Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ex Vivo Expansion av hematopoetiska stamceller från mänskliga navelsträngen blod-derived CD34+ celler med valproinsyra

Published: April 11, 2019 doi: 10.3791/59532
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Hematology/Oncology, Tisch Cancer Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Här beskriver vi ex vivo expansion av hematopoetiska stamceller från CD34+ celler från navelsträngsblod behandlas med en kombination av en cytokin cocktail och VPA. Denna metod leder till en betydande grad av ex vivo expansion av primitiva Förenta för antingen kliniska eller laboratorium program.

Abstract

Navelsträngen blod (UCB) enheter ger en alternativ källa av hematopoetiska stamceller (Förenta) för patienter som kräver allogen benmärgstransplantation. Även om UCB har flera unika fördelar, begränsar begränsade antalet Förenta inom varje UCB enhet deras användning i regenerativ medicin och HSC transplantation hos vuxna. Effektiv utbyggnad av funktionella mänsklig Förenta kan uppnås genom ex vivo odling av CD34+ celler isolerade från UCBs och behandlas med en histondeacetylas hämmare, valproinsyra (VPA). Protokollet beskrivs här beskriver odlingsbetingelser och metod att snabbt isolera CD34+ celler och expandera i hög grad en pool av primitiva Förenta. De utökade Förenta klarar av att upprätta både kortsiktiga och långsiktiga engraftment och kan ge upphov till alla typer av differentierade hematopoetiska celler. Denna metod har potential för klinisk tillämpning i autologa HSC genterapi och ger en attraktiv metod för att övervinna förlusten av funktionella Förenta associerade med gen editering.

Introduction

Ex vivo expansion av hematopoetiska stamceller (Förenta) från navelsträngsblod (UCB) enheter innehar stort löfte för HSC applikationer inom regenerativ medicin och transplantation terapi. Transplantation med UCB enheter har flera unika fördelar som enkel samling, hög tillgänglighet, minimal risk för infektion, låg risk för återfall, och låg frekvens av transplantat-kontra-värd-sjuka (GVHD). De största nackdelarna av deras användning i kliniska inställningar är dock det begränsade antalet Förenta inom varje UCB enhet1. Ett otillräckligt antal Förenta resulterar i försenad engraftment och hematopoetisk återhämtning, risken för transplantatavstötning och avvikande immun beredning.

För närvarande har olika metoder och strategier utvecklats för att expandera det begränsade antalet Förenta från UCBs ex vivo. Kombinationer av olika cytokin cocktails med små molekyler eller föreningar i ex vivo kulturer resultera i olika grader av expansion i HSC nummer2,3,4,5,6, 7,8. Ännu viktigare, ex vivo kultur inducera villkor stress, vilket leder till snabb cellproliferation, ökad metabolisk aktivitet och förlust av de primitiva egenskaper som definierar primära Förenta. Därför behövs utveckla protokoll som leder till expansion av ett stort antal funktionella Förenta med egenskaper som liknar primära primitiva Förenta.

Serumfritt kulturer av CD34+ celler isolerade från UCBs och behandlas med valproic syra (VPA) resultat i utbyggnaden av stort antal primitiva Förenta4,9,10. HSC utbyggnaden är inte enbart på grund av spridningen av de befintliga Förenta härrör från UCBs. I stället beror denna expansion på förvärvet av en primitiv fenotyp kombinerat med ett begränsat antal celldelningar och spridning9. Inom de första 24-48 h inkubation med en kombination av cytokiner och VPA, CD34+ celler förvärva en transcriptomic och fenotypiska profil som kännetecknar långsiktiga Förenta. Den betydande ökningen i procentandelen av Förenta åtföljs av en snabb ökning av antalet Förenta (63 faldig ökning inom 24 h VPA behandling)9. Särskilt, expanderar VPA-ex vivo expansionsstrategin Förenta med låg metabolisk aktivitet, som ytterligare belyser deras primitiva kännetecken.

Den metod som beskrivs här ger tillstånd och behandlingar som leder till en betydande grad av ex vivo expansion av primitiva Förenta för antingen kliniska eller laboratorium program. Detta ex vivo expansionsstrategi använder en cytokin cocktail kombinerat med VPA behandling. VPA är en FDA godkända läkemedel för behandling av bipolär sjukdom och andra neurologiska sjukdomar. HSC expansion med VPA är snabb och sker inom 7 dagar, både tidpunkten för manipulation och risken för kontaminering minimeras. Allt möjliggör detta protokoll förvärv av långsiktiga HSC fenotypiska markörer såsom CD90 och CD49f inom 24-48 h efter behandling med VPA9. Utökad HSC ympkvistar skapas med detta protokoll har kapacitet att generera det hematopoetiska systemet eftersom de kan differentieras till alla hematopoetiska celler härstamningar och etablera långsiktiga engraftment efter transplantation i myeloablated NSG möss modeller4. Dessutom detta protokoll är mycket reproducerbara och möjliggör snabb och effektiv isolering av livskraftiga CD34+ celler från UCBs, som är avgörande för industrialisering av detta förfarande.

Frivilligt ex vivo expansion protokoll har också potential att övervinna den betydande förlust av Förenta som uppstår under gen redigering11. Gen redigering kräver exponering för cytokiner, som är nödvändiga för cykling celler och aktivering av DNA-reparationsmekanismer. På grund av de snabba effekterna av VPA behandling, kan denna metod vara fördelaktigt för generering av ett högre antal genetiskt modifierade celler inom en tidsperiod som är relevant för närvarande utnyttjas gen ändring protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

HSC ex vivo expansion protokoll följer riktlinjerna i den forskningsetisk kommitté vid Mount Sinai School of Medicine.

1. buffert och Media förberedelse

  1. Förbereda separation buffert 24 h före isolering av CD34+ celler från UBCs genom att lägga till 2 mL 0,5 M eten Diamine Tetra-ättiksyra (EDTA) och 33 mL 7,5% bovint serumalbumin (BSA) till 465 mL buffrad koksaltlösning (1 x PBS). Blanda försiktigt och underhålla bufferten över natten vid 4 ° C.
  2. Varm media vid rumstemperatur på dagen för rening.

2. isolering av mononukleära celler (multinationella) från UCB enhet

  1. Fördela hela UCB enheten i en 75 cm2 kolv. Späd och blanda försiktigt UCB med en lika stor volym av PBS i rumstemperatur.
  2. Bestämma antalet rör krävs för bearbetning av hela UCB enheten (en 50 mL konisk tube kan användas för att bearbeta 35 mL utspädd UCB). Tillsätt 15 mL täthet lutning media (se Tabell för material) till varje rör och fördela den utspädda UCB på toppen av täthet lutning media skapar två lager.
    Obs: Fördela den utspädda UCB mycket långsamt medan du håller röret i en 45° vinkel för att förhindra blandning av lagrets täthet lutning media med UCB.
  3. Centrifugera vid 400 x g för 30 min vid låg acceleration och retardation hastighet. Efter centrifugering lokalisera multinationella företag i det vita lagret (buffy coat) mellan plasma och täthet lutning media lagret.
  4. Aspirera långsamt 2/3 av plasman utan att störa lättcellsskikt lagret. Försiktigt över lättcellsskikt lagret till en ny 50 mL tub. Samla in alla multinationella företag från samma UCB enhet i en 50 mL tub tills de når 25 mL. Använd en ny tub om volymen av insamlade multinationella överstiger 25 mL.
  5. Tillsätt 25 mL kall PBS i röret som innehåller 25 mL av multinationella företag och blanda väl. Centrifugera vid 400 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
    Obs: Kall PBS är viktigt att förebygga tak av antikroppar på cellytan och minska icke-specifik märkning.
  6. Noggrant aspirera supernatanten och försiktigt återsuspendering cellpelleten i 50 mL kall PBS.
  7. Ta bort 20 μL av cellsuspensionen för inventering. Räkna antalet cellen färgas med akridin orange/propidium jodid färgning med hjälp av en automatiserad cell räknare. Beräkna det totala antalet multinationella företag.
    Obs: Celltalet kan också utföras av metoden trypan blå utslagning använder en hemocytometer.
  8. Centrifugera vid 400 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
    Obs: Om det inte behövs omedelbart, kan multinationella företag frysas i detta skede.

3. isolering av CD34+ celler från UCBs

  1. Förbereda CD34+ antikropp tillsammans med magnetiska pärlor lösning för isolering av CD34+ celler från multinationella företag. Mix 300 µL av separation buffert med 100 µL av mänskliga FcR humant IgG (blockerande reagent) och 100 µL av CD34 magnetiska pärlor för isolering av CD34 + celler från varje 108 multinationella företag. För isolering av ett högre antal CD34+ celler från (> 108) multinationella företag skala upp reagenser med detta.
  2. Noggrant aspirera supernatanten från röret centrifugeras vid steg 2,8. Återsuspendera pelleten i CD34 magnetiska pärlor lösningen bereddes i steg 3.1 (Använd 500 µL lösning per 108 celler).
  3. Blanda försiktigt och inkubera vid 4 ° C i 30 min.
    Obs: Förbereda cell separator enheten (se Tabell för material) under inkubationstiden. Ersätta lagringslösningen med arbetande bufferten som indikeras av tillverkarens instruktioner och köra en tvätt program följt av en sköljning program.
  4. Lägg till kall cell avgränsare kör buffert till röret som innehåller cell blandningen tills röret fylls helt. Centrifugera vid 400 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
  5. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i kall cell separator kör buffert (2 mL/108 celler). Över 2 mL av cell suspension blandning till 15 mL rör.
  6. Ladda 3 uppsättningar av 15 mL tuber i cell separator racket prechilled vid 4 ° C. En uppsättning rör innehåller multinationella företag, den andra uppsättningen av rören används för att samla den negativa fraktionen och den tredje uppsättningen rör används för att samla renat CD34+ celler.
  7. Läsa in racket i cell separator enheten och köra programmet posseld2 förinställda.
    Obs: En alternativ metod som använder manuell magnetisk separator kan användas för att ersätta den cell separator enhe12 .
  8. Centrifugrör med det positiva bråket vid 400 x g i 15 minuter vid 4 ° C. Aspirera supernatanten och återsuspendera renat CD34+ celler i 1 mL serum-fria medier.
  9. Räkna cellerna färgas med akridin orange/propidium jodid med en automatisk cell räknare.
    Obs: Om det inte behövs omedelbart, renat CD34+ celler kan frysas i detta skede.

4. VPA Ex Vivo Expansion av renat UCB-CD34+ celler

  1. Förbereda tillräcklig volym av media att platta det renade CD34+ celler på en densitet 3,3 x 104 celler/mL. Kultur media sammansättning är serum gratis odlingsmedium (se Tabell för material) kompletteras med 10 µL/mL penna/strep, 150 ng/mL stamceller faktor (SCF), 100 ng/mL fms-liknande tyrosin Kinas receptor 3 (FLT3 ligand), 100 ng/mL trombopoetin (TPO), och 50 ng/mL interleukin 3 (IL-3).
  2. Plattan renat CD34+ celler i en 12-well platta (5 x 104 CD34+ celler / 1.5 mL av media / väl) och kultur vid 37 ° C i en 5% CO2 befuktade inkubator.
  3. Bedöma renheten av isolerade CD34+ celler och cell sammansättning av FACS analys som beskrivs nedan i steg 6.3.
  4. Lägg till VPA med en slutlig koncentration på 1 mM i kulturerna av celler som behandlas för 16 h med cytokin cocktail.
  5. Odla cellerna ytterligare 7 dagar vid 37 ° C i en 5% CO2 befuktade inkubator.
    Obs: Media är oförändrad under ex vivo expansion.

5. antikropp färgning för flödescytometri flödesanalys

  1. Bered antikropp-färgning till fläcken 2 x 104– 6 x 104 celler och isotypen lösning att bestämma FACS gating strategi och bestämma nivån på icke-specifik bindning. Späd antikroppar (1/100 APC anti-CD34, 1/200 FITC anti-CD90) och den respektive isotyper in 50 µL av separation buffert (sammansättningen av separation buffert definieras i steg 1.1).
    Obs: Utför enstaka färgning av celler med varje antikropp för en FMO gating strategi. Totala antikropp ersättning kornkit kan (se Tabell för material) användas för kompensationsinställningar.
  2. Homogenisera cellkulturen genom pipettering flera gånger. Räkna och Pipettera 5 x 104 celler i ett 1,5 mL rör.
  3. Tillsätt 1 mL separation buffert och centrifugera vid 400 x g i 15 min i rumstemperatur.
  4. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 50 µL av färglösningen. Inkubera cellerna i 30 min i rumstemperatur.
  5. Tillsätt 450 µL av separation buffert och centrifugera vid 400 x g i 15 min i rumstemperatur.
  6. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 100 µL av separation buffert. Håll cellerna på is för minst 5 min till utföra FACS analys. Tillsätt 1 µL av 7-AAD till gate viabla celler.
  7. Ladda färgade cellen provet på FACS maskinen och förvärva celler med den lägsta flödeshastigheten.
  8. För varje fluorophore, analysera isotypen kontroller och enstaka färgade celler att inrätta gating för FITC (CD90), APC (CD34) och PerCP/Cy5.5 (7-AAD) färgning.
  9. Utfärda utegångsförbud för PerCP/Cy5.5 negativa bråkdel och tomt APC vs FITC att avgöra procenten av livskraftiga CD34+, CD90+, och CD34+CD90+ celler som definierar HSPC/HSC befolkningen i kulturen.

6. antikropp färgning för cellen flöde flödescytometri sortering

  1. Resuspendera utökade cellerna genom pipettering flera gånger. Räkna antalet cell och överföra hela kulturen i en 15 mL eller 50 mL tub.
  2. Fylla upp röret med kalla separation buffert
  3. Centrifugera vid 400 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
  4. Förbereda antikropp-färgning lösning att färga 5 x 105– 2 x 106 celler och isotypen lösning att fläcken 1 x 105 celler och avgöra FACS gating. Utspädd 1/10 (APC anti-CD34), 1/20 (FITC-CD90) antikroppar och den motsvarande isotyper in 500 µL av separation buffert per varje villkor.
  5. Förbereda de enda färg ersättning kontroller med en total antikropp ersättning kornkit enligt tillverkarens anvisningar.
  6. Överför supernatanten från steg 5.2 till en ny tub och hålla det vid 37 ° C. Denna kultur media kommer att återanvändas för att odla sorterade cellerna.
  7. Återsuspendera cellpelleten i kalla separation buffert för att få en koncentration på 5 x 105 celler / mL. Överföra 1 x 105 celler i 1,5 mL tuber för isotypen färgning och återstående cellerna som ska sorteras i andra 1,5 mL rör.
  8. Centrifugera rören vid 400 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
  9. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelletar av celler i isotypen färgning lösning och pelleten celler som ska sorteras i antikroppen färgning lösning.
  10. Inkubera i 30 minuter vid 4 ° C.
  11. Tillsätt 450 µL av separation buffert och centrifugera vid 400 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
  12. Återsuspendera pellets med 2 mL kall separation buffert.
  13. För att förhindra träskor, filtrera proverna genom en 40 μm cell sil och plats på is tills FACS.
  14. Set-up cell sorterare för sortering med korrekta parametrar.
  15. Köra isotypen prover för att ange spänning och vinst för framåt och side scatter och identifiera negativa fluorescens populationer.
  16. Kör enda färgkontroller och fastställa ersättning som du kan tillämpa kompenseras parametern till samling protokoll.
  17. Kör en liten alikvot provets (Ab) (~ 50 000 händelser) att upprätta usenets strategin.
  18. Ställa in sortera beslut att samla CD34+ CD90– cell bråkdel.
  19. Sortera celler in samling rören belagd med 2 mL separation buffert.
  20. Efter sortering, berätta om cellerna och centrifugera dem 400 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
  21. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i media återfanns i steg 5,5 att nå en slutlig koncentration på 3 x 104 celler/mL.
  22. Tavla CD34+ CD90– renas celler i 12 brunnar med 1,5 mL medium/väl (5 x 104 CD34+ CD90– celler/1.5 mL av media per brunn).
  23. Bedöma renhet genom FACS analys med 50 µL av media som innehåller celler.
  24. Behandla kulturerna av CD34+CD90– celler med VPA på 1mM slutlig koncentration.
  25. Inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 befuktade inkubator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De ex vivo protokollet som beskrivs här ökar antalet primitiva Förenta genereras från CD34+ celler isolerade från UCBs (figur 1). Primerbehandling av CD34+ celler för 16 h med ett cytokin cocktail, följt av behandling med VPA för ytterligare 7 dagar, leder till en stor grad av HSC expansion. Anmärkningsvärt, poolen av utökade celler är höganrikat för Förenta, som definieras fenotypiskt av CD34+CD90+ markörer. Det totala antalet celler med kärnor (transnationella företag) i kulturer som behandlats med cytokin cocktail ensam är betydligt högre än antalet celler som observerats i kulturer behandlas med cytokin cocktail och VPA (figur 2A). Trots det högsta antalet transnationella företag, numrera av Förenta i kulturer som får cytokin cocktail ensam förblir låg under hela expansion jämfört med kulturer som behandlats med cytokin cocktail och VPA (figur 2B). Det största antalet Förenta genereras i kulturer som behandlas med en kombination av cytokin cocktail och VPA (figur 2B). I synnerhet, uppnås den största expansionen i numrerar av Förenta efter 5 – 7 dagar efter VPA behandling (figur 2B). Det ökade antalet Förenta korrelerar med en snabb ökning av andelen Förenta, vilket är anmärkningsvärt inom 24 h VPA behandling (figur 2 c). Medan ökningen i procentandelen av Förenta är hög och underhållas under de första 4 dagarna i ex vivo kultur, minskar det gradvis efter 5 – 7 dagars behandling med VPA (figur 2 c). Denna minskning är dock omvänt korrelerad med en ökning av det absoluta antalet Förenta.

Viktigt, är den snabba ökningen i procentandelen av Förenta observerats i VPA behandlade kulturer förvärvet av CD90 fenotypen. CD34+ celler som uttrycker den fenotypiska CD90 markör når nästan 40% – 45% av cellerna utvidgas i ex vivo kulturer behandlas med cytokin cocktail och VPA för 4 dagar (figur 2 c,D). Förvärvet av CD90 fenotypen är ytterligare+ bekräftas av ex vivo expansion av de högrenade CD34-celler saknar uttrycket av CD90 marker. Inom 24 h VPA behandling, nästan 75% av ex vivo expanderade celler i kulturer som inletts med sorterade CD34+CD90– celler uttrycker CD90 jämfört med 0 procent av cellerna i kulturer som innehåller cytokin cocktail ensam (figur 2E). Ännu viktigare, bevaras den CD90 fenotypen mycket under de första 4 dagarna i ex vivo kulturer behandlas med VPA (figur 2E).

Figure 1
Figur 1: Schematisk presentation av ex vivo expansion kultur. Renat CD34+ celler från UCBs är primade för 16 h i ex vivo kultur kompletteras med en kombination av den angivna cytokiner. Kulturer är behandlade med VPA (1mM) ytterligare 7 dagar. De ex vivo expanderade celler kan sedan transplanteras in i myoablated NSG möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: VPA behandling utlöser förvärvet av CD90 resulterar i utbyggnaden av ett stort antal Förenta. (A) absoluta antalet totala livskraftiga kärnförsedda celler expanderat i ex vivo kulturer9. Renat CD34+ celler från UCBs beskrivs i avsnitt 3 behandlas med cytokin cocktail ensam eller en kombination av cytokin cocktail och VPA som beskrivs i avsnitt 4 räknades av akridin orange/propidium jodid färgning (n = 16). Siffrorna betecknar dagars behandling med VPA, medan PC betecknar den primära obildade CD34+ celler isolerade från UCBs. (B, C) Absoluta antalet och andelen CD34+CD90+ celler expanderade under 7 dagar i ex vivo kulturer behandlas med cytokin cocktail ensam eller en kombination av cytokin cocktail och VPA (n = 21). Procentandel av CD34+CD90+ celler bestäms av flödescytometri flödesanalys av celler målat som beskrivs i avsnitt 4. (D) fenotypiska analys av sorterade CD34+ celler från UCBs (steg 5.3) expanderade i ex vivo kulturer behandlas som anges i 4 dagar. Vänstra panelen indikerar den portande strategi använder isotypen färgning medan de andra panelerna visar färgade celler expanderat i kulturer som innehåller cytokin cocktail ensam eller en kombination av cytokin cocktail med VPA. Siffrorna betecknar andelen av CD34–CD90+ celler, CD34+CD90– celler och CD34+CD90+ celler. (E) andel av CD34+CD90+ celler expanderat i kulturer som inletts med sorterade CD34+CD90– celler från UBCs och behandlas med cytokin cocktail ensam eller en kombination av cytokin cocktail och VPA för den angivna dagar. Procentuella bestäms av flödesanalys flödescytometri (n = 4). N: antal biologiska replikat. Felstaplar med SEM; p ≤ 0,0001 som bestäms av negativ-binomial modeller för A och B, Beta modeller för D och 2-vägs ANOVA för panel E. paneler A – C och E har ändrats från Papa et al.9vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Häri, presenterar vi ett protokoll för att snabbt utöka till en viktig grad antalet funktionella mänsklig Förenta från UCBs. Pilot och kinetiska studierna använder detta protokoll indikerar att den ex vivo expanderade celler snabbt förvärva och behålla uttrycket av flera HSC fenotypiska markörer inklusive CD90 samt primitiva HSC metabola egenskaper9.

Detta ex vivo expansion protokoll är relativt enkel och tillförlitlig. Rening av CD34+ celler med cell separator enheten (se Tabell för material) är mycket reproducerbara och snabb, vilket möjliggör snabb återställning av isolerade celler. Denna metod resulterar i en hög avkastning av renat CD34+ celler (> 90%) i motsats till manuell immunmagnetisk separation. Dessutom kräver detta ex vivo expansion protokollet inte särskilda och komplexa enheter eller fed-batch kultur system som behöver kontinuerlig tillförsel av stora mängder färsk media kompletteras med cytokiner3,13. Följaktligen begränsar denna metod kostnaderna. Allt möjliggör detta protokoll utbyggnaden av HSC poolen inom en kort tid, vilket är en viktig begränsande faktor för kontaminering frekvens.

Flera punkter bör övervägas för att uppnå primitiva Förenta från CD34+ celler använder detta protokoll. CD34+ celler expanderat i 4 dagar i kulturer behandlas med cytokin cocktail och VPA bly till generation av en pool av primitiva långsiktiga Förenta. Dessa Förenta kännetecknas inte bara av de höga nivåerna av CD34, CD90 och CD49f, men också av en mycket primitiv metabola profilen, som huvudsakligen bygger på Glykolys9. Under mer långvarig inkubation med VPA för 7 dagar, utökade kulturer men är mer heterogen och innehåller ett större antal både långsiktiga och kortsiktiga samt differentierade celler i motsats till cellerna utvidgas i 4 dagar. Detta resultat beror främst på att konsumtion av VPA i kultur och ökat antal celldelningar9. Således detta protokoll kan användas för att uppnå expansion av två olika pooler av celler: 4-dagars och 7-dagars utökade celler. 7-dagars expansion produkten kan användas för allogen HSC transplantation där snabbare samt så ihållande multilinjärt engraftment krävs. 4-dagars expansion protokollet kan vara bäst för genetisk modifiering strategier som är inriktade på långsiktig återinsättning celler. Det är också troligt att denna kombination av VPA och cytokin cocktail kan expandera poolen av Förenta från CD34+ celler på samma grad eller högre när du använder media än media (se Tabell för material) används i detta protokoll.

Nuvarande gen redigering förfarandena är associerade med en betydande förlust av Förenta, som begränsar deras kliniska tillämpning. Det stora antalet primitiva Förenta uppnås inom 2 – 4 dagar VPA behandling i ex vivo kulturer har potential att övervinna denna förlust i HSC siffror. Detta protokoll kan således vara fördelaktigt för att förbättra befintliga genen redigering protokoll och aktivera korrigering av genetiska mutationer i HSC transplantation-baserade terapier för β-thalassemi och sicklecellsjukdom. Dessutom kan det användas för att bibehålla stora antal Förenta under gen manipulationer för studier fokuserat på förtydligandet av genen funktioner i Förenta och blodbildning.

Sammanfattningsvis, den metod som beskrivs här kan användas för ex vivo expansion av både mänskliga och murina Förenta och kan anpassas till specifika kliniska tillämpningar samt att ett brett spektrum av undersökningar i grundforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av NYSTEM bevilja C030136 till R.H. Vi vill tacka Bartek Jablonski för hans feedback och granskning av manuskript

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expansion Media Sigma-Aldrich Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML
AO/PI (acridine orange/propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. Nexcelom CS2-0106-25mL
APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 BD BIOSCIENCE 555824
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 BD BIOSCIENCE 555751
autoMACS Rinsing Solution MACS Miltenyi Biotec 130-091-222
BD Falcon 15 mL Tube BD Biosciences 352097
BD Falcon 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube BD Biosciences 352063
BD Falcon 50 mL Tube BD Biosciences 352098
Bovine serum albumine solution Sigma-Aldrich A8412
CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human Miltenyi Biotec 130-046-703
Cell analyzer BD Biosciences FACS Canto II
Cell analyzer and sorter BD Biosciences FACS Aria II
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter
Cell separator device autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec
Counting Chambers Nexcelom CHT4-PD100-002
Density gradient media GE Healthcare Bio-Sciences AB 17-1440-03
Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E8008-100ML
FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 BIOLEGEND 328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody BIOLEGEND 400109
Inverted microscope
PBS Corning cellgro 21-040-CV
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein R&D Systems 308FKN
Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) R&D Systems 203-IL
Recombinant Human SCF Protein R&D Systems 255-SC
Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) R&D Systems 288-TP
Total Antibody Compensation Bead Kit thermofisher A10497
Umbilical Cord-blood Placental Blood Program at the New York Blood Center http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/
Valproic acid sodium salt Sigma-Aldrich P4543

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Broxmeyer, H. E. Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation. Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).
  2. Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
  3. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  4. Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D'Souza, S., Hoffman, R. Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells. Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).
  5. Wagner, J. E. Jr, et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).
  6. Peled, T., et al. Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment. Experimental Hematology. 40 (4), 342-355.e1 (2012).
  7. Nikiforow, S., Ritz, J. Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants? Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).
  8. Mehta, R. S., et al. Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials. Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).
  9. Papa, L., et al. Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation. Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).
  10. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. , In press (2019).
  11. Genovese, P., et al. Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells. Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).
  12. Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
  13. Fares, I., et al. EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells. Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).

Tags

Medicin fråga 146 navelsträngsblod CD34+ celler ex vivo kultur VPA Förenta ex vivo expansion transplantation genterapi
Ex Vivo Expansion av hematopoetiska stamceller från mänskliga navelsträngen blod-derived CD34<sup>+</sup> celler med valproinsyra
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R.… More

Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid. J. Vis. Exp. (146), e59532, doi:10.3791/59532 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter