评估下肢缺血的Murine模型的治疗血管生成
Summary
在这里,提出了一个关键的后肢缺血实验模型,然后进行一组功能、遗传和分子测试,以评估血管生成疗法的有效性。
Abstract
严重肢体缺血 (CLI) 是一种严重疾病,具有下肢截肢的高风险。尽管再血管化是黄金标准治疗,相当多的CLI患者不适合手术或血管内再血管化。血管生成疗法正在成为这些患者的一种选择,但目前仍在调查中。在人类应用之前,必须在动物模型中测试这些疗法,并且必须清楚地了解其机制。通过小鼠的远端外丝和股骨动脉和静脉的结扎和切除,建立了一种后肢缺血(HLI)的动物模型。组织了一个全面的测试小组,以评估缺血和假定血管生成疗法在功能、遗传和分子水平上的影响。激光多普勒用于灌注的流量测量和功能评估。通过分析胃肠肌组织学部分的抗CD31抗体染色后毛细血管密度,以及经透析后对附属血管密度的测量,对组织反应进行了评价。在激光捕获小鼠胃内神经肌肉的微分法后,RT-PCR对内皮细胞(ECs)中选定的血管生成因子进行了定量的表达。这些方法在识别缺血性和非缺血性四肢以及治疗肢体与未治疗四肢之间的差异方面非常敏感。该协议提供了可重复的CLI模型和测试血管生成疗法的框架。
Introduction
外周动脉疾病(PAD)主要影响下肢。PAD是由动脉粥样硬化引起的,动脉阻塞,可严重限制下肢的血流1。间歇性跛行是PAD的第一表现,是指行走时的肌肉疼痛。CLI是PAD最严重的阶段,被诊断在患者中显示缺血性休息疼痛,溃疡或坏疽2。CLI患者有截肢的高风险,特别是如果未经治疗3。下肢再血管化(通过开动手术或血管内手术)是目前实现肢体抢救的唯一途径。然而,大约30%的CLI患者不适合这些程序,原因包括病变的位置,动脉闭塞模式和广泛的合并症4,5。因此,对于这些无法治疗的患者,需要新的疗法,促进血管生成是更紧张的调查策略。
在人体试验之前,必须在动物模型中考虑体内新疗法的有效性和安全性。为了研究CLI,已经开发出几种模型,主要是在小鼠6、7、8、9、10中诱导后肢缺血(HLI)。然而,这些模型在几个方面有所不同,包括被连接和/或切除的动脉的性质,以及周围的静脉和神经是否被解剖以及6,7,8, 9,10.综合起来,这些方面会影响每个动物缺血再灌注损伤的严重程度,使结果难以比较。因此,必须制定有效的方案,使诱发缺血的程序和不同靶点的评估标准化,以评估给定血管生成疗法是否有效。旨在涵盖所有这些方面的实验协议将全面了解血管生成疗法发挥作用的机制,并衡量其每次结果的疗效。我们的团队最近发表的两篇不同作品是一个很好的例子11,12,其中用相同的方案评估诱导治疗性血管生成的不同方法,这将在本部分更详细地描述协议。
该协议的总体目标是描述一个可重复的实验模型,可以模仿CLI的效果,并为综合评估假定血管生成的功能、遗传和分子效应奠定实验基础代理。
Protocol
Representative Results
Discussion
CLI的Murine模型主要包括股动脉的结扎,只是远至4,5,6,7,8,9的起源。 这表明,保持大部分的附属循环完好无损,恢复血液流动到肢体在7天9。 通过切除股动脉,可以去除辅助床。然而,由于大多数辅助血管来自内血管7,因此在手术后7天内,可…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们分别感谢何塞·里诺和塔尼亚·卡瓦略,生物成像设施以及分子若昂·洛博·安图内斯研究所组织学和比较病理学实验室的负责人。我们还感谢来自新利波亚大学新医学院解剖学系的维亚切斯拉夫·苏什奇克。
供资参考:由UID/IC/0306/2016基金会资助的项目。保拉·德奥利维拉得到国家基金会(SFRH/BD/80483/2011)的研究金(SFRH/BD/80483/2011)的支持。
Materials
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution – nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution – toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution – toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
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