Summary
여기, 우리는 전 설명 CD34에서 조 혈 줄기 세포의 생체 내 확장+ 세포 탯 줄 혈액에서 파생 된 칵테일 cytokine VPA의 조합으로 치료. 이 메서드 중 하나에 대 한 기본 HSCs의 비보 확장 전의 상당한 정도로 리드 임상 또는 실험실 응용 프로그램.
Abstract
탯 줄 혈액 (UCB) 단위 수용자 골 수 이식 필요한 환자에 대 한 인간의 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 대체 소스를 제공 합니다. UCB는 몇 가지 고유한 장점, 재생 의학에 그들의 사용 및 성인 HSC 이식 각 UCB 단위 내의 HSCs의 제한 된 숫자 제한 합니다. 기능 인간의 HSCs의 효율적인 확장 ex vivo CD34의 경작에 의해 달성 될 수 있다+ 세포 UCBs에서 고립과 deacetylase 억제 물, valproic 산 (VPA)와 치료. 여기서 설명 하는 프로토콜에 설명 합니다 문화 조건 및 방법론을 빠르게 CD34+ 세포 높은 정도로 원시적인 HSCs의 수영장을 확장 하 고. 확장된 HSCs 모두 단기 및 장기 engraftment를 설정 할 수 있으며 모든 종류의 차별화 된 조 혈 모 세포를 야기할 수 있습니다. 이 메서드는 또한 헌 HSC 유전자 치료에서 임상 응용 프로그램에 대 한 잠재적인 보유 하 고 편집 하는 유전자와 관련 된 기능 HSCs의 손실을 극복 하는 매력적인 접근을 제공 합니다.
Introduction
탯 줄 혈액에서 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 비보 확장 전 (UCB) 단위 재생 의학 및 이식 치료에 HSC 응용 프로그램에 대 한 위대한 약속을 보유 하고있다. UCB 단위 이식 쉽게 컬렉션, 높은 가용성, 감염의 최소한의 위험, 저위험 질병 재발, 그리고 접목 대 주인 질병 (GVHD)의 낮은 주파수 몇 가지 독특한 장점이 있습니다. 그러나, 임상 설정에 그들의 사용의 주요 단점은 HSCs 각 UCB 단위1내 존재의 제한 된 수 있습니다. HSCs의 부족 수 지연된 engraftment 및 조 혈 복구, 이식 거부, 정도 벗어난 면역 재구성의 위험이 발생합니다.
현재, 다양 한 방법과 전략 비보 전 UCBs에서 HSCs의 제한 된 수 확장 개발 되었습니다. 작은 분자 또는 화합물에서 ex vivo 문화 결과 HSC 숫자2,3,,45,6, 확장의 다양 한 각도 다른 cytokine 칵테일의 조합 7,8. 중요 한 것은, ex vivo 문화 조건 유도 스트레스, 급속 한 세포 증식, 대사 활동 증가 주 HSCs를 정의 하는 기본 특성의 손실에 지도. 따라서, 개발 프로토콜을 기본 기본 HSCs 유사한 특성을 가진 기능 HSCs의 큰 숫자의 확장으로 이어질 필요 합니다.
혈 청 무료 문화 CD34의+ 셀 UCBs에서 고립 되 고 원시적인 HSCs4,,910의 다 수의 확장에 valproic 산 (VPA) 결과와 치료. HSC 확장 UCBs에서 파생 된 기존 HSCs의 확산 때문만 아니다. 대신,이 확장은 제한 된 수의 세포 분열과 증식9. 와 함께 기본 표현 형의 인수 때문 Cytokines 및 VPA, CD34의 조합 가진 외피의 초기 24-48 h 내+ 세포 transcriptomic 및 phenotypic 프로필 장기 HSCs 특성을 취득. HSCs의 비율이 크게 증가 HSCs (VPA 치료의 24 시간 이내 63 배 증가)9의 수에 있는 신속한 증가 동반 된다. 특히, VPA ex vivo 확장 전략 낮은 신진 대사 활동을 더 그들의 기본 특성을 강조 HSCs를 확장 합니다.
여기 설명 하는 방법을 제공 조건 및 트리 트 먼 트 중 하나에 대 한 기본 HSCs의 비보 확장 전 상당한 정도의 이어질 임상 또는 실험실 응용 프로그램. Ex vivo 확장 전략 cytokine 칵테일 VPA 치료와 함께 사용 합니다. VPA는 양극성 장애 및 다른 신경 질환의 치료에 대 한 FDA의 승인을 마약입니다. VPA HSC 확대 프롬프트 이며 조작의 시간와 오염 위험을 최소화 하는 7 일 이내 발생. 중요 한 것은,이 프로토콜은 마커의 장기 HSC phenotypic CD90 등 CD49f VPA9와 치료 다음과 24-48 시간 이내 수집에 대 한 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 만든 확장된 HSC 이식 이후 그들은 모든 조 혈 세포 계보에 분화 하 고 장기 engraftment myeloablated NSG 쥐로 이식 다음을 설정할 수 조 혈 시스템을 재생성 하기 위해 용량을가지고 모델4. 또한,이 프로토콜 매우 재현할 수 이며 수 가능한 CD34의 효율적이 고 신속한 격리에 대 한+ UCBs에서 세포는이 절차의 산업화에 대 한 중요 한.
Ex vivo 확장 프로토콜 VPA는 또한 유전자11편집 하는 동안 발생 HSCs의 중요 한 손실을 극복 하기 위해 잠재력이 있다. 편집 진 순환 세포와 DNA 수리 메커니즘의 활성화에 필요한 cytokines에 노출을 해야 합니다. 현재 관련 된 시간의 기간 내 유전자 변형된 세포의 더 높은 번호의 세대 활용 유전자 수정 프로토콜에 대 한 VPA 치료의 신속한 효과 인해이 메서드는 도움이 될 수 있습니다.
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Protocol
Ex vivo 확장 프로토콜 HSC 마운트 시 나이의 대학에 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
1. 버퍼 및 미디어 준비
- 분리 버퍼 절연 CD34의 이전 24 시간 준비+ 세포 Ubc에서 0.5 M 에틸렌 Diamine Tetra-아세트산 (EDTA)의 그리고 7.5%의 33 mL 2 mL를 추가 하 여 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 버퍼링 465 mL 식 염 수 (1 x PBS)를. 부드럽게 혼합 하 고 하룻밤 4 ° c.에 버퍼를 유지
- 정화의 날에 실내 온도에서 따뜻한 미디어.
2. 단 세포 (MNCs) UCB 단위에서의 고립
- 75 c m2 플라스 크에 전체 UCB 단위를 분배. 희석 하 고 부드럽게 실 온에서 PBS의 동등한 양을 가진는 UCB를 혼합.
- 튜브 (한 50 mL 원뿔 튜브 희석된 UCB의 35 mL을 처리 하는 데 사용할 수 있습니다) 전체 UCB 단위를 처리 하는 데 필요한 수를 결정 합니다. 각 튜브를 밀도 그라데이션 미디어 ( 재료의 표참조)의 15 mL를 추가 하 고 두 개의 레이어를 만드는 밀도 그라데이션 미디어 상단 희석된 UCB 분배.
참고: UCB와 밀도 그라데이션 미디어 계층의 혼합을 방지 하기 위해 45 ° 각도에서 튜브를 잡고 아주 천천히 희석된 UCB를 분배 하십시오. - 낮은 가속 및 감속 비율 30 분 400 x g 에서 원심. 원심, 후 MNCs는 플라즈마 밀도 그라데이션 미디어 층 사이의 흰색 레이어 (버 피 코트)에서 찾습니다.
- 버 피 코트 레이어를 방해 하지 않고는 플라즈마의 2/3를 천천히 발음. 신중 하 게 새로운 50 mL 튜브에 버 피 코트 레이어를 전송 합니다. 25 mL를 도달할 때까지 같은 UCB 단위 50 mL 튜브에 모든 MNCs 수집 합니다. 새로운 튜브를 사용 하 여 수집된 MNCs의 볼륨 25 mL를 초과 하는 경우.
- MNCs의 25 mL를 포함 하는 관으로 차가운 PBS의 25 mL를 추가 하 고 잘 혼합. 4 ° c.에서 10 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기
참고: 차가운 PBS는 세포 표면에 항 체의 상한 방지 하 고 일반적인 라벨을 감소 해야 합니다. - 신중 하 게는 상쾌한 발음 하 고 부드럽게 차가운 PBS의 50 ml에서에 다시 셀 펠 릿을 일시 중단.
- 계산을 위해 셀 서 스 펜 션의 20 μ를 제거 합니다. Acridine 오렌지/propidium 요오드 화물 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 얼룩으로 얼룩이 셀 수를 계산 합니다. MNCs의 총 수를 계산 합니다.
참고: 세포 수는 hemocytometer를 사용 하 여 trypan 블루 제외 방법으로도 수행할 수 있습니다. - 4 ° c.에서 15 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기
참고: 즉시 필요 하지 않은 경우이 단계에서 MNCs는 동결 수 있습니다.
3. 절연 CD34의+ UCBs에서 세포
- 준비는 CD34+ 항 체 결합 CD34의 절연을 위한 자석 구슬 솔루션+ 인간의 FcR 인간 IgG (차단 시 약)의 100 µ L와 CD34의 격리 CD34 자석 구슬의 100 µ L 분리 버퍼의 MNCs. 믹스 300 µ L에서 세포 + 에서 각 108 MNCs 셀. CD34의 더 높은 수의 격리에 대 한+ 세포에서 (> 108) MNCs, 그에 따라 시 약 최대 규모.
- 신중 하 게 단계 2.8에서 centrifuged 튜브에서 상쾌한 발음. 준비 단계 (108 셀 당 500 µ L의 솔루션을 사용 하 여) 3.1에서에서 CD34 자석 구슬 솔루션에 펠 릿을 resuspend.
- 부드럽게 혼합 하 고 30 분 동안 4 ° C에서 품 어.
참고: 셀 구분 장치 준비 ( 재료의 표참조) 인큐베이션 기간 동안. 제조업체의 지침에 표시 된 대로 작업 버퍼 스토리지 솔루션을 장착 하 고 헹 구는 프로그램 다음 세척 프로그램을 실행. - 튜브 완전히 채워집니다 때까지 셀 혼합물 포함 된 튜브에 버퍼를 실행 하는 차가운 셀 구분을 추가 합니다. 4 ° c.에서 15 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기
- 상쾌한 발음 하 고 차가운 셀 구분 실행 버퍼 (2 mL/108 셀)에 셀 펠 릿 resuspend. 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액 혼합물의 2 개 mL를 전송 합니다.
- 4 ° c.에 prechilled 셀 구분 랙에 15 mL 튜브의 부하 3 세트 튜브의 한 세트 포함 MNCs, 튜브의 두 번째 세트 부정적인 분수를 수집 하는 데 사용 됩니다 및 튜브의 3 세트 순화 CD34 수집 하는 데 사용 됩니다+ 세포.
- 랙 셀 구분 장치에 로드 하 고 posseld2 미리 프로그램을 실행.
참고: 셀 구분 장치12 대체 하 수동 자석 분리기를 이용 하는 대체 메서드를 사용할 수 있습니다. - 4 ° c.에서 15 분에 대 한 400 x g 에서 긍정적인 분수와 함께 원심 분리기 튜브 발음은 상쾌한 고 순화 된 CD34 resuspend+ 혈 청 자유로운 매체의 1 mL에 세포.
- 물 acridine 오렌지/propidium 요오드 화물 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
참고: 즉시 필요 하지 않은, 경우 정화 CD34+ 셀이이 단계에서 얼 수 있다.
4. VPA Ex Vivo 확장 순화 UCB CD34+ 세포의
- 충분 한 양의 미디어 순화 CD34 접시를 준비+ 3.3 x 104 셀/mL의 농도에서 세포. 문화 미디어 구성은 혈 청 무료 문화 매체와 10 µ L/mL 펜/strep, 150 ng/mL 줄기 세포 요소 (SCF), 100 ng/mL fms 같은 티로신 키 니 아 제 수용 체 3 (FLT3 ligand), 100 ng/mL thrombopoietin (TPO), 보충 ( 재료의 표참조) 및 50 ng/mL 인터 루 킨 (IL-3) 3.
- 플레이트 정화 CD34+ 12-잘 플레이트 세포 (5 x 104 CD34+ 셀 / 미디어의 1.5 mL / 잘)와 5% CO2 습도 인큐베이터에서 37 ° C에서 문화.
- 격리 된 CD34의 순수성 평가+ 세포와 세포 구성 FACS 분석에 의해 아래에 설명 된 단계에서 6.3.
- VPA 세포 cytokine 칵테일 16 h에 대 한 치료의 문화에 1mm의 최종 농도에 추가 합니다.
- 셀 5% CO2 습도 인큐베이터에서 37 ° C에 추가 7 일 문화.
참고: 미디어는 전 기간 동안 변경 되지 vivo 확장.
5입니다. 항 체 흐름 Cytometry 분석에 대 한 얼룩
- 2 × 104–6 x 104 의 세포와 FACS 게이팅 전략 결정에 isotype 솔루션 얼룩을 비 특정 바인딩 수준을 결정 항 체 얼룩이 솔루션을 준비 합니다. 항 체 (1/100 APC 안티-CD34, 1/200 FITC 안티-CD90)와 각각 isotypes 분리 버퍼의 50 µ L로 희석 (분리 버퍼의 구성 단계 1.1에에서 정의 됩니다).
참고: FMO 게이팅 전략에 대 한 각 항 체와 세포의 단일 얼룩을 수행 합니다. 총 항 체 보상 구슬 키트 보상 설치에 사용할 수 있습니다 ( 재료의 표참조). - 여러 번 pipetting으로 세포 배양을 균질. 1.5 mL 튜브에 셀과 피펫으로 5 x 104 셀을 계산 합니다.
- 실 온에서 15 분에 대 한 400 x g 에서 분리 버퍼 및 원심 분리기의 1 mL를 추가 합니다.
- 상쾌한 발음 하 고 얼룩 솔루션의 50 µ L에 펠 릿을 resuspend. 실 온에서 30 분에 대 한 셀을 품 어.
- 실 온에서 15 분에 대 한 400 x g 에서 분리 버퍼 및 원심 분리기의 450 µ L를 추가 합니다.
- 발음은 상쾌한 고 분리 버퍼의 100 µ L에 펠 릿을 resuspend. FACS 분석까지 적어도 5 분 동안 얼음에 셀을 계속. 실행 가능한 셀 게이트를 7-AAD의 1 µ L를 추가 합니다.
- FACS 기계에 얼룩진된 셀 샘플을 로드 하 고 최저 유량에 세포를 확보.
- 각 fluorophore isotype 컨트롤과 FITC (CD90), APC (CD34), 및 PerCP/Cy5.5 (7-AAD) 얼룩 게이팅 설정 단일 스테인드 셀을 분석 합니다.
- PerCP/Cy5.5 부정적인 분수와 플롯 APC 대 가능한 CD34의 비율을 결정 하는 FITC 게이트+, CD90+, 및 CD34+CD90+ 문화에서 HSPC/HSC 인구를 정의 하는 셀.
6. 항 체 흐름 Cytometry 셀 정렬 얼룩
- 여러 번 pipetting으로 확장된 셀을 resuspend. 셀 수를 계산 하 고 15 mL 또는 50 mL 튜브에 전체 문화를 전송.
- 감기 분리 버퍼 튜브를 채우기
- 4 ° c.에서 15 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기
- 얼룩 5 x 105-2 x 106 세포 항 체 얼룩이 솔루션 및 1 x 105 세포 얼룩 및 FACS 게이팅 결정 isotype 솔루션을 준비 합니다. 묽 게 1/10 (APC 안티-CD34), 1/20 (FITC CD90) 항 체와 분리의 500 µ L에 해당 isotypes 각 조건 마다 버퍼.
- 제조업체의 지침에 따라 전체 항 체 보상 구슬 키트를 사용 하 여 단일 색상 보정 컨트롤을 준비 합니다.
- 새로운 관으로는 상쾌한 단계 5.2에서에서 전송 하 고 37 ° c.에 그것을 유지합니다 이 문화 미디어 정렬된 셀 문화는 다시 사용 될 것입니다.
- 5 셀 5 x 10의 농도를 찬 분리 버퍼에 셀 펠 릿 resuspend / mL. 다른 1.5 mL 튜브에 isotype 얼룩에 대 한 1.5 mL 튜브에 1 x 105 셀과 정렬 될 나머지 셀을 전송.
- 400 x g 4 ° c.에 15 분 동안에 관을 원심
- 삭제는 상쾌한 고 isotype 솔루션 및 솔루션을 얼룩이 지는 항 체에 정렬 될 셀의 펠 릿을 얼룩에 셀의 펠 릿 resuspend.
- 4 ° c.에 30 분 동안 품 어
- 4 ° c.에서 15 분에 대 한 400 x g 에서 분리 버퍼 및 원심 분리기의 450 µ L를 추가
- 차가운 분리 버퍼의 2 mL와 펠 릿 resuspend
- 나 막 신 방지 하기 위해 FACS까지 40 μ m 셀 스 트레이너와 얼음에 장소를 통해 샘플을 필터링 합니다.
- 설정 매개 변수를 올바른 정렬 셀 정렬.
- 설정 전압 및 앞으로 대 한 이득 및 사이드 분산형 및 부정적인 형광 인구 식별 isotype 샘플을 실행 합니다.
- 보정 계수를 설정 하 고 적용 실행된의 단일 색상 컨트롤 매개 변수 컬렉션 프로토콜을 보상.
- 제어 전략 수립 (Ab) 샘플 (~ 50000 이벤트)의 작은 약 수를 실행 합니다.
- 정렬 결정은 CD34 수집 설정+ CD90- 셀 분수.
- 정렬 셀 컬렉션 튜브 2 mL 분리 버퍼 코팅.
- 정렬 후 셀 재검표와 4 ° c.에서 15 분에 대 한 400 x g 에서 원심
- 상쾌한 취소 하 고 단계 3 x 104 셀/mL의 최종 농도 도달 하는 5.5에서에서 복구 미디어에는 펠 릿을 resuspend.
- CD34 접시+ CD90- 셀 1.5 mL 매체/잘 12-잘 접시에 정화 (5 x 104 CD34+ CD90의 미디어/- 셀/1.5 mL).
- FACS 분석 미디어 포함 된 셀의 50 µ L를 사용 하 여 순도 평가 합니다.
- CD34의 문화 치료+CD90 1mm 최종 농도에서 VPA와- 셀.
- 5% CO2 습도 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어.
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Representative Results
비보 전 여기에 설명 된 프로토콜 기본 HSCs CD34에서 생성의 수를 증가+ UCBs (그림 1)에서 분리 하는 세포. CD34의 못쓰게+ 칵테일, cytokine로 16 h에 대 한 셀 뒤 VPA 치료 HSC 확장의 훌륭한 정도를 추가 7 일 리드에 대 한. 확장된 셀의 수영장 HSCs phenotypically CD34에 의해 정의 되는 대 한 높은 농축 놀랍게도,+CD90+ 마커. Cytokine 칵테일로 혼자 치료 하는 문화에서 nucleated 세포 (TNCs)의 총 수 문화 치료 cytokine 칵테일와 VPA (그림 2A)에서 관찰 하는 셀의 숫자 보다 상당히 높은 수준 이다. TNCs, 수의 높은 숫자에도 불구 하 고는 cytokine 받는 문화에 HSCs의 칵테일 혼자 치료 cytokine 칵테일 VPA (그림 2B)와 문화에 비해 전체 확장 기간 동안 낮은 유지. HSCs의 많은 수는 VPA (그림 2B)와 칵테일 cytokine의 조합으로 치료 하는 문화에서 생성 됩니다. 특히, HSCs의 숫자에서 가장 큰 확장 VPA 치료 (그림 2B)에 따라 5-7 일 후에 도달 된다. HSCs의 증가 수는 VPA 치료 (그림 2C)의 24 시간 이내 주목할 만한 HSCs의 비율에 신속한 증가와 상관 한다. HSCs의 비율에 있는 증가 높은 vivo 문화 전의 첫 4 일 동안 유지, VPA (그림 2C)와 치료의 5-7 일 후에 점차적으로 저하 됩니다. 그러나,이 감소는 반대로 HSCs의 절대 수의 증가와 상관 된다.
중요 한 것은, VPA 대우 문화에서 관찰 HSCs의 비율의 급속 한 증가 CD90 표현 형의 인수 예정 이다. CD34 phenotypic CD90 표현 셀 표식 도달 거의 40%-45%의 셀+ ex vivo 문화 4 일 (그림 2C,D)에 대 한 치료는 cytokine 칵테일와 VPA에 확장. CD90 표현 형의 취득은 더 높은 정화 CD34의 비보 확장 전 확인+ 세포 CD90 마커의 부족 식. VPA 치료, 전의 거의 75%의 24 시간 이내 vivo 확장 셀 정렬된 CD34 시작 문화에+CD90- 셀 문화는 cytokine을 포함 하는 셀의 0% 반대 CD90 익스프레스 칵테일 혼자 (그림 2E). 중요 한 것은, CD90 형 ex vivo 문화 VPA (그림 2E)으로 치료에서 첫 4 일 동안 높게 유지 됩니다.
그림 1: 도식 프레 젠 테이 션 ex vivo 확장 문화. CD34 정화+ UCBs에서 세포는 ex vivo 문화 표시 cytokines의 조합으로 보충에 16 h에 대 한 준비가 끝났다. 문화는 추가 7 일 VPA (1 mM)으로 처리 됩니다. ex vivo 확장 된 셀 수 있습니다 다음 myoablated NSG 쥐에 이식 수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: VPA 치료 HSCs의 큰 숫자의 확장의 결과로 CD90 인수 트리거합니다. (A) 총 가능한 nucleated 세포 vivo 문화9전 확장의 절대 수입니다. CD34 정화 cytokine 칵테일로 혼자 치료 섹션 3에서에서 설명 하는 UCBs에서+ 세포 또는 칵테일 cytokine의 조합 및 VPA 4 섹션에 설명 된 대로 acridine 오렌지/propidium 요오드 화물 얼룩에 의해 계산 되었다 (n = 16). 반면 PC는 기본 요 CD34 숫자 VPA, 치료의 일을 나타내는+ UCBs에서 분리 하는 세포. (B, C) 절대 수와 CD34의 비율+CD90+ ex vivo 문화에서 7 일간에 걸쳐 확장 하는 세포 치료와 cytokine 칵테일 혼자 또는 한 cytokine 칵테일의 조합 VPA (n = 21). CD34의 비율+CD90+ 세포 스테인드 섹션 4에서에서 설명한 대로 셀의 흐름 cytometry 분석에 의해 결정 됩니다. (D) 정렬 된 CD34의 Phenotypic 분석+ UCBs (5.3 단계) ex vivo 문화 4 일 같이 처리에 확장에서 세포. 왼쪽된 패널은 다른 패널 스테인드 세포 cytokine 칵테일 혼자 또는 cytokine VPA 칵테일의 조합을 포함 하는 문화에서 확장 나타냅니다 반면 isotype 얼룩을 사용 하 여 제어 전략을 나타냅니다. CD34의 백분율을 표시 하는 숫자-CD90+ 세포, CD34+CD90- 세포와 CD34+CD90+ 세포. CD34 비율 (E)+CD90+ 와 함께 시작 하는 문화에서 확장 하는 셀 정렬 CD34+CD90- Ubc에서 세포 및 사이토카인 칵테일 혼자 또는 칵테일 cytokine의 조합 및 VPA에 대 한 치료는 지정된 일입니다. 백분율 흐름 cytometry 분석에 의해 결정 됩니다 (n = 4). N: 수 생물 복제합니다. 오차 막대가 SEM; p ≤ 0.0001 A와 B, D 및 2-웨이 ANOVA 패널 E. 패널 A-C와 E에 대 한 베타 모델 아빠 외.9에서 수정 된에 대 한 부정적인 이항 모델을 정한이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리는 빠르게 확장 하는 상당한 정도로 기능 인간의 HSCs의 수 UCBs에서 프로토콜을 제시. 이 프로토콜을 사용 하 여 파일럿 및 키네틱 연구 나타냅니다는 비보 전 확장된 셀 즉시 획득 및 여러 HSC phenotypic 마커 CD90 원시 HSC 대사 특성9등의 식을 유지.
Ex vivo 확장 프로토콜 이것은 비교적 간단 하 고 신뢰할 수 있는입니다. CD34의 정화+ 셀 셀 구분 장치 ( 재료의 표참조)는 높은 재현 하 고 급속 한, 고립 된 세포의 빠른 회복을 위해. 이 방법은 정화 CD34의 높은 수익률에 결과+ 셀 (> 90%) 로 수동 immunomagnetic 분리에 반대 했다. 또한, ex vivo 확장 프로토콜이 특별 하 고 복잡 한 장치 또는 많은 양의 신선한 미디어 cytokines3,13보충의 연속 공급을 필요로 하는 먹이 배치 문화 시스템 필요 하지 않습니다. 따라서,이 방법은 비용을 제한합니다. 중요 한 것은,이 프로토콜은 오염 주파수에 대 한 중요 한 제한 요소는 짧은 시간 내에 HSC 수영장의 확장에 대 한 수 있습니다.
CD34에서 원시 HSCs를 달성 하기 위한 몇 가지 포인트를 고려 한다+ 이 프로토콜을 사용 하 여 셀. CD34+ 4 일 문화에 대 한 확장 셀 치료 cytokine 칵테일와 기본 장기 HSCs의 수영장의 세대에 VPA 리드. 이러한 HSCs는 CD34, CD90, CD49f의 높은 식 수준에 의해 뿐만 아니라 분해9에 주로 의존 하는 매우 원시적인 신진 대사 프로필에 의해 특징 이다. 그러나 7 일 VPA에 더 장기간된 부 화, 동안 확장 된 문화 더 이기종은 모두 장기의 큰 숫자를 포함 고 뿐만 아니라 단기 분화 세포 세포 4 일에 대 한 확장에 반대. 이 결과 주로 문화 및 셀 분할9의 증가 수에 VPA의 고갈 예정 이다. 따라서,이 프로토콜 셀의 두 개의 서로 다른 풀의 확장을 달성 하기 위해 사용할 수 있습니다: 4 일과 7 일 확장된 셀. 7 일 확장 제품 수용자 HSC 이식에 대 한 더 빠른 뿐만 아니라 지속적인된 multilineage engraftment가 필요한 사용할 수 있습니다. 4 일 확장 프로토콜 대상 장기 repopulation 세포 유전 수정 전략에 대 한 가장 적합 한 수 있습니다. 그것은 또한 VPA 및 cytokine 칵테일의이 조합은에서 CD34 HSCs의 풀을 확장할 수 있는 가능성이+ 세포 이상 동일한 학위에서이 프로토콜에 사용 된 미디어 ( 재료의 표참조) 이외의 미디어를 사용 하는 경우.
현재 유전자 편집 절차 그들의 임상 응용 프로그램 제한 HSCs의 중대 한 손실과와 연결 됩니다. Ex vivo 문화에서 VPA 치료 2-4 일 이내에 달성 하는 원시적인 HSCs의 큰 숫자 HSC 숫자에이 손실을 극복 가능성이 있다. 따라서,이 프로토콜 프로토콜 편집 기존 유전자를 개선에 도움이 될 수 있습니다 고 HSC 이식 기반 요법 β-thalassemia를 낫 세포 질병 유전자 변이의 교정 활성화. 또한, 그것은 유전자 조작 유전자 기능 HSCs와 조의 설명에 초점을 맞춘 연구 동안 HSCs의 큰 숫자를 유지 하기 위해 적용할 수 있습니다.
끝으로, 여기에 설명 하는 방법을 ex vivo 인간과 murine HSCs의 확장에 사용할 수 있습니다 그리고 특정 임상 응용 프로그램 뿐만 아니라 다양 한 스펙트럼의 기초 연구에 조사에 지 어질 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NYSTEM에 의해 지원 되었다 상대습도를 C030136 부여 우리는 그의 의견 및 원고 수정에 대 한 Bartek 피부색을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expansion Media | Sigma-Aldrich | Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML | |
| AO/PI (acridine orange/propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. | Nexcelom | CS2-0106-25mL | |
| APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 | BD BIOSCIENCE | 555824 | |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 | BD BIOSCIENCE | 555751 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| BD Falcon 15 mL Tube | BD Biosciences | 352097 | |
| BD Falcon 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352063 | |
| BD Falcon 50 mL Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Bovine serum albumine solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-046-703 | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cell analyzer and sorter | BD Biosciences | FACS Aria II | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter | |
| Cell separator device | autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec | ||
| Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-PD100-002 | |
| Density gradient media | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 | BIOLEGEND | 328108 | |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | BIOLEGEND | 400109 | |
| Inverted microscope | |||
| PBS | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 308FKN | |
| Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) | R&D Systems | 203-IL | |
| Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC | |
| Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) | R&D Systems | 288-TP | |
| Total Antibody Compensation Bead Kit | thermofisher | A10497 | |
| Umbilical Cord-blood | Placental Blood Program at the New York Blood Center | http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/ | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | P4543 |
References
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