Summary

تقييم تكوين الأوعية العلاجية في نموذج مورين من نقص التروية الخلفية

Published: June 08, 2019
doi:

Summary

هنا، يتم تقديم نموذج تجريبي نقص التروية الخلفية الحرجة تليها بطارية من الاختبارات الوظيفية والأنسجة والجزيئية لتقييم فعالية العلاجات الوعائية.

Abstract

نقص تروية الأطراف الحرجة (CLI) هو حالة خطيرة تنطوي على مخاطر عالية من بتر الأطراف السفلية. على الرغم من إعادة الأوعية الدموية كونها العلاج الذهب القياسية، وعدد كبير من المرضى CLI ليست مناسبة لإعادة الأوعية الدموية الجراحية أو داخل الأوعية الدموية. تظهر العلاجات الوعائية كخيار لهؤلاء المرضى ولكنلا حاليا قيد التحقيق. قبل التطبيق في البشر، يجب اختبار هذه العلاجات في النماذج الحيوانية ويجب أن تكون آلياتها مفهومة بوضوح. وقد تم تطوير نموذج حيواني من نقص التروية الخلفية (HLI) عن طريق ربط وختان الشرايين والأوردة الحرقفية الخارجية البعيدة في الفئران. تم تجميع فريق شامل من الاختبارات لتقييم آثار نقص التروية والعلاجات الوعائية المفترضة على المستويات الوظيفية والأنسجة والجزيئية. تم استخدام دوبلر الليزر لقياس التدفق والتقييم الوظيفي للتسريب. تم تقييم استجابة الأنسجة من خلال تحليل الكثافة الشعرية بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة CD31 على المقاطع النسيجية من العضلات المعدية وعن طريق قياس كثافة الأوعية الجانبية بعد diaphonization. تم تحديد التعبير عن الجينات الوعائية من قبل RT-PCR التي تستهدف عوامل وعائية مختارة حصرا في الخلايا البطانية (ECs) بعد التقاط الليزر microdissection من العضلات الجهاز الهضمي الفئران. وكانت هذه الأساليب حساسة في تحديد الاختلافات بين الأطراف الإقفارية وغير الإقفارية وبين الأطراف المعالجة والأطراف غير المعالجة. ويوفر هذا البروتوكول نموذجاً للنسخ من CLI وإطاراً لاختبار العلاجات الوعائية.

Introduction

يؤثر مرض الشرايين المحيطية (PAD) في الغالب على الأطراف السفلية. يحدث مرض التصلب المتعدد بسبب تصلب الشرايين، وهو انسداد في الشريان يمكن أن يسبب تقييدًا شديدًا لتدفق الدم في الأطراف السفلية1. العرج المتقطع هو أول مظهر من مظاهر PAD ويشير إلى ألم العضلات عند المشي. CLI هي المرحلة الأكثر شدة من PAD، ويجري تشخيصها في المرضى التي تظهر آلام الراحة الإقفارية، والقرحة أو الغرغرينا2. المرضى الذين يعانون من CLI لديهم خطر كبير من بتر، وخاصة إذا لم يعالج3. إعادة الأوعية الدموية في الأطراف السفلية (إما عن طريق الجراحة المفتوحة أو إجراء داخل الأوعية الدموية) هي حاليا الطريقة الوحيدة لتحقيق إنقاذ الأطراف. ومع ذلك، فإن حوالي 30٪ من مرضى CLI غير مناسبين لهذه الإجراءات، لأسباب تشمل موقع الآفات، ونمط انسداد الشرايين والاعتلال المشترك واسعة النطاق4،5. لذلك، هناك حاجة إلى علاجات جديدة لهؤلاء المرضى الذين لا يمكن علاجهم، مع تعزيز تكوين الأوعية الدموية هي الاستراتيجية تحت تحقيق أكثر كثافة.

قبل الاختبار في البشر، يجب النظر في فعالية وسلامة العلاجات الجديدة في الجسم الحي في النماذج الحيوانية. وقد وضعت عدة نماذج لدراسة CLI, في الغالب عن طريق تحفيز نقص التروية الخلفية (HLI) في الفئران6,7,8,9,10. ومع ذلك، فإن هذه النماذج تختلف في عدة جوانب بما في ذلك طبيعة الشرايين التي يتم ربطها و / أو مقتطعة وما إذا كانت الأوردة والأعصاب المحيطة بها يتم تشريحها وكذلك6،7،8، 10. إذا ما أخذت هذه الجوانب مجتمعة، سوف تؤثر على شدة إصابة نقص التروية-التسريب في كل الحيوان، مما يجعل من الصعب مقارنة النتائج. ولذلك، من الأهمية بمكان وضع بروتوكول فعال ينبغي فيه توحيد إجراء الحث على نقص التروية وتقييم مختلف الأهداف لتقييم ما إذا كان العلاج الوعائي المعطى سيكون فعالاً. ومن شأن بروتوكول تجريبي مصمم لتغطية جميع هذه الجوانب أن يوفر فهما شاملا للآليات التي تمارس بها العلاجات الوعائية آثارها ومقياسا لفعاليتها في كل من نتائجها. عملين متميزين نشرمؤخرا من قبل فريقنا هي مثال جيد11،12، التي تم فيها تقييم نهج مختلفة للحث على تكوين الأوعية العلاجية باستخدام نفس البروتوكول الذي سيتم وصفه بمزيد من التفصيل في هذا البروتوكول.

الهدف العام لهذا البروتوكول هو وصف نموذج تجريبي قابل للاستنساخ يمكن أن يحاكي آثار CLI ويضع الأساس التجريبي لتقييم شامل للآثار الوظيفية والأنسجة والجزيئية للأوعية المفترضة وكلاء.

Protocol

جميع الإجراءات الحيوانية تتفق مع التوجيه 2010/63/EU وقد تمت الموافقة عليها من قبل الهيئة المؤسسية لرعاية الحيوان ومرخصة من قبل DGAV، الهيئة البرتغالية المختصة لحماية الحيوان (رقم الترخيص 023861/2013) تحذير: العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في البروتوكولات سامة وضارة. يرجى استخد?…

Representative Results

باستخدام البروتوكول الموصوف، تم اختبار الخلايا الجذعية mesenchymal الحبل السري والإشعاع المؤين جرعة منخفضة (LDIR) كعلاجات الأوعية المفترضة 11،12. تم الحصول على قراءات التسريب دوبلر الليزر قبل الحث نقص التروية وفي نقاط زمنية محددة مسبقا تتراوح من مباشرة بعد الحث نق?…

Discussion

وقد تألفت نماذج Murine من CLI في الغالب في ربط الشريان الفخذي فقط القاصي إلى أصل profunda femoris 4,5,6,7,8,9. وقد تبين أن هذا ترك معظم الدورة الدموية الجانبية سليمة، مما يعيد تدفق الدم …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونشكر خوسيه رينو وتانيا كارفالهو، رئيسي مرفق التصوير البيولوجي ومختبر علم الأنسجة وعلم الأمراض المقارنة التابع لمعهد الطب الجزيئي جواو لوبو أنتونس، على التوالي. ونشكر أيضا فياتشيسلاف سوشيك من قسم التشريح في كلية نوفا الطبية/فاكولادي دي سيانسياس ميديكاس، جامعة نوفا دي ليسبوا.

مرجع التمويل: مشروع ممول من UID/IC/0306/2016 Fundação para a Ciência e a Tecnologia. وتدعم بولا دي أوليفيرا زمالة (SFRH/BD/80483/2011) من مؤسسة المأكولات الخاصة.

Materials

7500 Fast Real-Time PCR Applied Biosystems Instrument
Acetone Merk 1000141000 Reagent; Caution – highly flammable
Adenosine Valdepharm Reagent
Atipamezole OrionPharma Reagent
Barium sulphate (Micropaque) Guebert 8671404 (ref. Infarmed) Reagent
Buprenorphine RichterPharma Reagent
Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope Carl Zeiss Microscopy, Germany Instrument
cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit Qiagen 7335730 Reagent
Cryostat Leica CM Leica Microsystems 3050S Instrument
DAB peroxidase substrate kit DAKO;Vector Laboratories K3468 Reagent
hydrogen peroxidase Merk 1072090250 Reagent; Caution – nocif
hydrophobic pen Dako 411121 Reagent; Caution – toxic
Ketamidor Richterpharma CN:580393,7 630/01/12 Dfvf Reagent
Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK 5710 Instrument
Leica DM2500 upright brightfield microscope Leica Microsystems Instrument
Medetor Virbac 037/01/07RFVPT Reagent
methanol VWR UN1230 Reagent; Caution – toxic and highly flammable
Papaverine Labesfal Reagent
Pentano Isso Merk 1060561000 Reagent; Caution – highly flammable
Power SYBR® Green Applied Biosystems 4309155 Reagent
Purified rat anti-mouse CD31 Pharmingen 550274 Reagent
RNeasy Micro kit Qiagen 74004 Reagent
Surgic-Pro 6.0 Medtronic (Coviden) VP733X Suture
VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) Vectastain ABC kit; Vector Laboratories PK-4004 Reagent
Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 Medtronic (Covidien) UL202/ UL101 Suture
Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System Carl Zeiss Microscopy, Germany 1023290916 Instrument
Stereotaxic microscope Carl Zeiss Microscopy, Germany Instrument
Digital camera Linux Instrument

References

  1. Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
  2. Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
  3. Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
  4. Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
  5. Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
  6. Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
  7. Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
  8. Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
  9. Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
  10. Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
  11. Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
  12. Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
  13. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).

Play Video

Cite This Article
Ministro, A., de Oliveira, P., Nunes, R. J., dos Santos Rocha, A., Ferreira, T., Goyri-O’Neill, J., Rosa Santos, S. C. Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (148), e59582, doi:10.3791/59582 (2019).

View Video