-Vivo Expansion der hochgereinigte CD34+ Zellen diesen Mangel Ausdruck der CD90 Markierung. Innerhalb von 24 h VPA Behandlung, fast 75 % der Ex Vivo erweitert Zellen in Kulturen mit sortierten CD34 initiiert+CD90– Zellen express CD90 gegenüber 0 % der Zellen in Kulturen mit der Zytokin Cocktail allein (Abb. 2E). Wichtig ist, bleibt der CD90 Phänotyp hoch während der ersten 4 Tage in ex Vivo Kulturen mit VPA (Abb. 2E) behandelt.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des ex-Vivo Expansion Kultur. CD34 gereinigt+ Zellen aus UCBs sind grundiert für 16 h in ex-Vivo-Kultur, ergänzt mit einer Kombination aus der angegebenen Zytokine. Kulturen werden mit VPA (1 mM) für weitere 7 Tage behandelt. Der ex-Vivo erweiterte Zellen können dann in Myoablated NSG Mäuse transplantiert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: VPA Behandlung löst den Erwerb von CD90, was die Erweiterung einer großen Anzahl von HSZ. (A) Gesamtzahl der insgesamt vitaler kernhaltigen Zellen ex Vivo Kulturen9erweitert. CD34 gereinigt+ Zellen von UCBs beschrieben in Abschnitt 3 behandelt mit Zytokin cocktail allein oder eine Kombination von Zytokin-cocktail und VPA wie in Abschnitt 4 beschrieben von Acridin Orange/Propidium Jodid Färbung gezählt wurden (n = 16). Zahlen bezeichnen Tagen Behandlung mit VPA, während PC die primäre unkultiviert CD34 bezeichnet+ Zellen isoliert von UCBs. (B, C) Absolute Anzahl und Prozentsatz der CD34+CD90+ Zellen während 7 Tagen in ex Vivo Kulturen erweitert mit Zytokin-Cocktail allein oder eine Kombination von Zytokin-cocktail und VPA behandelt (n = 21). Prozentsatz der CD34+CD90+ Zellen richtet sich nach Flow Cytometry Analyse von Zellen gefärbt, wie in Abschnitt 4 beschrieben. (D) phänotypische Analyse der sortierten CD34+ Zellen aus UCBs (Schritt 5.3) erweitert ex Vivo Kulturen behandelt wie für 4 Tage angegeben. Linken Fenster zeigt die gating-Strategie mit Isotype Färbung, während die anderen Platten zeigen gefärbte Zellen in Kulturen mit Zytokin-Cocktail allein oder eine Kombination von Zytokin-cocktail mit VPA erweitert. Zahlen geben den Anteil der CD34–CD90+ Zellen CD34+CD90– Zellen und CD34+CD90+ Zellen. (E) Anteil der CD34+CD90+ Zellen in Kulturen mit initiiert erweitert sortiert CD34+CD90– Zellen von Aluminiumschrott und behandelt mit Zytokin-Cocktail allein oder eine Kombination von Zytokin-cocktail und VPA für die angegebenen Tagen. Prozentsatz wird bestimmt durch Flow-Zytometrie-Analyse (n = 4). N: Anzahl der biologischen repliziert. Fehlerbalken mit SEM; p ≤ 0,0001 Negative binomiale Modelle bestimmt, für A und B, Beta-Modelle für D und 2-Way ANOVA für Panel E. Platten A – C und E von Papa Et Al.9geändert wurdenKlicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um schnell zu einem bedeutenden Grad die Zahl der funktionalen menschlichen HSCs erweitern von UCBs. Der pilot und kinetischen Studien unter Verwendung dieses Protokolls zeigen, dass die ex Vivo erweiterte Zellen sofort erwerben und behalten die Expression von mehreren HSC phänotypische Markierungen einschließlich CD90 sowie primitive HSC metabolischen Eigenschaften9.

Diese ex-Vivo Expansion Protokoll ist relativ einfach und zuverlässig. Reinigung von CD34+ Zellen mit der Zelle-Separator-Gerät (siehe Tabelle der Materialien) ist sehr reproduzierbar und schnell, so dass für schnelle Wiederherstellung von isolierten Zellen. Diese Methode ergibt eine hohe Ausbeute an gereinigten CD34+ Zellen (> 90 %) im Gegensatz zu manuellen Immunomagnetic Trennung. Darüber hinaus erfordert diese ex-Vivo Expansion Protokoll keine spezielle und komplexe Geräte oder fed Batch-Kultur-Systeme, die kontinuierliche Versorgung mit großen Mengen an frischen Medien ergänzt durch Zytokine3,13. Diese Methode schränkt dementsprechend Kosten. Wichtiger ist, können dieses Protokoll für den Ausbau des HSC Pools innerhalb kurzer Zeit, die ein wichtiger Begrenzungsfaktor für Kontamination Frequenz ist.

Einige Punkte berücksichtigt werden, für die Erreichung der primitiven HSCs von CD34+ Zellen unter Verwendung dieses Protokolls. CD34+ Zellen erweitert für 4 Tage in Kulturen mit den Zytokin-cocktail und VPA Lead Generation aus einem Pool von primitiven langfristige HSCs behandelt. Diese HSCs zeichnen sich nicht nur durch die hohe Expression CD34, CD90 und CD49f, sondern auch durch ein sehr primitiv metabolische Profil, die überwiegend auf Glykolyse9angewiesen ist. Während längeren Inkubation mit VPA für 7 Tage erweiterte Kulturen jedoch sind heterogener und enthalten eine größere Anzahl von sowohl langfristige und kurzfristige als auch differenzierte Zellen im Gegensatz zu Zellen für 4 Tage erweitert. Dieses Ergebnis ist vor allem aufgrund der Erschöpfung der VPA in Kultur und erhöhte Anzahl von Zellteilungen9. So, dieses Protokoll kann zur Erweiterung von zwei verschiedenen Pools von Zellen zu erreichen: 4 Tage und 7 Tage erweiterte Zellen. Das 7-Tage-Erweiterung Produkt kann für allogene Transplantationen HSC verwendet werden, wo eine schnellere sowie nachhaltige multilineage Engraftment erforderlich ist. Das 4-tägige Ausbau-Protokoll möglicherweise am besten geeignet für gentechnische Veränderung Strategien, die auf langfristige Wiederbesiedlung Zellen abzielen. Es ist auch wahrscheinlich, dass diese Kombination von VPA und Zytokin-cocktail am Pool von HSZ aus CD34 erweitern kann+ Zellen auf den gleichen Grad oder höher bei Verwendung der in diesem Protokoll verwendete Medien außer den Medien (siehe Tabelle der Materialien).

Derzeitigen gen Bearbeitungs-Verfahren sind verbunden mit einem erheblichen Verlust von HSZ, die ihre klinischen Anwendung einschränken. Die große Anzahl der primitiven HSCs erreicht innerhalb von 2 – 4 Tagen Behandlung der VPA in ex Vivo Kulturen hat das Potential, diesen Verlust in HSC Zahlen zu überwinden. So könnte dieses Protokoll für die Verbesserung der bestehenden gen bearbeiten Protokolle zum Vorteil gereichen und ermöglichen die Korrektur der genetischen Mutationen im HSC Transplantation-basierte Therapien für β-Thalassämie und Sichelzellanämie. Darüber hinaus können angewendet werden, um große Zahlen von HSZ bei gen-Manipulationen für Studien konzentrierte sich auf die Aufklärung von Genfunktionen in HSCs und Hämatopoese zu erhalten.

Zusammenfassend, die hier beschriebene Methode eignet sich für ex-Vivo Expansion der menschlichen und murinen HSCs und auf spezifische klinische Anwendungen sowie über ein breites Spektrum von Untersuchungen in der Grundlagenforschung zugeschnitten werden kann.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt von NYSTEM C030136 gewähren, R.H. Wir würden gerne Bartek Jablonski für sein Feedback und Überarbeitung des Manuskripts danken

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expansion Media Sigma-Aldrich Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML
AO/PI (acridine orange/propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. Nexcelom CS2-0106-25mL
APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 BD BIOSCIENCE 555824
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 BD BIOSCIENCE 555751
autoMACS Rinsing Solution MACS Miltenyi Biotec 130-091-222
BD Falcon 15 mL Tube BD Biosciences 352097
BD Falcon 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube BD Biosciences 352063
BD Falcon 50 mL Tube BD Biosciences 352098
Bovine serum albumine solution Sigma-Aldrich A8412
CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human Miltenyi Biotec 130-046-703
Cell analyzer BD Biosciences FACS Canto II
Cell analyzer and sorter BD Biosciences FACS Aria II
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter
Cell separator device autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec
Counting Chambers Nexcelom CHT4-PD100-002
Density gradient media GE Healthcare Bio-Sciences AB 17-1440-03
Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E8008-100ML
FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 BIOLEGEND 328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody BIOLEGEND 400109
Inverted microscope
PBS Corning cellgro 21-040-CV
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein R&D Systems 308FKN
Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) R&D Systems 203-IL
Recombinant Human SCF Protein R&D Systems 255-SC
Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) R&D Systems 288-TP
Total Antibody Compensation Bead Kit thermofisher A10497
Umbilical Cord-blood Placental Blood Program at the New York Blood Center http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/
Valproic acid sodium salt Sigma-Aldrich P4543

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Medizin Ausgabe 146 Nabelschnurblut CD34+ Zellen ex Vivo Kultur VPA HSCs ex Vivo Expansion Transplantation Gentherapie
Ex-Vivo Expansion von hämatopoetischen Stammzellen aus menschlichen Nabelschnur Blut abgeleitet CD34<sup>+</sup> Zellen mit Valproinsäure
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Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R.… More

Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid. J. Vis. Exp. (146), e59532, doi:10.3791/59532 (2019).

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