Summary
כאן, אנו מתארים את האקס vivo הרחבה של תאי גזע hematopoietic מ CD34+ תאים שמקורם דם טבורי מטופלים עם שילוב של ציטוקין קוקטיילים ו VPA. שיטה זו מובילה מידה רבה של ex-vivo הרחבת HSCs פרימיטיבית גם קליני או יישומים מעבדה.
Abstract
יחידות דם (UCB) חבל הטבור לספק מקור חלופי של האדם תאי גזע hematopoietic (HSCs) עבור חולים הזקוקים השתלת מח עצם allogeneic. בעוד UCB יש מספר יתרונות ייחודיים, המספרים מוגבלת של HSCs בתוך כל יחידה UCB מגביל את השימוש בהם ברפואה רגנרטיבית ומועדון הכדורגל מונפלייה השתלת אצל מבוגרים. הרחבת יעיל פונקציונלי HSCs האנושית יכולה להיות מושגת על ידי ex-vivo culturing של CD34+ תאים מבודדים מן UCBs וינהגו מעכב deacetylase, חומצה ולפרואית (VPA). פרוטוקול מפורט כאן מתאר את התנאים תרבות של מתודולוגיה לבודד במהירות CD34+ תאים, להרחיב במידה גבוהה בריכת HSCs פרימיטיבית. HSCs המורחב מסוגלים להקים engraftment הן לטווח קצר והן לטווח ארוך והם מסוגלים להצמיח כל סוגי תאים hematopoietic. שיטה זו גם מחזיקה פוטנציאל יישום קליני טיפול גנטי HSC עצמיים, מספקת גישה אטרקטיבי כדי להתגבר על האובדן של HSCs תפקודית המשויך ג'ין עריכה.
Introduction
Ex-vivo הרחבה של תאי גזע hematopoietic (HSCs) של דם טבורי (UCB) יחידות מחזיקה הבטחה גדולה עבור יישומים HSC רפואה רגנרטיבית וטיפול השתלת. השתלת עם יחידות UCB יש מספר יתרונות ייחודיים כמו אוסף קל, זמינות גבוהה, סיכון מינימלי של זיהום, סיכון נמוך של התדרדרות המחלה, תדירות נמוכה של שתל-לעומת מארח מחלות (GVHD). עם זאת, החסרונות העיקריים של השימוש בהגדרות קליני הם מספר מוגבל של HSCs מתנה בתוך כל UCB יחידה1. מספר לא מספיק של תוצאות HSCs engraftment מושהה, שחזור hematopoietic, הסיכון של דחיית השתל, שיחזור המערכת החיסונית סוטה.
כיום, שיטות ואסטרטגיות שונות פותחו כדי שמחוץ להרחיב את מספר מוגבל של HSCs מ- UCBs. שילובים של ציטוקינים שונים קוקטיילים עם מולקולות קטנות או תרכובות ex-vivo תרבויות לגרום דרגות שונות של הרחבה במועדון הכדורגל מונפלייה מספרי2,3,4,5,6, 7,8. חשוב, ex-vivo תרבות תנאים לגרום מתח, שמוביל התפשטות תאים מהירה, פעילות מטבולית מוגברת ואובדן פרימיטיביים המאפיינים המגדירים את ראשי HSCs. לכן, נדרשים לפתח פרוטוקולים להוביל הרחבה של מספר רב של HSCs פונקציונלי עם מאפיינים דומים HSCs פרימיטיבית העיקרי.
ללא סרום תרבויות CD34+ תאים מבודד UCBs ומטופל מהתוצאה (VPA) חומצה ולפרואית, בהרחבת מספר גדול של פרימיטיביים HSCs4,9,10. הרחבת HSC אינה אך ורק עקב ההתפשטות של HSCs קיימים נגזר UCBs. במקום זאת, התרחבות זו היא בשל רכישת הפנוטיפ פרימיטיביים בשילוב עם מספר מוגבל של חלוקות תאים והתפשטות9. בתוך ה 24-48 הראשונית של דגירה עם שילוב של ציטוקינים, VPA CD34+ תאים לרכוש transcriptomic ופרופיל פנוטיפי המאפיינות HSCs לטווח ארוך. העלייה המשמעותית באחוזים של HSCs מלווה גידול מהיר במספר HSCs (קיפול 63 עלייה בתוך 24 שעות של טיפול VPA)9. ראוי לציין, אסטרטגיית הרחבה vivo VPA-לשעבר מרחיבה HSCs עם פעילות מטבולית נמוכה, המדגישה את המאפיינים פרימיטיביים שלהם עוד יותר.
השיטה המתוארת כאן מספק תנאים ומטיפולי להוביל מידה רבה של ex-vivo הרחבת HSCs פרימיטיבית גם קליני או יישומים מעבדה. משתמש זה ex-vivo הרחבה אסטרטגיה קוקטייל ציטוקין בשילוב עם טיפול VPA. VPA הוא סם ה-FDA אישר טיפול הפרעות דו קוטבית ומחלות נוירולוגיות אחרות. הרחבת HSC עם VPA בקש, מתרחשת בתוך 7 ימים, צמצום הזמן של מניפולציה והן את הסיכון של זיהום. חשוב לציין, פרוטוקול זה מאפשר רכישת לטווח ארוך HSC פנוטיפי סמני כגון CD90 ו- CD49f בתוך 24-48 שעות לאחר הטיפול עם VPA9. שתלי HSC מורחב שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה יש את היכולת להתחדש מערכת hematopoietic מאז הם יכולים להבדיל לתוך כל תא hematopoietic שושלות ולייסד engraftment לטווח ארוך בעקבות השתלת לתוך myeloablated NSG עכברים מודלים4. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא מאוד לשחזור ומאפשר בידוד יעיל ומהיר של קיימא CD34+ תאים של UCBs, אשר הוא קריטי עבור ה תיעוש של הליך זה.
VPA ex-vivo הרחבה פרוטוקול יש גם את היכולת להתגבר על אובדן משמעותי של HSCs אשר מתרחש במהלך עריכת11גנים. ג'ין עריכה דורש חשיפה ציטוקינים, אשר נחוצים עבור תאים אופניים והפעלה של מנגנוני ה-DNA לתקן. בשל השפעת VPA טיפול מהיר, שיטה זו תועיל עבור הדור של מספר גדול יותר של תאים מהונדסים בתוך פרק זמן זה רלוונטי כיום מנוצל פרוטוקולים שינוי גנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מועדון הכדורגל מונפלייה ex-vivo הרחבה פרוטוקול עוקב אחר הקווים המנחים של ועדת האתיקה במחקר על הר סיני בית הספר לרפואה.
1. מאגר והכנות מדיה
- הכנת מאגר ההפרדה 24 שעןת לפני ניתוקה של CD34+ תאים של UBCs על-ידי הוספת 2 מ ל חומצה אצטית-M אתילן diamine ב טטרה 0.5 (EDTA) ו- 33 מ של 7.5% אלבומין שור (BSA) 465 מ ל buffered תמיסת מלח (1 x PBS). לערבב בעדינות, לשמור על המאגר בן לילה ב 4 º C.
- מדיה חמים בטמפרטורת החדר ביום של טיהור.
2. בידוד תאי תאי (MNCs) מיחידת UCB
- לוותר על כל יחידה UCB לתוך בקבוקון2 75 ס מ. לדלל ומערבבים בעדינות את UCB עם אמצעי אחסון שווה ל- PBS בטמפרטורת החדר.
- לקבוע את מספר צינורות נדרש לעיבוד כל יחידה UCB (אחד 50 מ"ל צינור חרוטי יכול לשמש כדי לעבד 35 מיליליטר UCB מדולל). להוסיף 15 מ"ל של צפיפות מדיה מעבר צבע (ראה טבלה של חומרים) כל שפופרת, לוותר על UCB מדולל על התקשורת הדרגתיות צפיפות יצירת שתי שכבות.
הערה: לוותר על UCB מדולל באיטיות תוך החזקת את הצינור בזווית של 45° כדי למנוע ערבוב של השכבה מדיה הדרגתיות צפיפות עם UCB. - צנטריפוגה ב x 400 g למשך 30 דקות בקצב נמוך האצה והאטה. לאחר צנטריפוגה, אתר MNCs בשכבה לבנה (באפי המעיל) בין השכבה מדיה הדרגתיות פלזמה וצפיפות.
- לאט לאט תשאף 2/3 של הפלזמה מבלי להפריע השכבה המעיל באפי. להעביר בזהירות השכבה המעיל באפי לתוך צינור 50 מ. לאסוף כל MNCs מאותה יחידה UCB לתוך צינור 50 מ ל עד שהגיע 25 מ. השתמש צינור אם הנפח של MNCs שנאספו עולה על 25 מ.
- להוסיף 25 מ של PBS קר לתוך הצינור המכיל 25 מ של MNCs ומערבבים היטב. צנטריפוגה ב 400 x g 10 דקות ב 4 º C.
הערה: PBS קר חשוב למנוע מיצוי של נוגדנים על פני התא ולהפחית שאינם ספציפיים תיוג. - בזהירות וארוקן את תגובת שיקוע, בעדינות מחדש להשעות בגדר תא ב 50 מ של PBS קר.
- הסר μL 20 של התליה תא עבור ספירה. לספור את מספר הנייד מוכתם יודיד כתום/propidium acridine מכתים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית. לחשב את המספר הכולל של MNCs.
הערה: . ספירת יכול להתבצע גם על ידי השיטה הדרה כחול trypan באמצעות hemocytometer. - צנטריפוגה ב 400 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.
הערה: אם לא נדרש באופן מיידי, שיכול להיות קפוא MNCs בשלב זה.
3. בידוד של CD34+ תאים מ- UCBs
- להכין את CD34+ נוגדנים בשילוב עם פתרון beads מגנטי עבור בידוד של CD34+ תאים של µL MNCs. לערבב 300 ההפרדה מאגר עם 100 µL של ה-FcR אנושי אנושי IgG (ריאגנט חסימה), 100 µL של CD34 beads מגנטי עבור בידוד של CD34 + תאים כל MNCs8 10. עבור בידוד של מספר גדול יותר של CD34+ תאים מ- (> 108) MNCs, קנה המידה של ריאגנטים בהתאם.
- בזהירות וארוקן את תגובת שיקוע מהצינור centrifuged בשלב 2.8. Resuspend בגדר בפתרון beads מגנטי CD34 מוכן בשלב 3.1 (השתמש µL 500 של פתרון לכל 108 תאים).
- לערבב בעדינות, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
הערה: הכן את התקן מפריד תא (ראה טבלה של חומרים) במהלך תקופת הדגירה. החלף את פתרון אחסון המאגר עבודה כפי שמציין הוראות היצרן ולהפעיל תוכנית כביסה ואחריו תוכנית השטיפה. - הוסף מפריד תא קר מפעיל מאגר הצינור המכיל את התערובת תא עד הצינור מלא מלא. צנטריפוגה ב 400 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.
- וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא תוך קר התא מפריד הפעלת מאגר (2 מ ל/108 תאים). העברת mL 2 תערובת התליה תא לתוך צינורות 15 מ"ל.
- לטעון 3 סטים של 15 מ"ל צינורות לתוך המדף מפריד תא prechilled ב 4 º C. סט צינורות אחד מכיל MNCs, הסט השני של צינורות ישמש כדי לאסוף את השבר שלילי, סדרה של צינורות ישמש כדי לאסוף CD34 מטוהרים+ תאים.
- לטעון המדף לתוך המכשיר מפריד תא ולהפעיל את התוכנית מראש של posseld2 .
הערה: שיטה חלופית אשר מנצל ידני מפריד מגנטי יכול לשמש כדי להחליף את המכשיר מפריד תא12 . - צנטריפוגה צינורות עם השבר חיובי ב x 400 g למשך 15 דקות ב 4 º C. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend CD34 מטוהרים+ תאי 1 מ"ל של מדיה ללא סרום.
- לספור את התאים מוכתם acridine כתום/propidium יודיד באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית.
הערה: אם לא נדרש באופן מיידי, מטוהרים CD34+ שיכול להיות קפוא תאים בשלב זה.
4. VPA Ex Vivo הרחבת תאי CD34-UCB+ מטוהרים
- להכין נפח מספיק של מדיה צלחת את CD34 מטוהרים+ תאים-צפיפות של 3.3 x 104 תאים למ"ל. ההרכב תרבות המדיה היא בינונית תרבות חופשית סרום (ראה טבלה של חומרים) בתוספת 10 µL/mL עט/דלקת, גורם לתאי גזע ng/mL (SCF) 150, 100 ננוגרם למ"ל, כמו fms טירוזין קינאז קולטן 3 (FLT3 ליגנד), 100 ננוגרם למ"ל thrombopoietin (TPO), ו 50 ng/mL אינטרלוקין 3 (IL-3).
- צלחת מטוהרים CD34+ תאים בצלחת 12-טוב (5 x 104 CD34+ תאים / mL 1.5 של מדיה / טוב) ותרבות -37 מעלות צלזיוס ב חממה humidified CO2 5%.
- להעריך את טוהר CD34 מבודד+ תאים והרכב תא על-ידי ניתוח FACS כמפורט להלן בשלב 6.3.
- להוסיף VPA ריכוז סופי של 1 מ מ לתוך התרבויות של תאים שטופלו במשך 16 קמ"ש עם קוקטייל ציטוקין.
- התרבות התאים עבור 7 ימים נוספים ב- 37 מעלות צלזיוס ב חממה humidified CO2 5%.
הערה: התקשורת נותרת ללא שינוי במהלך משך הזמן של האקס vivo הרחבה.
5. נוגדן מכתים לניתוח Cytometry זרימה
- להכין מכתים נוגדן פתרון כתם 2 x 104–6 x 104 תאים ו- isotype פתרון כדי לקבוע FACS gating אסטרטגיה, לקבוע את רמת מחייב שאינם ספציפיים. לדלל נוגדנים (1/100 APC אנטי-CD34, 1/200 FITC אנטי-CD90) ו- isotypes בהתאמה לתוך µL 50 ההפרדה מאגר (הרכב של מאגר ההפרדה מוגדר בשלב 1.1).
הערה: לבצע צביעת יחיד של תאים עם כל נוגדן עבור FMO gating אסטרטגיה. (ראה טבלה של חומרים) נוגדן הכולל פיצוי חרוז ערכת ניתן להתקנה פיצוי. - Homogenize התרבות התא על-ידי pipetting מספר פעמים. לספור תאים ותאים4 pipet 5 10x לתוך צינור 1.5 מ.
- להוסיף 1 מ"ל של מאגר ההפרדה, צנטריפוגה ב x 400 g למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב- 50 µL של הפתרון מוכתמים. דגירה תאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף µL 450 של מאגר ההפרדה, צנטריפוגה ב x 400 g למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 100 µL ההפרדה המאגר. לשמור תאים על קרח למשך 5 דקות לפחות עד ביצוע ניתוח FACS. להוסיף 1 µL של 7-מ לשער התאים קיימא.
- לטעון את הדגימה תא מוכתם על המכונה FACS ולרכוש תאים על קצב הזרימה הנמוך.
- עבור כל fluorophore, לנתח את הפקדים isotype ועל תאים בודדים מוכתם להגדיר gating FITC (CD90), APC (CD34) של צביעת PerCP/Cy5.5 (7-מ).
- שער PerCP/Cy5.5 שלילי שבר עלילה APC vs FITC כדי לקבוע את אחוז CD34 קיימא+, CD90+, ו- CD34+CD90+ תאים המגדיר את האוכלוסייה HSPC/HSC בתרבות.
6. נוגדן צביעת עבור Cytometry זרימה תא מיון
- Resuspend התאים מורחבת מאת pipetting מספר פעמים. לספור את מספר הנייד ולהעביר את כל התרבות לתוך צינור 15 מ"ל או 50 מ.
- ממלאים את הצינור עם מאגר ההפרדה קר
- צנטריפוגה ב 400 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.
- להכין נוגדן מכתים פתרון כתם 5 x 105–2 x 106 תאים ו- isotype פתרון כתם עונה 1 פרק 105 תאים ולקבוע FACS gating. שתדללו 1/10 (APC אנטי-CD34), 1/20 נוגדנים (FITC-CD90), את isotypes המתאים לתוך µL 500 ההפרדה מאגר לפי כל תנאי.
- הכינו את הפקדים פיצוי צבע בודד באמצעות ערכת חרוז נוגדן הכולל פיצוי על פי הוראות היצרן.
- להעביר את תגובת שיקוע מהשלב 5.2 לתוך צינור ולשמור אותו ב 37 º C. ניתן לעשות שימוש חוזר מדיה תרבות זו על התרבות התאים הממוין.
- Resuspend בגדר תא במאגר ההפרדה קר כדי לקבל ריכוז של 5 x 105 תאים / מ ל. להעביר תאים5 עונה 1 פרק 10 1.5 mL צינורות עבור isotype מכתים, התאים הנותרים תמוין לתוך צינורות 1.5 mL אחרים.
- Centrifuge הצינורות ב x 400 g למשך 15 דקות ב 4 º C.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend כדורי של תאים ב- isotype מכתים פתרון ולא בגדר של תאים ימוין הנוגדן מכתים פתרון.
- תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 º C.
- להוסיף µL 450 של מאגר ההפרדה, צנטריפוגה ב x 400 g למשך 15 דקות ב 4 º C.
- Resuspend כדורי 2 מ ל מאגר ההפרדה קר.
- כדי למנוע כפכפים, לסנן את הדגימות דרך מסננת תא μm 40 המקום על הקרח עד FACS.
- הגדרת סדרן התא למיון עם הפרמטרים הנכונים.
- Isotype לרוץ דגימות להגדיר מתח ולהשיג עבור קדימה וצד פיזור ולזהות אוכלוסיות פלורסצנטיות שלילי.
- פקדי צבע אחד לרוץ כדי להגדיר פיצוי המקדמים ולהחיל מפוצה פרמטר אוסף לפרוטוקול.
- הפעל aliquot קטן של המדגם (אלב) (~ 50,000 אירועים) להקים את האסטרטגיה חסימה.
- הגדרת סוג ההחלטות כדי לאסוף את CD34+ CD90– תא שבר.
- סוג תאים לתוך צינורות איסוף מצופה מאגר ההפרדה 2 מ"ל.
- לאחר מיון, לספור מחדש את התאים, centrifuge אותם ב 400 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר בתקשורת התאושש בשלב 5.5 להגיע ריכוז הסופי של 3 x 104 תאים/מ ל....
- צלחת CD34+ CD90– מטוהרים בתאים. ובכן 12 צלחות עם 1.5 mL בינוני/טוב (5 x 104 CD34+ CD90– תאים/1.5 מ של מדיה/טוב).
- להעריך את הטוהר על ידי ניתוח FACS באמצעות 50 µL של תאים המכילים מדיה.
- מתייחסים תרבויות CD34+CD90– תאים עם VPA על הריכוז הסופי של 1 מ מ.
- דגירה-37 מעלות צלזיוס ב חממה humidified CO2 5%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ex-vivo פרוטוקול המתוארים כאן מגדילה את מספר HSCs פרימיטיבית המופקים CD34+ תאים מבודדים מן UCBs (איור 1). הטרמה של CD34+ תאים עבור h 16 עם ציטוקין קוקטייל, ואחריו טיפול עם VPA במשך 7 ימים, נוסף שמוביל מידה רבה של מועדון הכדורגל מונפלייה הרחבה. למרבה הפלא, הבריכה של תאים מורחבת מאוד מועשר עבור HSCs, אשר phenotypically מוגדרים על-ידי CD34+CD90+ סמנים. המספר הכולל של תאי nucleated (TNCs) בתרבויות שטופלו של ציטוקין קוקטייל לבד גבוה משמעותית מספר התאים שנצפו בתרבויות שטופלו ציטוקין קוקטייל של VPA (איור 2 א). למרות המספר הגבוה יותר של TNCs, המספר של HSCs בתרבויות שקיבלו את ציטוקין קוקטייל לבד נשאר נמוך במהלך תקופת ההרחבה כולו לעומת תרבויות שטופלו ציטוקין קוקטייל של VPA (איור 2B). המספר הגדול ביותר של HSCs נוצרת בתרבויות מטופלים עם שילוב ציטוקין קוקטייל, VPA (איור 2B). בפרט, ניתן להגיע ההתרחבות הגדולה ביותר במספר HSCs לאחר 5-7 ימים לאחר הטיפול VPA (איור 2B). מספר גדל של HSCs בקורלציה עם גידול מהיר באחוזים של HSCs, אשר בולט בתוך 24 שעות של טיפול VPA (איור 2C). אמנם העלייה באחוזים של HSCs גבוהה ומתוחזק בימים 4 הראשונים של ex-vivo תרבות, לדחות בהדרגה לאחר 5-7 ימי טיפול עם VPA (איור 2C). עם זאת, ירידה זו הוא הפוך מתואם עם עלייה המספר המוחלט של HSCs.
חשוב, העלייה המהירה באחוזים של HSCs נצפתה בתרבויות VPA מטופלים הוא הרכישה של פנוטיפ CD90. CD34+ התאים לבטא את CD90 פנוטיפי מרקר מגיע כמעט 40% – 45% של תאים מורחבת ב- ex-vivo תרבויות שטופלו ציטוקין קוקטייל של VPA במשך 4 ימים (איור 2C,יח). הרכישה של פנוטיפ CD90 הוא יותר מאושרות על ידי ex-vivo התרחבות CD34 נקיים במיוחד+ תאים הביטוי הזה-חוסר של סמן CD90. בתוך 24 שעות של טיפול VPA, כמעט-75% לשעבר vivo מורחבת תאים בתרבויות יזם עם CD34 ממוינים+CD90 תאים– אקספרס CD90 לעומת 0% של התאים בתרבויות המכיל את ציטוקין קוקטייל לבד (2E איור). חשוב, פנוטיפ CD90 נשמר מאוד במהלך הימים הראשונים 4 ב- ex-vivo תרבויות שטופלו VPA (2E איור).
איור 1: מצגת סכמטי של ex-vivo התרחבות תרבות. לטהר CD34+ תאים UCBs מתאים 16 h ב- ex-vivo תרבות עם שילוב של ציטוקינים המצוין. תרבויות מטופלים עם VPA (1 מ מ) עבור 7 ימים נוספים. Ex-vivo תאים המורחב עשויים ואז להיות מושתלים לתוך myoablated NSG עכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: טיפול VPA מפעיל על רכישת CD90 והתוצאה היא ההרחבה של מספר רב של HSCs. (א) מוחלטת מספר התאים הכולל nucleated קיימא מורחבת ב- ex-vivo תרבויות9. לטהר CD34+ תאים מחלון UCBs המתוארות בסעיף 3 שטופלו ציטוקין קוקטייל לבד או שילוב של ציטוקין קוקטייל, VPA כמתואר בסעיף 4 נספרו על ידי צביעת יודיד כתום/propidium acridine (n = 16). המספרים מציינים ימי טיפול עם VPA, ואילו PC מציין את CD34 מחציתה ראשי+ תאים מבודדים מן UCBs. (ב, ג) המספר המוחלט ואת אחוז CD34+CD90+ תאים מורחבת לכל אורך 7 ימים ב- ex-vivo תרבויות מטופלים עם קוקטייל ציטוקין לבד או בשילוב של ציטוקין קוקטייל, VPA (n = 21). אחוז CD34+CD90+ תאים נקבעת על-ידי ניתוח cytometry זרימה של תאים צבעונית כמתואר בסעיף 4. (די) ניתוח פנוטיפי של CD34 ממוינים+ תאים מן UCBs (שלב 5.3) התרחב ב- ex-vivo תרבויות מטופלים כמצוין במשך 4 ימים. פאנל שמאלי מציין את האסטרטגיה חסימה באמצעות isotype מכתים ואילו הלוחות האחרים המציין מוכתם תאים מורחבת בתרבויות ציטוקין קוקטייל לבד או בשילוב של ציטוקין קוקטייל עם VPA הכוללת. המספרים מציינים את אחוז CD34–CD90+ תאים, CD34+CD90– והתאים CD34+CD90+ תאים. (E) אחוז של CD34+CD90+ תאים מורחבת בתרבויות יזם עם מיון CD34+CD90– תאים מן UBCs, מטופלים עם קוקטייל ציטוקין לבד או בשילוב של ציטוקין קוקטייל, VPA עבור ימים שצוין. אחוז נקבעת על-ידי ניתוח cytometry זרימה (n = 4). N: מספר משכפל ביולוגי. קווי שגיאה עם SEM; p ≤ 0.0001 כפי שנקבע על ידי מודלים בינומית שלילית עבור A ו- B, מודלים בטא ו 2-way ANOVA עבור לוח אי לוחות A-C E ו- D שונו אבא ואח9אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול במהירות להרחיב במידה משמעותית את מספר HSCs האנושי פונקציונלי של UCBs. לימודי טייס קינטי באמצעות פרוטוקול זה מצביעים על כך ex-vivo תאים מורחבת מיד להשיג ולשמר את הביטוי של מספר HSC פנוטיפי סמני כולל CD90, כמו גם HSC פרימיטיביים מאפיינים מטבולית9.
Ex-vivo הרחבה פרוטוקול זה יחסית פשוטה ואמינה. טיהור של CD34+ תאים עם המכשיר מפריד תא (ראה טבלה של חומרים) הוא מאוד מהיר, הדירים ומאפשר להחלמה מהירה של תאים מבודדים. שיטה זו יוצרת תשואה גבוהה CD34 מטוהרים+ תאים (> 90%) בניגוד immunomagnetic ידנית ההפרדה. יתר על כן, זה ex-vivo הרחבה הפרוטוקול אינו דורש מיוחדים ומורכבים מכשירים או מערכות התרבות ניזונים-אצווה צריך אספקה רציפה של כמויות גדולות של מדיה טרי בתוספת ציטוקינים3,13. בהתאם לכך, שיטה זו מגבילה את העלויות. חשוב לציין, פרוטוקול זה מאפשר ההרחבה של הבריכה HSC תוך זמן קצר, אשר הוא גורם מגביל מפתח עבור תדירות זיהום.
מספר נקודות שיש לשקול להשגת פרימיטיביים HSCs מ CD34+ תאים באמצעות פרוטוקול זה. CD34+ תאים מורחבת ארבעה ימים בתרבויות שטופלו ציטוקין קוקטייל ולהוביל VPA לדור של מאגר של פרימיטיביים HSCs לטווח ארוך. HSCs אלה מאופיינים לא רק על ידי רמות ביטוי גבוהה CD34, CD90, CD49f, אלא גם על ידי פרופיל מטבולי מאוד פרימיטיבי, הנשענת בעיקר על גליקוליזה9. במהלך דגירה ממושכת יותר עם VPA במשך 7 ימים, תרבויות המורחב אולם הטרוגנית יותר ומכילים מספר רב יותר של שניהם לטווח ארוך, לטווח קצר וכן הבדיל תאים לעומת תאים מורחבת במשך 4 ימים. תוצאה זו נובעת בעיקר בתשישות של VPA תרבות ומספר גדל של חלוקות תאים9. לפיכך, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להשיג את ההרחבה של שתי בריכות שונות של תאים: תאים מורחבת 4 ימים ו- 7 ימים. הרחבת 7 ימים המוצר יכול לשמש עבור השתלת HSC allogeneic שבו נדרשת מהירה יותר engraftment multilineage באותה מידה כמו מתמשכת. פרוטוקול 4 ימים הרחבה עשוי להיות המתאימה ביותר עבור אסטרטגיות ההנדסה הגנטית מטרה ארוכת טווח תאים איכלוס. סביר גם כי זה שילוב של VPA ציטוקין קוקטייל ניתן להרחיב הבריכה של HSCs מ- CD34+ תאים באותה המידה או גבוה יותר בעת שימוש המדיה מלבד המדיה (ראה טבלה של חומרים) בשימוש בפרוטוקול זה.
הנוכחי ג'ין עריכת נהלים הקשורים לאובדן משמעותי של HSCs, אשר להגביל יישום קליני שלהם. המספר הגדול של פרימיטיביים HSCs מושגת תוך 2-4 ימים הטיפול VPA ex-vivo התרבויות יש פוטנציאל להתגבר על האובדן במספרים HSC. לפיכך, פרוטוקול זה עשוי להיות מועיל עבור שיפור הגן הקיים עריכת פרוטוקולים ולאפשר תיקון של מוטציות גנטיות HSC טיפולים מבוססי השתלת β-תלסמיה ואנמיה חרמשית. יתר על כן, ניתן להחיל אותה כדי לשמור על המספרים הנהדרים של HSCs במהלך ג'ין מניפולציות ללימודי התמקדו הבהרה של ג'ין פונקציות ב- HSCs וב -hematopoiesis.
לסיכום, השיטה המתוארת כאן יכול לשמש עבור ex-vivo הרחבה של בני אנוש והן מאתר HSCs, ניתן להתאימו קליניים יישומים ספציפיים כמו גם על מגוון רחב של חקירות במחקר בסיסי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NYSTEM להעניק C030136 ר. ה ברצוננו להודות עדינה מלול ג'ובלנסקי שלו משוב ובחינה של כתב היד
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expansion Media | Sigma-Aldrich | Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML | |
| AO/PI (acridine orange/propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. | Nexcelom | CS2-0106-25mL | |
| APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 | BD BIOSCIENCE | 555824 | |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 | BD BIOSCIENCE | 555751 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| BD Falcon 15 mL Tube | BD Biosciences | 352097 | |
| BD Falcon 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352063 | |
| BD Falcon 50 mL Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Bovine serum albumine solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-046-703 | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cell analyzer and sorter | BD Biosciences | FACS Aria II | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter | |
| Cell separator device | autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec | ||
| Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-PD100-002 | |
| Density gradient media | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 | BIOLEGEND | 328108 | |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | BIOLEGEND | 400109 | |
| Inverted microscope | |||
| PBS | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 308FKN | |
| Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) | R&D Systems | 203-IL | |
| Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC | |
| Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) | R&D Systems | 288-TP | |
| Total Antibody Compensation Bead Kit | thermofisher | A10497 | |
| Umbilical Cord-blood | Placental Blood Program at the New York Blood Center | http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/ | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | P4543 |
References
- Broxmeyer, H. E. Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation. Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
- Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D'Souza, S., Hoffman, R. Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells. Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).
- Wagner, J. E. Jr, et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).
- Peled, T., et al. Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment. Experimental Hematology. 40 (4), 342-355.e1 (2012).
- Nikiforow, S., Ritz, J. Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants? Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).
- Mehta, R. S., et al. Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials. Frontiers in Medicine. 2, 89 (2015).
- Papa, L., et al. Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation. Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. , In press (2019).
- Genovese, P., et al. Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells. Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).
- Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
- Fares, I., et al. EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells. Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).
