Summary
Здесь мы описываем ex vivo расширение гемопоэтических стволовых клеток из CD34+ клетки, полученные из пуповинной крови, рассматривают с комбинацией цитокина коктейль и VPA. Этот метод приводит к в значительной степени ex vivo расширения примитивных СКК либо клинических или лабораторных приложений.
Abstract
Пуповинной крови (УКБ) единиц предоставляют альтернативный источник гемопоэтических стволовых клеток человека (СКК) для пациентов, которым требуется трансплантация аллогенных костного мозга. В то время как UCB имеет ряд уникальных преимуществ, ограниченное количество СКК в рамках каждого подразделения UCB ограничивает их использование в регенеративной медицине и трансплантации ГСК в взрослых. Эффективное расширение функциональных человека СКК может быть достигнуто путем ex vivo культивирование CD34+ клетки изолированы от UCBs и обработанных с ингибиторов деацетилаз, вальпроевая кислота (VPA). Протокол, здесь подробно описывает условия культуре и методологии быстро изолировать CD34+ клеток и расширить в высокой степени пул примитивных СКК. Расширенный СКК способны установления краткосрочных и долгосрочных приживления и способны вызвать все виды дифференцированных гемопоэтических клеток. Этот метод также имеет потенциал для клинического применения аутологичных HSC генной терапии и обеспечивает привлекательный подход к преодолеть потерю функциональных СКК, связанный с геном редактирования.
Introduction
Ex vivo расширение гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови (СКК) единиц (УКБ) открывает большие перспективы для HSC приложений в регенеративной медицины и терапии трансплантация. Пересадка с UCB единиц имеет некоторые уникальные преимущества, такие как простой коллекции, высокой доступности, минимальный риск инфекции, низкий риск рецидива заболевания и низкой частоты трансплантат против болезни хост (GVHD). Однако основные недостатки их использования в клинических условиях являются ограниченное количество СКК в рамках каждой UCB блока1. Недостаточное количество результатов СКК в задержки приживления и кроветворная восстановления, риск трансплантата и аномальные иммунного восстановления.
В настоящее время различные методы и стратегии были разработаны для ex vivo развернуть ограниченное количество СКК от UCBs. Комбинации различных цитокинов коктейлей с малых молекул или соединений в ex vivo культур результат в различной степени расширения в HSC чисел2,3,4,5,6, 7,8. Главное ex vivo культуры условия вызывают стресс, приводит к быстрому пролиферации, повышенной метаболической активности и потери примитивных характеристик, определяющих первичный СКК. Таким образом необходимы развивающиеся протоколы, которые приводят к расширению большое количество функциональных СКК с характеристиками, которые напоминают первичной примитивных СКК.
Сыворотка свободной культуры CD34+ клетки изолированы от UCBs и относились с вальпроевая кислота (VPA) результат в расширении большого числа примитивных СКК4,9,10. HSC расширение обусловлено не только распространение существующих СКК, производный от UCBs. Вместо этого это расширение связано приобретение примитивных фенотип, в сочетании с ограниченным количество клеточных делений и распространения9. В течение первоначального 24-48 ч инкубации с сочетанием цитокинов и VPA, CD34+ клетки приобретают транскриптомики и фенотипические профиля, которые характеризуют долгосрочное СКК. Значительное увеличение доли СКК сопровождается быстрое увеличение числа СКК (63 раз увеличение в течение 24 ч лечения VPA)9. В частности стратегия расширения VPA-ex vivo расширяет СКК с низкой метаболической активности, который далее подчеркивается их примитивным характеристики.
Метод, описанный здесь обеспечивает условия и процедуры, которые приводят к в значительной степени ex vivo расширения примитивных СКК либо клинических или лабораторных приложений. Это ex vivo стратегия расширения использует цитокина коктейль, в сочетании с лечением VPA. VPA-FDA утвержденных препарат для лечения биполярных расстройств и других неврологических заболеваний. HSC расширение с VPA оперативного и происходит в течение 7 дней, свести к минимуму риск загрязнения и время манипуляции. Важно отметить, что этот протокол позволяет для приобретения долгосрочных HSC фенотипические маркеры например CD90 и CD49f в течение 24-48 ч после лечения с VPA9. Расширенный HSC графтов, созданные с настоящим Протоколом обладают способностью регенерировать кроветворной системы, поскольку они могут дифференцироваться в всех линий гемопоэтических клеток и создать долгосрочные приживления после трансплантации в myeloablated ГЯП мышей модели4. Кроме того, этот протокол является весьма воспроизводимость и позволяет для эффективной и быстрой изоляции жизнеспособных CD34+ клеток от UCBs, который имеет решающее значение для индустриализации этой процедуры.
VPA ex vivo расширения протокола также имеет потенциал, чтобы преодолеть значительные потери СКК, которая происходит во время редактирования11ген. Джин редактирования требует воздействия цитокины, которые необходимы для велосипедного клеток и активации ДНК ремонт механизмов. Вследствие быстрого воздействия VPA лечения этот метод может быть полезным для поколения большее количество генетически модифицированных клеток в течение определенного периода времени, которое имеет отношение к в настоящее время используются протоколы изменения гена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HSC ex vivo расширения протокола соответствует руководящим принципам Комитета по этике исследований на Маунт Синай школы медицины.
1. буфер и подготовка СМИ
- Подготовить разделения буфера за 24 часа до изоляции CD34+ клеток от UBCs, добавив 2 мл 0,5 М этилена диамин тетра уксусной кислоты (ЭДТА) и 33 мл 7,5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) для буферизации 465 мл физиологического раствора (ПБС). Осторожно перемешать и поддерживать буфер на ночь при 4 ° C.
- Теплый СМИ при комнатной температуре в день очищения.
2. изоляция мононуклеарных клеток (МНК) от UCB блока
- Отказаться от UCB целое в колбе2 75 см. Разбавить и осторожно перемешать УКБ с равным объемом PBS при комнатной температуре.
- Определите количество трубок, необходимый для обработки весь блок UCB (одно из 50 мл Конические трубки может использоваться для обработки 35 мл разбавленной UCB). Добавьте 15 мл плотности градиента СМИ (см. Таблицу материалов) к каждой пробке и отказаться от разбавленных UCB на вершине СМИ градиента плотности, создание двух слоев.
Примечание: Отказаться от разбавленных UCB очень медленно держа трубку под углом 45° для предотвращения смешивания слоя плотность градиента СМИ с UCB. - Центрифуга на 400 x г за 30 мин при низкой скорости ускорение и замедление. После центрифугирования МНК найти в белый слой (Баффи пальто) между плазмы и плотность слоя градиента СМИ.
- Медленно аспирационная 2/3 плазмы не нарушая Баффи слой. Тщательно перенесите Баффи слой в новый Тюбик 50 мл. Соберите все МНК от одной и той же единице UCB в 50 мл трубки до достижения 25 мл. Используйте новые трубки, если объем собранных МНК превышает 25 мл.
- Добавить 25 мл холодного PBS в пробирку, содержащую 25 мл МНК и хорошо перемешать. Центрифуга на 400 x g 10 мин при 4 ° C.
Примечание: Холодные PBS имеет важное значение для предотвращения укупорки антител на поверхности клеток и уменьшить неспецифичный Этикетировочный. - Тщательно удалить супернатант и нежно вновь приостановить Пелле клеток в 50 мл холодного PBS.
- Удаление 20 мкл суспензии клеток для подсчета. Подсчет клеток окрашенных с акридин оранжевый/пропидий йодидом окрашивание с помощью счетчика автоматизированные ячейки. Рассчитайте общее количество МНК.
Примечание: Число ячеек может также осуществляться Трипановый синий исключения метод с помощью Горяева. - Центрифуга на 400 x g 15 мин при 4 ° C.
Примечание: Если не требуется немедленно, ТНК могут быть заморожены на данном этапе.
3. изоляция CD34+ клеток от UCBs
- Подготовьте CD34+ антител в сочетании с магнитной бусины решение для изоляции CD34+ клеток от МНК. микс 300 мкл буфера разделения с 100 мкл человека IgG человека FcR (блокирующий реагент) и 100 мкл CD34 магнитные бусы для изоляции CD34 + клетки от каждого 108 МНК. Для изоляции большее количество CD34+ клетки (> 108) МНК, масштабировать реагентов соответственно.
- Тщательно удалить супернатант из пробирки центрифугировали на шаге 2.8. Ресуспензируйте гранулы в решении магнитные бусы CD34, подготовленную на этапе 3.1 (используйте 500 мкл раствора на 108 ячеек).
- Осторожно перемешать и Инкубируйте на 4 ° C на 30 мин.
Примечание: Подготовьте устройство сепаратор клеток (см. Таблицу материалы) во время инкубационного периода. Замените буфера рабочей решение хранения, как указано в инструкции изготовителя и запустите программу стирки, следуют программу полоскания. - Добавьте холодной камере сепаратор работает буфер в пробирку, содержащую ячейку смесь до тех пор, пока трубка полностью заполнены. Центрифуга на 400 x g 15 мин при 4 ° C.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в холодной камере сепаратор работает буфер (2 мл/108 ячеек). Перевод 2 мл смеси подвеска клеток на 15 мл пробирок.
- Загрузка 3 комплекта трубок 15 мл в стойку сепаратор клеток, prechilled на 4 ° C. Один набор трубок содержит МНК, второй набор трубок будет использоваться для сбора негативные дроби и третий набор трубы будут использоваться для сбора очищенной CD34+ клеток.
- Загрузить стойки в Мобильный сепаратор устройство и запустить предустановленной программы posseld2 .
Примечание: Альтернативный метод, который использует ручной магнитный сепаратор может использоваться для замены устройства Сепаратор клетки12 . - Пробирок с позитивным дроби на 400 x g 15 мин при 4 ° C. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте очищенный CD34+ клеток в 1 мл сыворотки свободных средств массовой информации.
- Подсчет количества ячеек, окрашенных с акридин оранжевый/пропидий йодидом, используя счетчик автоматизированных клеток.
Примечание: Если не требуется немедленно, очищенный CD34+ клетки могут быть заморожены на данном этапе.
4. VPA Ex Vivo расширение очищенный УКБ-CD34+ клеток
- Подготовка достаточного объема средств массовой информации для пластины очищенный CD34+ клеток на плотность 3,3 х 104 клеток/мл. Состав культуры средств массовой информации является сыворотка бесплатно питательной среды (см. Таблицу материалы) дополнены 10 мкл/мл перо/стрептококк, 150 нг/мл стволовых клеток фактора (SCF), 100 нг/мл fms как тирозин киназы рецепторов 3 (FLT3 лигандом), 100 нг/мл thrombopoietin (ТПО), и Интерлейкин 50 нг/мл 3 (IL-3).
- Пластина очищенного CD34+ клеток в пластине 12-ну (5 х 104 CD34+ клетки / 1,5 мл средства массовой информации / хорошо) и культуры при 37 ° C в 5% CO2 увлажненные инкубатора.
- Оценить чистоту изолированных CD34+ клеток и клеточного состава СУИМ анализа как описано ниже в шаге, 6.3.
- Добавление VPA в конечной концентрации 1 мм в культурах клеток, лечение от 16 h с цитокина коктейль.
- Культура клетки еще 7 дней при 37 ° C в 5% CO2 увлажненные инкубатора.
Примечание: Средства массовой информации остается неизменным во время продолжительности ex vivo расширение.
5. антитело пятная для потока Cytometry анализ
- Приготовляют раствор антител окрашивание пятно 2 x 10-4-6 x 104 клетки и изотипа решение определить СУИМ стробирования стратегию и определить уровень неспецифической привязки. Разбавьте антитела (1/100 APC анти CD34, 1/200 FITC анти CD90) и соответствующие изотипов в 50 мкл буфера разделения (состав разделения буфера определяется на этапе 1.1).
Примечание: Выполнение единого пятная клетки с каждого антитела для FMO стробирования стратегии. Комплект из бисера компенсации всего антитела (см. Таблицу материалы) может использоваться для установки компенсации. - Гомогенизации культуры клеток, закупорить несколько раз. Граф и пипетки 5 х 104 ячейки в 1,5 мл трубку.
- Добавьте 1 mL разделения буфера и центрифуги на 400 x g 15 мин при комнатной температуре.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 50 мкл окрашивание раствора. Инкубируйте клетки для 30 мин при комнатной температуре.
- Мкл 450 разделения буфера и центрифуги на 400 x g 15 мин при комнатной температуре.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл буфера разделения. Держите клетки на льду, по крайней мере 5 минут до анализ СУИМ. 1 мкл 7-AAD для ворот жизнеспособных клеток.
- Загрузить образец окрашенных клеток на машине СУИМ и приобрести клетки на низкой скорости потока.
- Для каждого Флюорофор анализировать изотипа управления и единого окрашенных клеток настроить стробирования FITC (CD90), APC (CD34) и окрашивание PerCP/Cy5.5 (7-AAD).
- Задвижка PerCP/Cy5.5 негативные фракции и сюжет APC против FITC для определения процента жизнеспособных CD34+, CD90+и CD34+CD90+ клетки, которые определяет HSPC/HSC населения в культуре.
6. антитело пятная для потока Cytometry ячейку Сортировка
- Ресуспензируйте расширенной клетки, закупорить несколько раз. Подсчитать ячейки и передачи всей культуры в 15 мл или 50 мл трубку.
- Заполните вверх по трубе с холодной разделения буфера
- Центрифуга на 400 x g 15 мин при 4 ° C.
- Подготовьте Пятнать антитела решение пятно 5 x 105– 2 x 106 клеток и решение изотипа пятно 1 х 105 клетки и определить стробирования СУИМ. Разбавить 1/10 (APC анти CD34), 1/20 (FITC-CD90) антител и соответствующий изотипов в 500 мкл разделения буфера за каждое условие.
- Подготовьте элементы компенсации одного цвета, с использованием всего антитела комплекта шарик компенсации согласно инструкциям производителя.
- Передача от шага 5.2 супернатант в новой трубки и держать его при температуре 37 ° C. Эта культура СМИ будет повторно для культуры сортировки клеток.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в холодной разделения буфер для получения концентрации 5 x 105 клеток / мл. Перевести 1 х 105 клеток в 1,5 мл пробирок для окрашивания изотипа и остальные клетки, которые будут отсортированы в другие 1.5 мл пробирок.
- Центрифуга для трубы на 400 x g 15 мин при 4 ° C.
- Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы клеток в изотипа окрашивание раствора и Пелле клеток, которые будут отсортированы в антитело пятная решения.
- Инкубируйте 30 мин при 4 ° C.
- 450 мкл буфера разделения и центрифуги на 400 x g 15 мин при 4 ° C.
- Ресуспензируйте окатышей с 2 мл холодного разделения буфера.
- Чтобы предотвратить Сабо, фильтр образцы через 40 мкм ячейки сита и место на льду до СУИМ.
- Настройка ячейки сортировщик для сортировки с правильными параметрами.
- Образцы выполнения изотипа установки напряжения и получить вперед и стороне разброс и выявить негативные флуоресценции населения.
- Контроль выполнения одного цвета компенсации коэффициенты и применить компенсацию параметра коллекции протокола.
- Запустите небольшой Алиготе (Ab) образца (~ 50 000 события) создать шлюзовой стратегии.
- Настройка сортировки решений для сбора CD34+ CD90– клетки дроби.
- Сортировка ячеек в коллекции пробирках, покрытых 2 мл разделения буфера.
- После сортировки, пересчет ячеек и центрифуги их на g 400 x 15 мин при 4 ° C.
- Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в средствах массовой информации, восстановленные в шаге 5.5 до конечной концентрации 3 х 104 клеток/мл.
- Пластина CD34+ CD90– очищенной ячейки в 12-ну пластины с 1,5 мл средний/хорошо (5 х 104 CD34+ CD90– клетки/1.5 мл медиа/скважины).
- Оцените чистоту анализ СУИМ, используя 50 мкл СМИ содержащих клеток.
- Лечить культур CD34+CD90– клетки с VPA в 1mM концентрации выпускных экзаменов.
- Инкубируйте при 37 ° C в 5% CO2 увлажненные инкубатора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ex vivo протокол описанный здесь увеличивает количество примитивных СКК, образующиеся CD34+ клетки изолированы от UCBs (рис. 1). Грунтование CD34+ клетки для 16 h с цитокина коктейль, следуют обращения с VPA еще 7 дней, ведет в большой степени HSC экспансии. Удивительно, пул расширенной клеток сильно обогащенный для СКК, которые определяются фенотипически CD34+CD90+ маркеров. Общее число ядерных клеток (ТНК) в культурах относились с коктейль цитокина одиночку значительно выше, чем количество клеток наблюдается в культурах относились с цитокина коктейль и VPA (рис. 2A). Несмотря на большее количество ТНК, число из СКК в культурах, получающих цитокина коктейль только остается низким в период всего расширения, по сравнению с культурами, относились с цитокина коктейль и VPA (рис. 2B). Наибольшее количество СКК генерируется в культурах, лечение с комбинации цитокина коктейль и VPA (рис. 2B). В частности наибольшее расширение числа СКК достигается через 5-7 дней после лечения VPA (Рисунок 2Б). Увеличение количества СКК коррелирует с быстрое увеличение доли СКК, который отличается в течение 24 ч VPA лечения (рис. 2 c). В то время как увеличение доли СКК является высоким и поддерживается в течение первых 4 дней ex vivo культуры, она снижается постепенно после 5-7 дней лечения с VPA (рис. 2 c). Однако это уменьшение обратно коррелирует с увеличением абсолютное количество СКК.
Важно отметить, что быстрое увеличение доли наблюдаются в VPA лечение культур СКК связано приобретение CD90 фенотип. CD34+ клетки, выражая CD90 фенотипических маркеров достигает почти 40 – 45% клеток расширена в ex vivo культур, относились с цитокина коктейль и VPA для 4 дней (рис. 2 c,D). Приобретение CD90 фенотип далее подтверждается ex vivo расширение высокоочищенных CD34+ клетки что отсутствие выражение CD90 маркера. В течение 24 ч VPA лечения, почти 75% ex vivo расширил клетки в культурах с отсортированных CD34+CD90– клетки Экспресс CD90 отличие от 0% клеток в культурах, содержащие цитокина коктейль только (Рисунок 2E). Важно отметить, что фенотип CD90 высоко сохраняется в течение первых 4 дней в ex vivo культур, получавших VPA (Рисунок 2E).
Рисунок 1: схема представления ex vivo расширение культуры. Очищенный CD34+ клеток от UCBs грунтовать для 16 h в ex vivo культуры дополнены с комбинацией указанных цитокинов. Культур относятся с VPA (1 мм) еще 7 дней. Ex vivo расширенной клетки затем могут быть трансплантированы в myoablated ГЯП мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: VPA лечения триггеров на приобретение CD90 приводит к расширению большое количество СКК. (A) абсолютное количество всего жизнеспособные ядерных клеток, расширена в ex vivo культур9. Очищенный CD34+ клеток от UCBs, описанных в разделе 3 относились с цитокина коктейль один или комбинацию цитокина коктейль и VPA, как описано в разделе 4 были подсчитаны путем пятнать оранжевый/пропидий йодидом акридин (n = 16). Цифры обозначают дней лечения с VPA, в то время как PC обозначает первичный uncultured CD34+ клетки изолированы от UCBs. (B, C) Абсолютное число и процент CD34+CD90+ клетки, расширена на протяжении 7 дней ex vivo культур в лечение с цитокина коктейль один или комбинацию цитокина коктейль и VPA (n = 21). Процент CD34+CD90+ клетки определяется поток cytometry анализ клеток, витражи, как описано в разделе 4. (D) фенотипического анализа отсортированных CD34+ клеток от UCBs (шаг 5.3) расширил в ex vivo культур, как указано на 4 дня. Левая панель указывает стробирования стратегию с использованием изотипа пятнать в то время как другие панели показывают, окрашенных клеток расширена в культурах, содержащих цитокина коктейль один или комбинацию цитокина коктейль с VPA. Цифры обозначают процент CD34–CD90+ клеток, CD34+CD90– клетки и CD34+CD90+ клеток. (E) процент CD34+CD90+ клетки, расширена в культурах с сортировка CD34+CD90– клеток от UBCs и относились с цитокина коктейль один или комбинацию цитокина коктейль и VPA для указанные дни. Процент определяется поток cytometry анализ (n = 4). N: количество биологических реплицирует. Планки погрешностей с SEM; p ≤ 0,0001 определяется отрицательное биномиальное модели для A и B, бета-версии модели для D и 2-полосная ANOVA панели E. панелей A – C и E были изменены папа et al.9пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем протокол к быстро расширяться в значительной степени количество функциональных человека СКК от UCBs. Пилот и кинетические исследования, используя этот протокол показывают, что ex vivo расширенной клетки быстро приобретать и сохранять выражение несколько HSC фенотипические маркеры включая CD90 также, как примитивные HSC метаболические характеристики9.
Это ex vivo расширения протокола относительно простой и надежной. Очистка CD34+ клеток с устройством сепаратор клеток (см. Таблицу материалов) является весьма воспроизводимость и быстрое, позволяя для быстрого восстановления изолированных клеток. Этот метод приводит к высокой урожайности очищенный CD34+ клетки (> 90%) в отличие от ручной иммуномагнитная разделения. Кроме того это ex vivo расширения протокола не требует специальных и сложных устройств или систем ФРС партии культуры, требующих непрерывной поставки большого количества свежих СМИ, дополнена цитокинов3,13. Соответственно этот метод ограничения расходов. Важно отметить, что этот протокол позволяет для расширения HSC бассейн в течение короткого времени, который является ключевым ограничивающим фактором загрязнения частоты.
Несколько точек должны быть рассмотрены для достижения примитивных СКК CD34 от+ клеток, используя этот протокол. CD34+ расширена за 4 дня в культурах клеток относиться с цитокина коктейль и VPA свинец поколения пул примитивных долгосрочный СКК. Эти СКК характеризуются не только высокой выражение уровня CD34, CD90 и CD49f, но также очень примитивный метаболических профиль, который преимущественно опирается на гликолиз9. В течение более длительного инкубации с VPA для 7 дней расширенной культур однако более неоднородны и содержат большее количество как долгосрочный и краткосрочных, а также дифференцированных клеток в отличие от клеток, расширен за 4 дня. Этот результат является главным образом из-за истощения VPA в культуре и увеличение числа клеточных делений9. Таким образом, этот протокол может использоваться для достижения расширения двух различных бассейнов клеток: 4- и 7-дневные расширенной клеток. 7-дневный расширения продукта может использоваться для аллогенной трансплантации ГСК, где требуется более быстрого приживления также устойчивого мультилинейного. 4-дневный расширения протокола может быть лучше всего подходит для стратегий генетической модификации, которые целевых долгосрочных заселение клетки. Это также вероятно, что это сочетание VPA и цитокина коктейль можно расширить круг СКК CD34 от+ клеток в той же степени или выше при использовании средств массовой информации помимо средств массовой информации (см. Таблицу материалы), используемые в настоящем Протоколе.
Текущий ген редактирования процедуры, связанные с значительной потере СКК, которые ограничивают их клинического применения. Большое количество примитивных СКК, достигается в течение 2-4 дней лечения VPA в ex vivo культур имеет потенциал, чтобы преодолеть эту потерю в количестве HSC. Таким образом этот протокол может быть полезным для улучшения существующих гена, редактирование протоколов и включить исправление генетических мутаций в терапии трансплантация HSC для β-талассемия и серповидно-клеточной анемии. Кроме того она может применяться к поддерживать большое количество СКК во время гена манипуляций для исследований было сосредоточено на выяснение функций генов в СКК и кроветворения.
В заключение метод, описанный здесь может быть использован для ex vivo расширение как людских, так и мышиных СКК и могут быть адаптированы для конкретных клинических приложений, а также относительно широкого спектра исследований в фундаментальных исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NYSTEM предоставить C030136 о.в. Мы хотели бы поблагодарить за его обратной связи и Редакция рукописи Bartek Яблонски
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expansion Media | Sigma-Aldrich | Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML | |
| AO/PI (acridine orange/propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. | Nexcelom | CS2-0106-25mL | |
| APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 | BD BIOSCIENCE | 555824 | |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 | BD BIOSCIENCE | 555751 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| BD Falcon 15 mL Tube | BD Biosciences | 352097 | |
| BD Falcon 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352063 | |
| BD Falcon 50 mL Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Bovine serum albumine solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-046-703 | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cell analyzer and sorter | BD Biosciences | FACS Aria II | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter | |
| Cell separator device | autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec | ||
| Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-PD100-002 | |
| Density gradient media | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 | BIOLEGEND | 328108 | |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | BIOLEGEND | 400109 | |
| Inverted microscope | |||
| PBS | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 308FKN | |
| Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) | R&D Systems | 203-IL | |
| Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC | |
| Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) | R&D Systems | 288-TP | |
| Total Antibody Compensation Bead Kit | thermofisher | A10497 | |
| Umbilical Cord-blood | Placental Blood Program at the New York Blood Center | http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/ | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | P4543 |
References
- Broxmeyer, H. E. Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation. Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
- Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D'Souza, S., Hoffman, R. Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells. Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).
- Wagner, J. E. Jr, et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).
- Peled, T., et al. Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment. Experimental Hematology. 40 (4), 342-355.e1 (2012).
- Nikiforow, S., Ritz, J. Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants? Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).
- Mehta, R. S., et al. Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials. Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).
- Papa, L., et al. Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation. Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. , In press (2019).
- Genovese, P., et al. Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells. Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).
- Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
- Fares, I., et al. EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells. Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).
