Summary
Aqui, descrevemos o ex vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas do CD34+ células derivadas do sangue do cordão umbilical, tratados com uma combinação de um cocktail de citocinas e VPA. Esse método leva a um grau significativo de ex vivo expansão dos linfócitos primitivos para qualquer clínica ou aplicações de laboratório.
Abstract
Unidades de sangue (UCB) do cordão umbilical fornecem uma fonte alternativa de células-tronco hematopoiéticas humanas (linfócitos) para pacientes que necessitam de transplante de medula óssea alogênico. Enquanto UCB tem várias vantagens exclusivas, o número limitado de linfócitos dentro de cada unidade da UCB limita seu uso na medicina regenerativa e HSC transplante em adultos. Expansão eficiente de linfócitos humanos funcionais pode ser alcançado por ex vivo cultivo de CD34+ células isoladas de UCBs e tratados com um inibidor da deacetilase, ácido valproico (VPA). O protocolo detalhado aqui descreve as condições de cultura e metodologia para isolar rapidamente CD34+ células e expandir para um alto grau, uma piscina de linfócitos primitivos. Os linfócitos expandidos são capazes de estabelecer a enxertia de curto e longo prazo e são capazes de dar origem a todos os tipos de células hematopoiéticas diferenciadas. Esse método também possui potencial para aplicação clínica em terapia de gene autóloga HSC e fornece uma abordagem atraente para superar a perda de linfócitos funcionais associados com a edição de gene.
Introduction
Ex vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) do sangue do cordão umbilical unidades (UCB) é uma grande promessa para aplicações de HSC na terapia de transplante e medicina regenerativa. Transplante com unidades UCB tem várias vantagens exclusivas, tais como a coleção fácil, alta disponibilidade, risco mínimo de infecção, baixo risco de recaída da doença e de baixa frequência da doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD). No entanto, as principais desvantagens da sua utilização em ambientes clínicos são o número limitado de linfócitos presentes dentro de cada UCB unidade1. O número insuficiente de linfócitos resulta em atrasada enxertia e recuperação hematopoiética, risco de rejeição do enxerto e reconstituição imune aberrante.
Atualmente, vários métodos e estratégias foram desenvolvidas para ex vivo expandir o número limitado de linfócitos de UCBs. Combinações de diferentes citocinas cocktails com pequenas moléculas ou compostos em ex vivo resultado de culturas em vários graus de expansão em HSC números2,3,4,5,6, 7,8. Importante, ex vivo cultura condições induzem estresse, levando à proliferação celular rápida, aumento da atividade metabólico e perda das características primitivas que definem linfócitos primários. Portanto, protocolos em desenvolvimento que levam à expansão de um grande número de linfócitos funcionais com características que se assemelham a primários linfócitos primitivos são necessários.
Culturas de soro livre de CD34+ células isoladas de UCBs e tratados com resultado de (VPA) ácido valproico na expansão de um grande número de linfócitos primitivos4,9,10. A expansão de HSC não é unicamente devido à proliferação dos linfócitos existentes derivado UCBs. Em vez disso, esta expansão é devido à aquisição de um fenótipo primitivo, combinado com um número limitado de divisões celulares e proliferação9. Dentro o inicial 24 – 48 h de incubação com uma combinação de citocinas e VPA, CD34+ células adquirem um perfil fenotípico que caracterizam a longo prazo linfócitos e transcriptomic. O aumento significativo da percentagem de linfócitos é acompanhado por um aumento rápido do número de linfócitos (aumento de 63 vezes dentro de 24 h de tratamento VPA)9. Nomeadamente, a estratégia de expansão do VPA-ex vivo expande linfócitos com baixa atividade metabólica, que destaca ainda mais suas características primitivas.
O método descrito aqui fornece condições e tratamentos que levam a um grau significativo de ex vivo expansão dos linfócitos primitivos para qualquer clínica ou aplicações de laboratório. Ex vivo de estratégia de expansão usa um cocktail de citocina combinado com tratamento de VPA. VPA é um medicamento aprovado pela FDA para o tratamento de transtorno bipolar e outras doenças neurológicas. A expansão de HSC com VPA é rápida e ocorre dentro de 7 dias, minimizando o tempo de manipulação e o risco de contaminação. Importante, este protocolo permite a aquisição de longo prazo marcadores fenotípicos de HSC como CD90 e CD49f dentro de 24-48 h após o tratamento com VPA9. Enxertos HSC expandidos criados com este protocolo têm a capacidade de regenerar o sistema hematopoiético, uma vez que podem se diferenciar em todas as linhagens de células hematopoiéticas e estabelecer a longo prazo enxertia após transplante em ratos NSG myeloablated modelos4. Além disso, este protocolo é altamente reprodutível e permite a rápida e eficiente de isolamento de CD34 viável+ células de UCBs, que é fundamental para a industrialização deste procedimento.
O VPA ex vivo protocolo de expansão também tem potencial para superar a perda significativa de linfócitos, que ocorre durante o gene edição11. Gene edição exige exposição a citocinas, que são necessárias para ciclismo células e ativação dos mecanismos de reparação do DNA. Devido aos efeitos de alerta do tratamento de VPA, esse método pode ser benéfico para a geração de um número maior de células geneticamente modificadas dentro de um período de tempo que é relevante para atualmente utilizados protocolos de modificação genética.
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Protocol
O HSC ex vivo protocolo de expansão segue as diretrizes do Comitê de ética de pesquisa no Mount Sinai School of Medicine.
1. o buffer e preparação de meios de comunicação
- Preparar o tampão de separação 24 h antes do isolamento do CD34+ células de UBCs, adicionando 2 mL de 0.5 M etileno diamina Tetra-ácido acético (EDTA) e 33 mL de 7,5% albumina de soro bovino (BSA) para 465 mL tamponada solução salina (1X PBS). Misture suavemente e manter o buffer durante a noite a 4 ° C.
- Mídia quente na temperatura de quarto no dia da purificação.
2. isolamento de células mononucleares (PTM) de UCB unidade
- Dispense a unidade inteira da UCB em um balão de2 de 75 cm. Diluir e misture suavemente o UCB com um volume igual de PBS em temperatura ambiente.
- Determine o número de tubos necessários para o processamento de toda a unidade UCB (um tubo cónico de 50 mL pode ser usado para processar 35 mL da UCB diluído). Adicionar 15 mL de mídia de gradiente de densidade (ver Tabela de materiais) para cada tubo e dispense a UCB diluído no topo da mídia gradiente de densidade, criando duas camadas.
Nota: Dispense a UCB diluído muito lentamente, mantendo o tubo em um ângulo de 45° para evitar a mistura da camada de mídia gradiente de densidade com a UCB. - Centrifugar a 400 x g durante 30 min a uma baixa taxa de aceleração e desaceleração. Após a centrifugação, as multinacionais localizar na camada branca (buffy coat) entre a camada de mídia gradiente plasma e densidade.
- 2/3 do plasma, Aspire lentamente sem perturbar a camada de revestimento buffy. Transferi com cuidado a camada de revestimento buffy para um novo tubo de 50 mL. Colete todas as multinacionais da mesma unidade UCB em um tubo de 50 mL até atingir 25 mL. Use um tubo novo se o volume das MNCs coletados exceder 25 mL.
- Adicionar 25 mL de PBS frio no tubo contendo 25 mL de multinacionais e misture bem. Centrifugar a 400 x g por 10 min a 4 ° C.
Nota: PBS frio é importante para prevenir tampando de anticorpos na superfície das células e reduzir a rotulagem não-específica. - Aspire cuidadosamente o sobrenadante e suavemente Ressuspender o sedimento celular em 50 mL de PBS frio.
- Remova 20 μL da suspensão de células para a contagem. Conte o número de células corado com iodeto de propidium/laranja de acridina coloração usando um contador automatizado de células. Calcule o número total de multinacionais.
Nota: A contagem de células também pode ser realizada pelo método de exclusão azul trypan usando um hemocytometer. - Centrifugar a 400 x g por 15 min a 4 ° C.
Nota: Se não é necessária imediatamente, as multinacionais podem ser congeladas nesta fase.
3. isolamento de CD34+ células de UCBs
- Preparar o CD34+ anticorpo juntamente com solução de grânulos magnético para isolamento de CD34+ células de MNCs. Mix 300 µ l de tampão de separação com 100 µ l de IgG humana humana FcR (Reagente de bloqueio) e 100 µ l de CD34 grânulos magnéticos para isolamento de CD34 + células de cada 108 MNCs. Para o isolamento de um maior número de CD34+ células de (> 108) MNCs, scale-up reagentes em conformidade.
- Aspire cuidadosamente o sobrenadante do tubo centrifugado a passo 2.8. Resuspenda o pellet em solução grânulos magnético CD34 preparada no passo 3.1 (usar 500 µ l de solução por 108 células).
- Misture delicadamente e incubar a 4 ° C por 30 min.
Nota: Prepare o dispositivo separador de células (veja a Tabela de materiais) durante o período de incubação. Substituir a solução de armazenamento com a reserva de trabalho, conforme indicado pelas instruções do fabricante e executar um programa de lavagem, seguido de um programa de lavagem. - Adicione separador de cela fria executando o buffer para o tubo contendo a mistura de célula até que o tubo é totalmente preenchido. Centrifugar a 400 x g por 15 min a 4 ° C.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células no separador de cela fria correr buffer (2 mL/108 células). Transferi a 2 mL da mistura de suspensão de células para tubos de 15 mL.
- Carga 3 conjuntos de tubos de 15 mL dentro do rack de separador de células prechilled a 4 ° C. Um conjunto de tubos contém as multinacionais, o segundo conjunto de tubos será usado para coletar a fração negativa e o terceiro conjunto de tubos será usado para coletar purificada CD34+ células.
- Carregar o rack para o dispositivo separador celular e executar o programa predefinido de posseld2 .
Nota: Um método alternativo que utiliza o separador magnético manual pode ser usado para substituir a célula separador dispositivo12 . - Tubos de centrífuga com a fração positiva a 400 x g durante 15 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender purificada CD34+ células em 1 mL de soro-free media.
- Conte as células coradas com iodeto de propidium/laranja de acridina usando um contador automatizado de células.
Nota: Se não é necessária imediatamente, purificado CD34+ células podem ser congeladas nesta fase.
4. VPA Ex Vivo expansão de células purificadas de UCB-CD34+
- Preparar um volume suficiente de mídia para o CD34 purificado da placa+ células em uma densidade de 3.3 x 104 células/mL. A composição de meios de cultura é o meio de cultura livre do soro (ver Tabela de materiais) suplementado com 10 µ l/mL caneta/estreptococos, fator de células-tronco 150 ng/mL (SCF), 100 ng/mL fms-como tirosina quinase do receptor 3 (FLT3 ligante), 100 ng/mL Trombopoietina (TPO), e 50 ng/mL interleucina 3 (IL-3).
- Placa purificado CD34 em uma placa de 12 células+ (5 x 104 CD34+ células / 1,5 mL de mídia / bem) e cultura a 37 ° C numa incubadora umidificado 5% CO2 .
- Avaliar a pureza do CD34 isolado+ células e composição da célula por análise de FACS conforme descrito abaixo na etapa 6.3.
- Adicione VPA em uma concentração final de 1 mM para as culturas de células tratadas para 16 h com cocktail de citocina.
- Cultura das células por mais 7 dias a 37 ° C numa incubadora umidificado 5% CO2 .
Nota: Mídia permanece inalterada durante a duração do ex vivo expansão.
5. anticorpo que mancha para análise de citometria de fluxo
- Prepare a solução de anticorpo de coloração para manchar a 2 x 104– 6 x 104 células e isotipo solução para determinar FACS gating estratégia e determinar o nível de ligação não-específica. Diluir a anticorpos (1/100 da APC anti-CD34, 1/200 FITC anti-CD90) e os respectivos isotipos em 50 µ l de tampão de separação (composição de tampão de separação é definida na etapa 1.1).
Nota: Realize a única mancha de células com cada anticorpo para um estratégia de retenção de FMO. Kit de compensação anticorpo total (ver Tabela de materiais) pode ser usado para a configuração de compensação. - Homogeneizar a cultura de células pipetando várias vezes. Contar as células e pipetar 5 x 104 células para um tubo de 1,5 mL.
- Adicione 1 mL de tampão de separação e centrifugador a 400 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante e resuspenda o pellet em 50 µ l da solução de coloração. Incube as células por 30 min à temperatura ambiente.
- Adicione 450 µ l de tampão de separação e centrifugador a 400 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante e resuspenda o pellet em 100 µ l de tampão de separação. Manter as células no gelo pelo menos 5 min até a realização de análises FACS. Adicione 1 µ l de 7-AAD para portão de células viáveis.
- Carregar a amostra de células coradas na máquina FACS e adquirir as células para a mais baixa taxa de fluxo.
- Para cada fluoróforo, analise o isotipo controles e única células manchadas para configurar gating para FITC (CD90), APC (CD34) e coloração PerCP/Cy5.5 (7-AAD).
- Portão PerCP/Cy5.5 negativo fração e trama do APC vs FITC para determinar a porcentagem de CD34 viável+, CD90+,e CD34+CD90+ células que define a população HSPC/HSC na cultura.
6. anticorpo que mancha para fluxo Cytometry célula classificação
- Ressuspender as células expandidas pipetando várias vezes. Contar o número de celular e transferir toda a cultura para um tubo de 15 mL ou 50 mL.
- Encha o tubo com buffer de separação frio
- Centrifugar a 400 x g por 15 min a 4 ° C.
- Prepare a solução anticorpo-coloração para manchar a 5 x 105– 2 x 106 células e isotipo solução para manchar a 1 x 105 células e determinar a retenção de FACS. Diluir 1/10 (APC anti-CD34), 1/20 (FITC-CD90) anticorpos e os isotipos correspondentes em 500 µ l de separação de buffer por cada condição.
- Prepare os controles de compensação de cor única usando um kit de grânulo anticorpo total compensação de acordo com as instruções do fabricante.
- Transferir o sobrenadante do passo 5.2 para um novo tubo e mantê-lo a 37 ° C. Este meios de cultura será reutilizado para cultura de células classificadas.
- Resuspenda o pellet de células no buffer de separação fria para obter uma concentração de 5 x 105 células / mL. Transferi 1 x 105 células em tubos de 1,5 mL para coloração de isotipo e as células restantes que serão classificadas em outros tubos de 1,5 mL.
- Centrifugar os tubos a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender pelotas de células no isotipo de coloração da solução e o pellet de células que será classificada no anticorpo que mancha a solução.
- Incubar durante 30 min a 4 ° C.
- Adicionar 450 µ l de tampão de separação e centrifugador a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Resuspenda as pelotas com 2 mL de tampão frio separação.
- Para evitar entupimentos, filtre as amostras através de um filtro de célula μm 40 e lugar no gelo até FACS.
- Classificador de pilha de set-up para classificação com os parâmetros corretos.
- Isotype executar amostras para definir a tensão e ganhar para frente e lado scatter e identificação de populações de fluorescência negativa.
- Controles de execução única cor para definir coeficientes de compensação e aplique compensado parâmetro para protocolo de coleção.
- Execute uma pequena alíquota da amostra (Ab) (eventos de ~ 50.000) para estabelecer a estratégia associada.
- Configurar as decisões de classificação para coletar o CD34+ CD90 fração de celular– .
- Células do tipo coleção tubos revestidos com 2 mL de tampão de separação.
- Depois da classificação, recontar as células e centrifugá-los a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado na mídia recuperada na etapa 5.5 para atingir uma concentração final de 3 x 104 células/mL.
- Placa CD34+ CD90– purificado de células em placas de 12 poços com média de 1,5 mL/poço (5 x 104 CD34+ CD90– células/1.5 mL de mídia/poço).
- Avalie a pureza por análise de FACS usando 50 µ l de células contendo mídia.
- Tratar as culturas de CD34+CD90– células com VPA em concentração final de 1mM.
- Incube a 37 ° C numa incubadora umidificado 5% CO2 .
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Representative Results
O ex vivo protocolo descrito aqui aumenta o número de linfócitos primitivos gerados a partir de CD34+ células isoladas de UCBs (Figura 1). Escorva de CD34+ células para 16 h com uma citocina coquetel, seguido de um tratamento com VPA para um adicional 7 dias, leva a um grande grau de expansão do HSC. Notavelmente, o pool de células expandidas é altamente enriquecido para linfócitos, que são fenotipicamente definidos por CD34+CD90+ marcadores. O número total de células nucleadas (TNCs) nas culturas tratadas com a cocktail de citocina sozinho é significativamente maior do que os números das células observadas nas culturas tratadas com o cocktail de citocinas e VPA (Figura 2A). Apesar do número maior de empresas transnacionais, o número de linfócitos nas culturas recebendo o cytokine cocktail sozinho permanece baixo durante o período de expansão inteira em comparação com as culturas tratadas com o cocktail de citocinas e VPA (Figura 2B). O maior número de linfócitos é gerado nas culturas tratadas com uma combinação de cocktail do cytokine e VPA (Figura 2B). Em particular, a maior expansão do número de linfócitos é alcançada após 5-7 dias após o tratamento de VPA (Figura 2B). O aumento do número de linfócitos se correlaciona com um aumento da percentagem de linfócitos, alerta que é notável no prazo de 24 h de tratamento VPA (Figura 2). Enquanto o aumento da percentagem de linfócitos é alta e mantido durante os primeiros 4 dias de ex vivo cultura, isso diminui progressivamente após 5-7 dias de tratamento com VPA (Figura 2). No entanto, esta diminuição está inversamente correlacionada com um aumento no número absoluto de linfócitos.
Importante, o rápido aumento da percentagem de linfócitos observados em culturas VPA tratada é devido à aquisição do fenótipo CD90. CD34+ células expressando o CD90 fenotípica marcador atinge quase 40%-45% de células expandidas em ex vivo de culturas tratadas com o cocktail de citocinas e VPA por 4 dias (Figura 2,D). A aquisição do fenótipo CD90 é ainda mais confirmada por ex vivo expansão do CD34 altamente purified+ células essa falta de expressão do marcador CD90. Dentro de 24 h de tratamento de VPA, quase 75% do ex vivo expandido células em culturas iniciadas com CD34 classificada+CD90– células expressam CD90 em vez de 0% das células em culturas contendo o cytokine cocktail sozinho (Figura 2E). Importante, o fenótipo CD90 altamente seja mantido durante os primeiros 4 dias em ex vivo de culturas tratadas com VPA (Figura 2E).
Figura 1: apresentação esquemática do ex vivo cultura de expansão. Purificado CD34+ células de UCBs são condicionadas por 16 h em ex vivo cultura suplementada com uma combinação das citocinas indicadas. As culturas são tratadas com VPA (1mM) por mais 7 dias. O ex vivo células expandidas então podem ser transplantadas em camundongos NSG de myoablated. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: tratamento de VPA desencadeia a aquisição do CD90, resultando na expansão de um grande número de linfócitos. (A) número absoluto do totais viáveis células nucleadas, expandida-se em ex vivo culturas9. Purificado CD34+ células de UCBs descritas no capítulo 3, tratado com citocinas cocktail sozinho ou uma combinação de citocina cocktail e VPA conforme descrito na seção 4 foram contados pela coloração de iodeto de propidium/laranja de acridina (n = 16). Números denotam dias de tratamento com VPA, Considerando que o PC indica o CD34 inculto primário+ células isoladas de UCBs. (B, C) Número absoluto e percentual de CD34+CD90+ expandidas ao longo de 7 dias em ex vivo de culturas de células tratadocom com cocktail de citocina sozinho ou uma combinação de citocina cocktail e VPA (n = 21). Percentagem de CD34+CD90+ células é determinado pela análise de citometria de fluxo das células coradas conforme descrito na seção 4. (D) análise fenotípica de CD34 classificada+ células de UCBs (etapa 5.3) expandidas-se em ex vivo culturas tratadas como indicado por 4 dias. Painel da esquerda indica a estratégia associada usando isotipo coloração Considerando que outros painéis indicam células coradas expandido em culturas contendo cytokine cocktail sozinho ou uma combinação de citocina cocktail com VPA. Os números denotam a porcentagem de CD34–CD90+ células CD34+CD90– células e CD34+CD90+ células. (E) a percentagem de CD34+CD90+ células expandidas em culturas iniciadas com classificados CD34+CD90– células de UBCs e tratados com cocktail de citocina sozinho ou uma combinação de citocina cocktail e VPA para o dias indicados. Percentual é determinado pela análise de citometria de fluxo (n = 4). N: número de repetições biológicas. Barras de erros com SEM; p ≤ 0,0001, conforme determinado pelos modelos binomial-negativa para A e B, modelos de Beta para D e 2-way ANOVA para painel E. painéis A – C e E foram modificadas de Papa et al.9clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste documento, apresentamos um protocolo para rapidamente expandir significativamente o número de linfócitos humanos funcionais de UCBs. Os estudos cinéticos e piloto usando este protocolo indicam que o ex vivo expandidas células prontamente adquirir e manter a expressão de vários marcadores fenotípicos HSC incluindo CD90, bem como os primitivos HSC características metabólicas9.
Ex vivo protocolo de expansão é relativamente simples e confiável. Purificação de CD34+ células com o dispositivo de separador de célula (ver Tabela de materiais) é altamente reprodutível e rápida, permitindo uma recuperação rápida de células isoladas. Esse método resulta em um alto rendimento de CD34 purificado+ células (> 90%) em oposição a separação manual Fima. Além disso, este ex vivo protocolo de expansão não requer dispositivos especiais e complexos ou sistemas de cultura alimentados em lotes que precisam de abastecimento contínuo de grandes volumes de mídia fresca suplementada com citocinas3,13. Por conseguinte, este método limita os custos. Importante, este protocolo permite a expansão da piscina HSC a curto prazo, que é um factor limitante para a frequência de contaminação.
Vários pontos devem ser considerados para alcançar linfócitos primitivos de CD34+ células usando este protocolo. CD34+ expandidas por 4 dias em culturas de células tratadocom com o cocktail de citocinas e chumbo VPA para a geração de um pool de linfócitos a longo prazo primitivos. Estes linfócitos são caracterizados não só pelos níveis altos de expressão de CD34, CD90 e CD49f, mas também por um perfil metabólico muito primitivo, que baseia-se predominantemente na glicólise9. Durante a incubação mais prolongada com VPA por 7 dias, culturas expandidas no entanto são mais heterogêneas e contêm um número maior de ambas a longo prazo e a curto prazo, bem como diferenciadas células em vez de células expandidas por 4 dias. Este resultado é principalmente devido a exaustão de VPA em cultura e aumento do número de divisões celulares9. Assim, este protocolo pode ser usado para alcançar a expansão de duas piscinas diferentes de células: células expandidas-4 e 7 dias. O produto da expansão de 7 dias pode ser usado para transplante alogênico de HSC onde enxertia multilineage também como sustentada mais rápida é necessária. O protocolo de expansão 4-dia pode ser mais adequado para as estratégias de modificação genética que atingir células de repovoamento a longo prazo. Também é provável que esta combinação de VPA e cocktail de citocina pode expandir o pool de linfócitos de CD34+ células com o mesmo grau ou superior quando usando meios que não sejam os meios de comunicação (ver Tabela de materiais) utilizados neste protocolo.
Procedimentos de edição atual gene estão associados uma perda significativa de linfócitos, que limitam a sua aplicação clínica. O grande número de linfócitos primitivos alcançado dentro de 2-4 dias de tratamento de VPA, em ex vivo culturas tem potencial para superar esta perda em números HSC. Assim, este protocolo pode ser benéfico para melhorar o gene existente edição protocolos e ativar correção de mutações genéticas em HSC transplante baseado em terapias para β-talassemia e doença falciforme. Além disso, pode ser aplicado para manter o grande número de linfócitos durante manipulações de gene para estudos focados na elucidação das funções do gene em linfócitos e na hematopoiese.
Em conclusão, o método descrito aqui pode ser usado para ex vivo expansão de linfócitos humanos e murino e pode ser adaptado para específicas aplicações clínicas bem como sobre um amplo espectro de investigações em pesquisa básica.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NYSTEM conceder a C030136 de R.H. Gostaríamos de agradecer seu feedback e revisão do manuscrito Bartek Jablonski
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expansion Media | Sigma-Aldrich | Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML | |
| AO/PI (acridine orange/propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. | Nexcelom | CS2-0106-25mL | |
| APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 | BD BIOSCIENCE | 555824 | |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 | BD BIOSCIENCE | 555751 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| BD Falcon 15 mL Tube | BD Biosciences | 352097 | |
| BD Falcon 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352063 | |
| BD Falcon 50 mL Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Bovine serum albumine solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-046-703 | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cell analyzer and sorter | BD Biosciences | FACS Aria II | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter | |
| Cell separator device | autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec | ||
| Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-PD100-002 | |
| Density gradient media | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 | BIOLEGEND | 328108 | |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | BIOLEGEND | 400109 | |
| Inverted microscope | |||
| PBS | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 308FKN | |
| Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) | R&D Systems | 203-IL | |
| Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC | |
| Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) | R&D Systems | 288-TP | |
| Total Antibody Compensation Bead Kit | thermofisher | A10497 | |
| Umbilical Cord-blood | Placental Blood Program at the New York Blood Center | http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/ | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | P4543 |
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