Summary
Qui, descriviamo l'ex espansione vivo di cellule staminali ematopoietiche da CD34+ le cellule derivate dal sangue del cordone ombelicale trattati con una combinazione di una citochina cocktail e VPA. Questo metodo conduce ad un grado significativo di ex espansione vivo di HSCs primitivo per una clinica o applicazioni di laboratorio.
Abstract
Cordone ombelicale unità di sangue (UCB) forniscono una fonte alternativa di cellule staminali ematopoietiche (HSCs) per pazienti che richiedono il trapianto allogenico di midollo osseo. Mentre UCB ha diversi vantaggi unici, il numero limitato di HSCs all'interno di ogni unità UCB limiti loro uso nella medicina rigenerativa e trapianto di HSC negli adulti. Espansione efficiente di HSCs umano funzionale può essere ottenuta ex vivo coltura delle CD34+ cellule isolate da UCBs e trattati con un inibitore delle deacetilasi, acido valproico (VPA). Il protocollo dettagliato qui descrive le condizioni di coltura e la metodologia per isolare rapidamente CD34+ cellule ed espandere ad un alto grado un pool di HSCs primitivo. Le HSCs espanso sono in grado di stabilire l'attecchimento sia a breve che a lungo termine e sono in grado di dar luogo a tutti i tipi di cellule ematopoietiche differenziate. Questo metodo inoltre tiene il potenziale per l'applicazione clinica di terapia genica con HSC autologa e fornisce un approccio attraente per superare la perdita di HSCs funzionale associata con il gene editing.
Introduction
Ex vivo espansione di cellule staminali ematopoietiche (HSCs) da sangue del cordone ombelicale unità (UCB) tiene la grande promessa per applicazioni di HSC nella medicina rigenerativa e nella terapia di trapianto. Il trapianto con unità di UCB ha diversi vantaggi unici come collezione easy, disponibilità elevata, minimo rischio di infezione, basso rischio di ricaduta di malattia e bassa frequenza dell'innesto-contro la malattia ospite (GVHD). Tuttavia, gli svantaggi principali del loro utilizzo in ambito clinico sono il limitato numero di HSCs presenti all'interno di ogni unità UCB1. Il numero insufficiente di HSCs provoca engraftment in ritardo e recupero ematopoietico, rischio di rigetto e di ricostituzione immunitaria aberrante.
Attualmente, sono state sviluppate vari metodi e strategie per ex vivo espandere il numero limitato di HSCs da UCBs. Combinazioni di diverse citochine cocktail con piccole molecole o composti in ex vivo culture causare vari gradi di espansione in HSC numeri2,3,4,5,6, 7,8. D'importanza, ex vivo cultura condizioni inducono stress, portando a proliferazione rapida delle cellule, l'attività metabolica aumentata e perdita delle caratteristiche primitive che definiscono HSCs primario. Pertanto, sono necessari protocolli in via di sviluppo che portano all'espansione di un gran numero di HSCs funzionale con caratteristiche che assomigliano molto alle primarie HSCs primitivo.
Privo di siero culture di CD34+ cellule isolate da UCBs e trattate con risultato di (VPA) acido valproico nell'espansione di un gran numero di primitivo HSCs4,9,10. L'espansione di HSC non è solamente dovuto la proliferazione delle HSCs esistente derivata da UCBs. Invece, questa espansione è dovuta all'acquisizione di un fenotipo primitivo combinato con un numero limitato di divisioni cellulari e proliferazione9. All'interno l'iniziale 24 – 48 h di incubazione con una combinazione di citochine e VPA, CD34+ le cellule acquisiscono un trascrittomica e profilo fenotipico che caratterizzano HSCs a lungo termine. L'aumento significativo della percentuale di HSCs è accompagnato da un rapido aumento del numero di HSCs (aumento di 63 volte entro 24 h del trattamento di VPA)9. In particolare, la strategia di espansione di VPA-ex vivo si espande HSCs con bassa attività metabolica, che evidenzia ulteriormente la loro caratteristiche primitive.
Il metodo qui descritto fornisce condizioni e trattamenti che conducono ad un grado significativo di ex vivo espansione di HSCs primitivo per uno clinica o applicazioni di laboratorio. Questo ex vivo la strategia di espansione utilizza un cocktail di citochina combinato con il trattamento di VPA. VPA è un farmaco approvato dalla FDA per il trattamento di disturbi bipolari e altre malattie neurologiche. L'espansione di HSC con VPA è veloce e si verifica entro 7 giorni, riducendo al minimo il tempo di manipolazione e il rischio di contaminazione. D'importanza, questo protocollo consente l'acquisizione di lungo termine marcatori fenotipici HSC come CD90 e CD49f entro 24-48 h dopo il trattamento con VPA9. Innesti HSC espansi creati con questo protocollo hanno la capacità di rigenerare il sistema ematopoietico poiché possono differenziarsi in tutti i lignaggi di cellule ematopoietiche e stabilire attecchimento a lungo termine dopo trapianto in topi NSG myeloablated modelli4. Inoltre, questo protocollo è altamente riproducibile e permette per l'isolamento efficiente e rapido di CD34 vitali+ cellule da UCBs, che è fondamentale per l'industrializzazione di questa procedura.
Il VPA ex vivo protocollo di espansione ha anche il potenziale per superare la perdita significativa di HSCs che si verifica durante il gene editing11. Gene modifica richiede l'esposizione a citochine, che sono necessari per cellule ciclanti e attivazione dei meccanismi di riparazione del DNA. A causa degli effetti di richiesta del trattamento di VPA, questo metodo potrebbe essere utile per la generazione di un numero maggiore di cellule geneticamente modificate entro un periodo di tempo che è rilevante per attualmente utilizzati protocolli di modifica del gene.
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Protocol
L'HSC ex vivo protocollo di espansione segue le linee guida del comitato etico di ricerca presso la Mount Sinai School of Medicine.
1. buffer e preparazione di terreni
- Preparare il tampone di separazione 24 h prima dell'isolamento di CD34+ cellule da lattine aggiungere 2 mL di 0.5 M etilene diammina Tetra-acetico (EDTA) e 33 mL di 7,5% albumina di siero bovino (BSA) a 465 mL tamponata di soluzione salina (1x PBS). Mescolare delicatamente e mantenere il buffer durante la notte a 4 ° C.
- Supporto caldo a temperatura ambiente il giorno della purificazione.
2. isolamento di cellule mononucleari (MNCs) dall'unità di UCB
- Erogare l'intera unità UCB in un matraccio da2 di 75 cm. Diluire e mescolare delicatamente il UCB con un volume uguale di PBS a temperatura ambiente.
- Determinare il numero di provette necessarie per elaborare l'intera unità UCB (una provetta conica da 50 mL può essere utilizzato per elaborare 35 mL di diluito UCB). Aggiungere 15 mL di media gradiente di densità (Vedi Tabella materiali) ad ogni provetta ed erogare il UCB diluito sulla parte superiore i supporti di gradienti di densità creando due strati.
Nota: Dispensare il UCB diluito molto lentamente mentre si tiene il tubo ad angolo 45° per evitare la miscelazione del livello sfumatura media densità con il UCB. - Centrifugare a 400 x g per 30 min a un basso tasso di accelerazione e decelerazione. Dopo la centrifugazione, MNCs individuare nello strato bianco (buffy-coat) tra lo strato di pendenza media del plasma e la densità.
- Aspirare lentamente 2/3 del plasma senza disturbare lo strato del buffy-coat. Trasferire con cautela lo strato del buffy-coat in una nuova provetta da 50 mL. Raccogliere tutti i MNCs dallo stesso gruppo UCB in una provetta da 50 mL fino a 25 mL. Usare un nuovo tubo se il volume dei raccolti MNC supera 25 mL.
- Aggiungere 25 mL di PBS freddo nella provetta contenente 25 mL di MNC e mescolare bene. Centrifuga a 400 x g per 10 min a 4 ° C.
Nota: PBS freddo è importante prevenire la tappatura di anticorpi sulla superficie delle cellule e ridurre il contrassegno non specifico. - Aspirare accuratamente il supernatante e Risospendere delicatamente il pellet cellulare in 50 mL di PBS freddo.
- Rimuovere 20 μL della sospensione delle cellule per il conteggio. Contare il numero di cellule colorato con acridina arancio/propidio ioduro colorazione utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Calcolare il numero totale dei MNC.
Nota: Il conteggio delle cellule può essere anche eseguito con il metodo di esclusione blu di trypan utilizza un emocitometro. - Centrifuga a 400 x g per 15 min a 4 ° C.
Nota: Se non richiesto immediatamente, MNCs può essere bloccata in questa fase.
3. isolamento di CD34 cellule di+ da UCBs
- Preparare il CD34+ anticorpo accoppiato con soluzione di biglie magnetiche per l'isolamento di CD34 cellule di+ da MNCs. Mix 300 µ l di tampone di separazione con 100 µ l di IgG umane umane FcR (Reagente Bloccante) e 100 µ l di CD34 biglie magnetiche per l'isolamento di CD34 + cellule da ogni 10 MNCs di8 . Per l'isolamento di un maggior numero di CD34 cellule di+ da (> 108) MNCs, scalare i reagenti di conseguenza.
- Attentamente e aspirare il supernatante dal tubo centrifugato a passo 2.8. Risospendere il pellet nella soluzione di biglie magnetiche CD34 preparata al punto 3.1 (utilizzare 500 µ l di soluzione per 108 cellule).
- Mescolare delicatamente e incubare a 4 ° C per 30 min.
Nota: Preparare il dispositivo separatore cellulare (Vedi Tabella materiali) durante il periodo di incubazione. Sostituire la soluzione di storage con il buffer di lavoro seguendo le istruzioni del fabbricante ed eseguire un programma di lavaggio seguito da un programma di risciacquo. - Aggiungi separatore freddo cellulare in esecuzione il tampone nella provetta contenente la miscela di cella fino a quando il tubo è riempito completamente. Centrifuga a 400 x g per 15 min a 4 ° C.
- Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare nel separatore di cella fredda tampone (2 mL/108 cellule) di corsa. Trasferire il 2 mL della miscela di sospensione cellulare in provette da 15 mL.
- Caricare 3 set di provette da 15 mL in rack separatore cellulare prechilled a 4 ° C. Un insieme di tubi contiene MNCs, utilizzerà il secondo set di tubi per raccogliere la frazione negativa e verrà utilizzato il terzo set di tubi per raccogliere purificata CD34+ cellule.
- Caricare il rack nel dispositivo separatore cellulare ed eseguire il programma preimpostato di posseld2 .
Nota: Un metodo alternativo che utilizza il separatore magnetico manuale può essere utilizzato per sostituire il dispositivo di separatore cellulare12 . - Provette per centrifuga con la frazione positiva a 400 x g per 15 min a 4 ° C. Aspirare il supernatante e risospendere purificata CD34+ cellule in 1 mL di terreno privo di siero.
- Contare le celle colorate con acridina arancio/propidio ioduro utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
Nota: Se non richiesto immediatamente, purificato CD34+ le cellule possono essere congelate in questa fase.
4. VPA di espansione Ex Vivo di cellule purificate UCB-CD34+
- Preparare un volume sufficiente di media per il CD34 purificata del piatto+ le cellule ad una densità di 3,3 x 104 cellule/mL. La composizione di terreni di coltura è terreno di coltura libera del siero (Vedi Tabella materiali) completati con 10 µ l/mL penna/strep, fattore di 150 ng/mL cellule staminali (SCF), 100 ng/mL fms-come recettore tirosino-chinasico 3 (FLT3 ligand), 100 ng/mL trombopoietina (TPO), e 50 ng/mL interleuchina 3 (IL-3).
- Piastra purificato CD34+ di celle in una piastra 12-pozzetti (5 x 104 CD34+ cellule / 1,5 mL di media / bene) e coltura a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 .
- Valutare la purezza di CD34 isolato+ cellule e composizione cellulare mediante analisi Citofluorimetrica come descritto di seguito al punto 6.3.
- Aggiungere VPA ad una concentrazione finale di 1 mM in culture di cellule trattate per 16 h con cocktail di citochina.
- Coltura delle cellule per altri 7 giorni a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 .
Nota: Media rimane invariato durante tutta la durata dell'ex espansione vivo.
5. anticorpo che macchia per analisi di citometria a flusso
- Preparare la soluzione di macchiatura dell'anticorpo a macchia 2 x 104– 6 x 104 celle e isotype soluzione per determinare la strategia di gating FACS e determinare il livello di legame non specifico. Diluire gli anticorpi (1/100 APC anti-CD34, 1/200 FITC anti-CD90) e i rispettivi isotipi in 50 µ l di tampone di separazione (composizione del buffer di separazione è definito al punto 1.1).
Nota: Eseguire singole macchiatura delle cellule con ogni anticorpo per un FMO gating strategia. Anticorpo totale compensazione perlina kit (Vedi Tabella materiali) può essere utilizzato per l'installazione di compensazione. - Omogeneizzare la coltura delle cellule pipettando più volte. Contare le cellule e dispensare 5 x 104 cellule in una provetta da 1,5 mL.
- Aggiungere 1 mL di tampone di separazione e centrifuga a 400 x g per 15 min a temperatura ambiente.
- Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 50 µ l di soluzione colorante. Incubare le cellule per 30 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere 450 µ l di tampone di separazione e centrifuga a 400 x g per 15 min a temperatura ambiente.
- Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 100 µ l di tampone di separazione. Mantenere le cellule in ghiaccio per almeno 5 minuti fino a quando l'analisi di FACS. Aggiungere 1 µ l di 7-AAD a cancello di cellule vitali.
- Caricare il campione di cellule macchiato sulla macchina FACS e acquisire le cellule alla minima portata.
- Per ogni fluoroforo, analizzare l'isotipo controlli e cellule singole macchiate per impostare gating per FITC (CD90), APC (CD34) e la macchiatura PerCP/Cy 5.5 (7-AAD).
- Cancello PerCP/Cy 5.5 negativo frazione e trama APC vs FITC per determinare la percentuale di CD34 vitali+, CD90+e CD34+CD90+ cellule che definisce la popolazione HSPC/HSC nella cultura.
6. anticorpo che macchia per flusso Cytometry Cell Sorting
- Risospendere le cellule espanse di pipettaggio più volte. Contare il numero di cellulare e trasferire tutta la cultura in una provetta da 15 mL o 50 mL.
- Riempire il tubo con il tampone di separazione freddo
- Centrifuga a 400 x g per 15 min a 4 ° C.
- Preparazione della soluzione di macchiatura dell'anticorpo a macchiare 5x105– 2 x 106 cellule e soluzione di isotipo di macchia 1x105 cellule e determinare FACS gating. Diluire 1/10 (APC anti-CD34), 1/20 (FITC-CD90) anticorpi e il corrispondente isotipi in 500 µ l di separazione del buffer per ogni condizione.
- Preparare i controlli di compensazione di singolo colore utilizzando un anticorpo totale compensazione perlina kit secondo le istruzioni del produttore.
- Trasferire il surnatante dal punto 5.2 in un nuovo tubo e tenerlo a 37 ° C. Questa coltura verrà riutilizzata per coltura le cellule ordinate.
- Risospendere il pellet cellulare in buffer di separazione freddo per ottenere una concentrazione di 5 x 105 cellule / mL. Trasferire 1 x 105 celle in tubi di 1,5 mL per la macchiatura di isotipo e le celle rimanenti che verranno ordinate in altre provette da 1,5 mL.
- Centrifugare le provette a 400 x g per 15 min a 4 ° C.
- Eliminare il supernatante e risospendere il pellet di cellule in isotype macchiatura soluzione e il pellet di cellule che verranno ordinati nell'anticorpo che macchia la soluzione.
- Incubare per 30 min a 4 ° C.
- Aggiungere 450 µ l di tampone di separazione e centrifuga a 400 x g per 15 min a 4 ° C.
- Risospendere il pellet con 2 mL di tampone di separazione freddo.
- Per evitare che gli zoccoli, filtrare i campioni attraverso un 40 μm cella filtro e posto su ghiaccio fino al FACS.
- Classificatore celle di set-up per l'ordinamento con i parametri corretti.
- Eseguire isotipo campioni per impostare tensione e guadagno per la marcia avanti e dispersione laterale e identificare popolazioni fluorescenza negativa.
- Controlli di esecuzione singolo colore di fissare un coefficiente di compensazione e applicare compensata parametro di protocollo di raccolta.
- Eseguire una piccola aliquota del campione (Ab) (~ 50.000 eventi) per stabilire la strategia di gating.
- Impostare le decisioni di sorta per raccogliere il CD34+ CD90 frazione delle cellule– .
- Cellule di sorta nelle provette di raccolta rivestiti con 2 mL di tampone di separazione.
- Dopo la cernita, raccontano le cellule e loro Centrifugare a 400 x g per 15 min a 4 ° C.
- Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in media ha recuperati nel passaggio 5.5 per raggiungere una concentrazione finale di 3 x 104 cellule/mL.
- Piastra di CD34+ CD90– purificata cellule in 12 pozzetti con medie 1,5 mL/pozzetto (5 x 104 CD34+ CD90– cellule/1.5 mL di media/pozzetto).
- Valutare la purezza mediante analisi Citofluorimetrica, utilizzando 50 µ l di cellule contenenti media.
- Trattare le culture di CD34+CD90– cellule con VPA alla concentrazione finale di 1mM.
- Incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 .
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Representative Results
L'ex vivo protocollo descritto qui aumenta il numero di HSCs primitivo generato da CD34+ cellule isolate da UCBs (Figura 1). Priming di CD34+ cellule per 16 h con una citochina cocktail, seguita dal trattamento con VPA per un ulteriore 7 giorni, conduce ad un grande grado di espansione di HSC. Notevolmente, il pool di cellule espanse è altamente arricchito per HSCs, che sono definiti fenotipico di CD34+CD90+ marcatori. Il numero totale di cellule nucleate (TNCs) nelle culture trattate con la citochina cocktail da solo è significativamente più alto rispetto ai numeri delle cellule osservate nelle culture trattate con la citochina cocktail e VPA (Figura 2A). Nonostante il più alto numero di società transnazionali, il numero di HSCs nelle culture che ricevono la citochina cocktail da solo rimane basso durante il periodo di espansione intero rispetto alle colture trattate con la citochina cocktail e VPA (Figura 2B). Il maggior numero di HSCs viene generato nelle culture trattate con una combinazione della citochina cocktail e VPA (Figura 2B). In particolare, la più grande espansione nei numeri di HSCs è raggiunto dopo 5 – 7 giorni dopo il trattamento di VPA (Figura 2B). L'aumento del numero di HSCs correla con un rapido aumento della percentuale di HSCs, che è notevole all'interno di 24 h del trattamento di VPA (Figura 2). Mentre l'aumento della percentuale di HSCs è alta e mantenuto durante i primi 4 giorni di ex vivo cultura, diminuisce progressivamente dopo 5 – 7 giorni di trattamento con VPA (Figura 2). Tuttavia, questa diminuzione è inversamente correlata con un aumento del numero assoluto di HSCs.
D'importanza, il rapido aumento della percentuale di HSCs osservato in colture VPA trattato è dovuto all'acquisizione del fenotipo CD90. CD34+ le cellule che esprimono il CD90 fenotipica indicatore raggiunge quasi il 40%-45% delle cellule espanse ex vivo culture trattate con la citochina cocktail e VPA per 4 giorni (Figura 2,D). L'acquisizione del fenotipo CD90 è ulteriormente confermata dall'ex espansione vivo del CD34 altamente purificato+ cellule che mancanza di espressione del marcatore CD90. All'interno di 24 h del trattamento di VPA, quasi il 75% dell'ex vivo espanso cellule nelle colture iniziate con CD34 ordinato+CD90– cellule esprimono CD90 contro 0% delle cellule nelle colture contenenti la citochina cocktail da solo (Figura 2E). D'importanza, il fenotipo CD90 è altamente conservato durante i primi 4 giorni in ex vivo culture trattate con VPA (Figura 2E).
Figura 1: presentazione schematica di ex coltura espansione vivo. Purificato CD34+ cellule da UCBs sono pronti per 16 h in ex vivo cultura completato con una combinazione delle citochine indicate. Colture sono trattate con VPA (1mM) per altri 7 giorni. L'ex vivo cellule espanse possono poi essere trapiantate in topi NSG myoablated. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: il trattamento di VPA innesca l'acquisizione di CD90 conseguente l'espansione di un gran numero di HSCs. (A) numero assoluto di cellule nucleate vitali totale espanse ex vivo culture9. Purificato CD34 cellule di+ da UCBs descritto nella sezione 3 trattati con citochina cocktail da solo o una combinazione di citochina cocktail e VPA come descritto nella sezione 4 sono stati contati macchiando ioduro di propidio/arancio di acridina (n = 16). Numeri indicano giorni di trattamento con VPA, considerando che il PC indica il CD34 incolto primario+ cellule isolate da UCBs. (B, C) Numero assoluto e percentuale di CD34+CD90+ espanse durante 7 giorni in ex vivo culture di cellule trattate con cocktail di citochina da solo o una combinazione di citochina cocktail e VPA (n = 21). Percentuale di CD34+CD90+ cellule è determinata dall'analisi di citometria a flusso delle cellule hanno macchiato come descritto nella sezione 4. (D) analisi fenotipica di CD34 ordinato+ cellule da UCBs (punto 5.3) espanse ex vivo culture trattate come indicato per 4 giorni. Pannello sinistro indica la strategia di gating usando la macchiatura isotipo mentre gli altri pannelli indicano macchiate cellule espanse in colture contenenti citochina cocktail da solo o una combinazione di citochina cocktail con VPA. I numeri indicano la percentuale di CD34–CD90+ cellule, CD34+CD90 cellule– e CD34+CD90+ cellule. (E) percentuale di CD34+CD90+ cellule espanse nelle culture ha avviate con ordinato CD34+CD90 cellule da lattine di– e trattati con cocktail di citochina da solo o una combinazione di citochina cocktail e VPA per la giorni indicati. Percentuale è determinata dall'analisi di citometria a flusso (n = 4). N: numero di repliche biologiche. Barre di errore con SEM; p ≤ 0,0001 come determinato da modelli binomiale negativo per A e B, modelli Beta per D e 2-way ANOVA per pannello E. pannelli A – C ed E sono stati modificati dal Papa et al.9Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, presentiamo un protocollo per espandere rapidamente in modo significativo il numero di HSC umane funzionali da UCBs. Gli studi pilota e cinetici usando questo protocollo indicano che l'ex vivo cellule espanse prontamente acquisire e mantenere l'espressione di HSC diversi marcatori fenotipici tra cui CD90 così come primitivo HSC caratteristiche metaboliche9.
Questo ex vivo protocollo di espansione è relativamente semplice e affidabile. Purificazione di CD34+ le cellule con il dispositivo separatore cellulare (Vedi Tabella materiali) sono altamente riproducibile e rapido, consentendo per il recupero veloce delle cellule isolate. Questo metodo si traduce in un alto rendimento di CD34 purificato+ cellule (> 90%) al contrario di separazione immunomagnetica manuale. Inoltre, questo ex vivo protocollo di espansione non richiede speciali e complessi dispositivi o sistemi di fed-batch cultura che hanno bisogno di un approvvigionamento continuo di grandi volumi di fresco media completati con citochine3,13. Di conseguenza, questo metodo limita i costi. D'importanza, questo protocollo consente l'espansione del pool HSC in breve tempo, che è un fattore limitante per la frequenza di contaminazione.
Diversi punti dovrebbero essere considerati per il raggiungimento di HSCs primitivo da CD34+ cellule usando questo protocollo. CD34+ ampliate per 4 giorni in colture di cellule trattate con la citochina cocktail e VPA condurre alla generazione di un pool di primitivo HSCs a lungo termine. Questi HSCs sono caratterizzati non solo da livelli di alta espressione di CD34, CD90 e CD49f, ma anche da un profilo metabolico molto primitivo, che si basa principalmente sulla glicolisi9. Durante l'incubazione prolungata con VPA per 7 giorni, culture espanse tuttavia sono più eterogenee e contengono un maggior numero di entrambi a lungo termine e a breve termine come pure differenziato cellule al contrario di cellule espanse per 4 giorni. Questo risultato è dovuto principalmente all'esaurimento di VPA in cultura e aumento del numero di divisioni cellulari9. Così, questo protocollo può essere utilizzato per realizzare l'espansione di due diverse piscine di cellule: cellule espanse 4 giorni e 7 giorni. Il prodotto di espansione 7 giorni utilizzabile per trapianto allogeneic trapianto di HSC dove occorre più rapido attecchimento multilineare pure come sostiene. Il protocollo di espansione 4 giorni potrebbe essere più adatto per le strategie di modificazione genetica che le cellule di ripopolamento a lungo termine. È anche probabile che questa combinazione di VPA e cocktail di citochina può espandere il pool di HSCs da CD34+ cellule allo stesso grado o superiore quando si utilizzano supporti diversi media (Vedi Tabella materiali) utilizzati nel presente protocollo.
Modifica delle attuali procedure di gene sono associate a una perdita significativa di HSCs, che limitano la loro applicazione clinica. Il grande numero di HSCs primitivo raggiunto entro 2-4 giorni di trattamento di VPA in ex vivo culture ha il potenziale per superare questa perdita in numeri di HSC. Così, questo protocollo potrebbe essere utile per migliorare il gene esistente protocolli di editing e attivare la correzione delle mutazioni genetiche in terapie basate su trapianto di HSC per β-talassemia e anemia falciforme. Inoltre, può essere applicato per mantenere i numeri grandi di HSCs durante le manipolazioni di gene per studi focalizzati sulla delucidazione delle funzioni dei geni nelle HSC e nell'ematopoiesi.
In conclusione, il metodo qui descritto può essere utilizzato per ex vivo espansione di HSCs sia umane e murine e può essere adattato alle specifiche applicazioni cliniche anche per quanto riguarda un ampio spettro di indagini nella ricerca di base.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NYSTEM concedere C030136 a U.R. Vorremmo ringraziare Bartek Jablonski per il suo feedback e revisione del manoscritto
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expansion Media | Sigma-Aldrich | Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML | |
| AO/PI (acridine orange/propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. | Nexcelom | CS2-0106-25mL | |
| APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 | BD BIOSCIENCE | 555824 | |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 | BD BIOSCIENCE | 555751 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| BD Falcon 15 mL Tube | BD Biosciences | 352097 | |
| BD Falcon 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352063 | |
| BD Falcon 50 mL Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Bovine serum albumine solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-046-703 | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cell analyzer and sorter | BD Biosciences | FACS Aria II | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter | |
| Cell separator device | autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec | ||
| Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-PD100-002 | |
| Density gradient media | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 | BIOLEGEND | 328108 | |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | BIOLEGEND | 400109 | |
| Inverted microscope | |||
| PBS | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 308FKN | |
| Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) | R&D Systems | 203-IL | |
| Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC | |
| Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) | R&D Systems | 288-TP | |
| Total Antibody Compensation Bead Kit | thermofisher | A10497 | |
| Umbilical Cord-blood | Placental Blood Program at the New York Blood Center | http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/ | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | P4543 |
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