Summary
在这里,提出了一个关键的后肢缺血实验模型,然后进行一组功能、遗传和分子测试,以评估血管生成疗法的有效性。
Abstract
严重肢体缺血 (CLI) 是一种严重疾病,具有下肢截肢的高风险。尽管再血管化是黄金标准治疗,相当多的CLI患者不适合手术或血管内再血管化。血管生成疗法正在成为这些患者的一种选择,但目前仍在调查中。在人类应用之前,必须在动物模型中测试这些疗法,并且必须清楚地了解其机制。通过小鼠的远端外丝和股骨动脉和静脉的结扎和切除,建立了一种后肢缺血(HLI)的动物模型。组织了一个全面的测试小组,以评估缺血和假定血管生成疗法在功能、遗传和分子水平上的影响。激光多普勒用于灌注的流量测量和功能评估。通过分析胃肠肌组织学部分的抗CD31抗体染色后毛细血管密度,以及经透析后对附属血管密度的测量,对组织反应进行了评价。在激光捕获小鼠胃内神经肌肉的微分法后,RT-PCR对内皮细胞(ECs)中选定的血管生成因子进行了定量的表达。这些方法在识别缺血性和非缺血性四肢以及治疗肢体与未治疗四肢之间的差异方面非常敏感。该协议提供了可重复的CLI模型和测试血管生成疗法的框架。
Introduction
外周动脉疾病(PAD)主要影响下肢。PAD是由动脉粥样硬化引起的,动脉阻塞,可严重限制下肢的血流1。间歇性跛行是PAD的第一表现,是指行走时的肌肉疼痛。CLI是PAD最严重的阶段,被诊断在患者中显示缺血性休息疼痛,溃疡或坏疽2。CLI患者有截肢的高风险,特别是如果未经治疗3。下肢再血管化(通过开动手术或血管内手术)是目前实现肢体抢救的唯一途径。然而,大约30%的CLI患者不适合这些程序,原因包括病变的位置,动脉闭塞模式和广泛的合并症4,5。因此,对于这些无法治疗的患者,需要新的疗法,促进血管生成是更紧张的调查策略。
在人体试验之前,必须在动物模型中考虑体内新疗法的有效性和安全性。为了研究CLI,已经开发出几种模型,主要是在小鼠6、7、8、9、10中诱导后肢缺血(HLI)。然而,这些模型在几个方面有所不同,包括被连接和/或切除的动脉的性质,以及周围的静脉和神经是否被解剖以及6,7,8, 9,10.综合起来,这些方面会影响每个动物缺血再灌注损伤的严重程度,使结果难以比较。因此,必须制定有效的方案,使诱发缺血的程序和不同靶点的评估标准化,以评估给定血管生成疗法是否有效。旨在涵盖所有这些方面的实验协议将全面了解血管生成疗法发挥作用的机制,并衡量其每次结果的疗效。我们的团队最近发表的两篇不同作品是一个很好的例子11,12,其中用相同的方案评估诱导治疗性血管生成的不同方法,这将在本部分更详细地描述协议。
该协议的总体目标是描述一个可重复的实验模型,可以模仿CLI的效果,并为综合评估假定血管生成的功能、遗传和分子效应奠定实验基础代理。
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Protocol
所有动物程序均符合指令 2010/63/EU,并已获得机构动物福利机构的批准,并由葡萄牙动物保护主管当局 DGAV 许可(许可证号 023861/2013)
注意:协议中使用的几种化学品有毒有害。请使用所有适当的安全操作和个人防护设备(手套、实验室外套、全长裤子和闭趾鞋)
1. 后肢缺血的鼠模型
注:所有实验均对22周大的C57BL/6雌性小鼠进行。
- 准备解决方案
-
麻醉液的制备
注意:这种麻醉组合(麦地替胺和氯胺酮)提供长达30分钟的固定和15分钟的手术窗口。通过给药剂的管理和,可以恢复这种效果。- 使用干净的 1cc 注射器,提取 1 mL 的麦地胺(1 mg/kg 体重),消除气泡以进行精确测量,并将其添加到 15 mL 猎鹰管中。
- 使用干净的 1 cc 注射器,提取 0.75 mL 的氯胺酮(75 mg/kg 体重),消除气泡以进行精确测量,并将其添加到含有麦地胺的 15 mL 猎鹰管中。
- 加入8.25 mL无菌盐水(0.9%NaCl),以获得10 mL的麻醉溶液。
- 用化合物的名称、混合日期和到期日期识别管子。
- 在黑暗中储存在4°C。
-
制备抗镇静剂溶液
- 使用干净的 1 cc 注射器,提取 1 mL 的阿提帕美酮(5 mg/kg 体重),消除气泡以进行精确测量,并将其添加到 15 mL 猎鹰管中。
- 加入9 mL无菌盐水(0.9%NaCl),以获得10 mL的还原溶液。
- 用化合物的名称、混合日期和到期日期识别管子。
- 在黑暗中储存在4°C。
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术后麻醉液的制备
- 使用干净的 1 cc 注射器,提取 0.5 mL 的丁丙诺啡(100 μL/15-30 g 体重),消除气泡以进行精确测量,并将其添加到 15 mL 猎鹰管中。
- 加入9.5 mL无菌盐水(0.9%NaCl),以获得10 mL的麻醉液溶液。
- 用化合物的名称、混合日期和到期日期识别管子。
- 在黑暗中储存在4°C。
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麻醉液的制备
- 后肢缺血的手术诱导
- 这种干预所需的手术工具:尖钳、弹簧剪刀、眼科针架、手术剪刀和针架。使用前在高压灭菌器中消毒所有手术工具。使用棉签解剖皮下脂肪。
- 在握住鼠标之前,用麻醉液装入注射器。
- 通过在笼子的网格上用力在耳朵后面抑制动物,保持尽可能多的皮肤,以保持老鼠不动。
- 保持动物倾斜,降低头部,并进行麻醉溶液的腹内注射,使注射器与小鼠的身体保持45°角。
- 检查没有踏板退退反射,以评估麻醉的深度。
- 使用电动护头从右后肢取下头发。使用氯西丁消毒皂擦洗进行皮肤制备。用干净的纸巾把纸巾除掉。在将小鼠运送到手术无菌套件之前,应用氯西丁手术磨砂,用无菌窗帘保护皮肤区域。
- 将动物放在背鳍下,用四肢分开并用胶带固定。
注意:在加热垫上执行程序,以保持动物的体温稳定;手术使用解剖显微镜以10倍或20倍放大。 - 使用无菌纱布应用氯西丁防腐剂,完成皮肤制备。使用编号 11 手术手术刀刀片执行 1 厘米皮肤切口覆盖右后肢的大腿。
- 模糊解剖皮下脂肪暴露神经血管束。使用尖钳、弹簧剪刀和眼科针架,打开膜状的 ilio-股体护套,露出远端外部的气囊和股体血管。
- 解剖血管(动脉和静脉)与神经分离。使用7.0不可吸收的聚丙烯缝合线可缝合远端外阴管动脉和静脉以及远端股动脉和静脉。
- 用弹簧剪刀将远端结和近缘结之间的骨质动脉和静脉段横断。
- 用可吸收缝合线关闭切口(例如,5.0 维丽尔缝合线)。
- 用抗镇静液装入注射器,并使用1.2.3和1.2.4中详述的相同方法进行抗镇静液的腹内注射。
- 术后监测
注:每15-20分钟仔细观察动物,确保所有动物从抗镇静剂中恢复良好;麻醉动物永远不会无人看管。- 评估麻醉的恢复:1) 监测呼吸的速度和深度;2) 评估动物反射(踏板和眼睛位置)
- 每8-12小时进行术后痛痛的皮下注射。
- 每天监测动物手术后记录动物的健康状况和手术部位外观的简要描述,确保所有缝合线都关闭。
- 如果发生去功能,则重新缝合切口。如果不成功,在切口上涂上皮肤屏障膜,以防止尿液、粪便排泄物、摩擦和皮肤剪切,并帮助愈合过程。
2. 血管生成效应的评估
注:缺血诱导后,在研究中应用治疗剂,实现以下程序。在其他时间点采取的步骤详见相应章节。
- 激光多普勒灌注成像
- 在分析前一天,使用电动护刀,然后用脱毛霜去除两个后肢的头发。
- 使用麻醉液麻醉小鼠。
- 将动物放在 37°C 加热垫上 5 分钟,以确保在手术过程中温度不会发生变化
- 将动物置于上肢位置,将双腿固定在延长的位置。测量每个动物的右腿和左腿和脚之间的距离,因为只要必须重复手术,以便跟踪后肢灌注随时间的变化,动物的定位应该相似。
- 使用激光多普勒灌注成像仪开始获取数据。
- 采集完成后,用抗镇静液恢复麻醉。
- 打开图像分析软件,并绘制围绕缺血性后肢的感兴趣区域 (ROI)和围绕非缺血性后肢的可比 ROI。
- 观察通量值,并确定灌注与缺血肢体灌注与非缺血肢体的灌注比例。灌注比的变化是随时间测量的。
- 免疫性化学和毛细管密度分析
- 麻醉后,因宫颈脱位而牺牲小鼠。
- 要收获双腿的胃肠肌肉,首先,从两个后肢上去除皮肤。
- 识别跟腱,并使用 11 刀片手术刀将肌腱与骨骼分离。
- 抓住跟腱,用弹簧剪刀将肌肉从肌腱和腓骨分离到膝盖关节。
- 将二头肌与胃肠肌分开。
- 使用弹簧剪刀在膝关节水平上切开胃肠肌肉的插入。
- 将收获的胃肠肌肉呈横向方向放在一个小软木盘上,借助 10% 的 tragacanth。
- 将试样冷冻在液氮冷却的开苯可丹中,并将其储存在-80°C,直到切片。
- 在低温上切割 7 μm 的肌肉标本部分,然后安装在玻璃滑片上。
注: 可以在此处暂停该协议。 - 将玻璃玻片固定在含有冷却纯丙酮(约 50 mL)的瓶子中 10 分钟,温度为 -20°C。
- 在室温下加入稀释在甲醇(50 mL)中的0.3%的过氧化氢酶30分钟。
- 在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (50 mL) 中洗两次,共 10 分钟。
- 在各部分周围使用疏水笔。
注:使用疏水笔可以减少在协议期间花费的溶液量。对于所有孵育,每个部分使用100μL的所有溶液。 - 在室温下,在PBS中施用5%兔血清的阻断溶液30分钟。
- 在室温下用抗CD31大鼠单克隆抗体在PBS中1%的牛血清白蛋白(BSA)中稀释1:500,孵育标本1小时。
- 在 PBS 中洗涤三次,共 30 分钟。
- 在PBS中加入1:200的二次生物酸酯兔抗鼠IgG抗体,在PBS中加入1%BSA,在室温下加入5%兔血清30分钟。
- 像以前那样在PBS中清洗,并在室温下加入标有avidin-结合的过氧化物酶复合物30分钟。
- 在 PBS 中冲洗 3 次 5 分钟,再加入二氨基苯甲酸 (DAB) 过氧化物酶基质套件 5 分钟。
- 在安装前,用血氧林对截面进行 10 s 的抗污。
- 使用直立的明场显微镜(即每个肌细胞数量的每片毛细血管数)测量毛细血管密度,每个标本中4个不同解剖区域的2个不同部分。
- 对比剂灌注
- 使用麻醉液麻醉小鼠。
- 使用数字 15 手术刀进行中位腹腔切除术。
- 露出腹部主尾塔和牛尾酒卡瓦,横向缩回小肠后,使用春季剪刀。
- 将一个26号导管颅插入腹部主塔,另一个插入同一方向的牛肉卡瓦。
- 使用 5/0 丝质缝合线将导管固定到位,以执行留线缝合。
- 使用含有肝素(500单位/100 mL)的37°C盐水溶液清洗血管系统,使用10 mL注射器推入腹部主盘。继续温和的灌注,直到从放在果子酱卡瓦内的导管中看到清晰的溶液。
注:通常需要30至40 mL的肝化盐水溶液冲洗成年大鼠的血管系统。 - 施用腺苷(1毫克/升)和木瓜林(4毫克/升)的混合物2分钟。
- 将50%硫酸铵和5%明胶的混合物注射到主动脉导管10 mL。
注:溶液必须保持在60°C,以避免增稠。 - 将小鼠留在 - 4°C 至少 4 小时,以使血管铸造凝固。
- 从每只鼠标的下半身取下皮肤。
- 直径 - 斯帕特霍尔茨技术
- 将小鼠浸入 10% 甲醛溶液中,至少 72 小时。
- 将小鼠浸入30%过氧化氢溶液中,24小时。
- 使用冷冻替代技术使小鼠脱水。该方法包括将小鼠提交到连续的纯丙酮段落(平均四个)在-20°C,每次24小时。
- 将小鼠浸入含有100%苯甲酸酯和100%甲基水杨酸盐混合物的溶液中,比例为3:5(这种混合物也称为Spalteholz溶液)13。
- 将小鼠浸入Spalteholz溶液中,进入真空室,直到其变幻,通常需要5至7天。
- 如果溶液在试样变清之前变暗,请更换溶液。
- 附带容器量化
- 使用立体显微镜观察悬浮在透射下Spalteholz溶液中的小鼠。使用显微手术钳轻轻抓住并移动它。
- 使用连接到显微镜的数码相机拍摄整个四肢。
- 使用适当的软件获取整个肢体照片。
- 使用适当的软件突出显示辅助容器,从而对辅助容器进行手动分割。
注:附带容器根据朗兰的定义定义,定义茎、中区和再进入,直径在20至300微米之间,不包括股骨、沙毛和浮游动脉以及所有静脉结构。 - 在加法器、手术闭塞周围和下方的同一解剖区域中定义每只小鼠的 ROIs。
- 以相当于肢体总面积 20% 的等效 ROI 量化附带血管密度 (CVD)。CVD 计算为血管区域和 ROIs 区域之间的比率。所有密度测量均使用 ImageJ 软件执行。
注:假定每只小鼠的非缺血肢体的CVD值对应于100%,以排除解剖、灌注或发声过程中的变化。因此,缺血肢体的CVD百分比是相对于非缺血肢体计算的。 - 确定心血管疾病的百分比增加作为缺血性和非缺血性肢体之间的CVD百分比之间的差异。
- 激光捕获毛细血管的微分法
- 麻醉后,因宫颈脱位而牺牲小鼠。
- 要收获双腿的胃肠肌肉,请从小鼠的后肢上去除皮肤。
- 识别跟腱,并使用 11 刀片手术刀将肌腱与骨骼分离。
- 抓住跟腱,用弹簧剪刀将肌肉从肌腱和腓骨分离到膝盖关节。
- 将二头肌与胃肠肌分开。
- 使用弹簧剪刀在膝关节水平上切开胃肠肌肉的插入。
- 在10%的木塞甘斯的帮助下,将收获的胃肠肌在一个小软木盘上呈横向方向。
- 将试样冷冻在液氮冷却的开苯可丹中,并将其储存在-80°C,直到切片。
- 切割肌肉标本的12 μm部分,并安装在玻璃滑片上。
注:对于RNA保护,请用预冷却的幻灯片,用手指(手套)触摸幻灯片背面,仅加热放置部分的区域。与加热区域接触,在-20°C下在低温中干燥2-3分钟,从冷冻刀中转移部分。可以在此处暂停该协议。- 将玻璃玻片固定在装有冷却纯丙酮(约 50 mL)的瓶子中,在 -20°C 下固定 5 分钟,然后将其晾干。
- 在各部分周围使用疏水笔。
注:使用疏水笔有助于减少协议期间花费的溶液量。对于所有孵育,每个部分使用100μL的所有溶液。 - 在4°C下用2M NaCl/PBS补充水分,在4°C下用抗CD31大鼠单克隆抗体在2M NaCl/PBS中1:500孵育标本过夜。
- 在 2M NaCl/PBS 中洗涤两次,共 6 分钟。
- 在2M NaCl/PBS中加入亚生性兔抗鼠IgG抗体,在2M NaCl/PBS和5%兔血清中加入30分钟,在4°C下。
- 像以前那样在2M NaCl/PBS中清洗,并在4°C下加入标有avidin-结合的过氧化物酶复合物30分钟。
- 冲洗并添加 DAB 过氧化物酶基板套件 5 分钟。
- 用冰冷的90%乙醇脱水,然后加入100%乙醇,然后晾干。
- 使用激光微解剖系统,使用带有脉冲固态 355 nm 激光的激光,对每只小鼠进行 10000 个毛细血管的解剖,并将解剖毛细血管弹射到微熔管粘合盖中。
- RNA提取、cDNA合成、预扩增和RT-PCR
- 使用适当的试剂盒从微解剖毛细血管中分离总RNA,获得的总RNA在1.5-3纳克/μL之间。
- 使用表1中描述的引物,使用cDNA合成试剂盒进行合成和两轮预扩增。
- 对上一步中描述的相同目标执行 RT-PCR。使用由初始变性步骤组成的程序,在 95°C 下执行 10 分钟,随后在 95°C 下进行 50 次循环,15 秒,在 60°C 下运行 1 分钟。
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Representative Results
使用所述方案,脐带等位干细胞和低剂量电离辐射(LDIR)被测试为假定血管生成疗法11,12。 激光多普勒灌注读数是在缺血诱导之前和在预指定的时间点获得,从缺血诱导后立即到缺血后45天不等。激光多普勒的组织灌注读数被记录为彩色编码图像,没有灌注显示为深蓝色,最高灌注水平显示为红色。 如图2A和3A所示,图2B和3B中量化,在诱导后肢缺血后,所有小鼠立即观察到后肢灌注完全丧失,确保诱导后肢缺血技术的可重复性。重要的是,缺血的严重程度在所有动物中都是相似的。围绕缺血后肢绘制了 ROI,并在非缺血后肢周围绘制了类似的 ROI,以执行灌注的量化。灌注表示为缺血肢体灌注与非缺血肢体的灌注比例。灌注比的变化是随时间测量的。
免疫性化学在缺血后15至90天之间进行。在缺血后19天至90天和毛细血管微分道在缺血后45天至70天诱导期间进行发声,确保不同的亲血管生成疗法诱导持续和持久的原发性效应。
CD31阳性毛细血管在胃肠肌肉组织学部分的定量评估毛细血管密度,这表示为毛细血管的数量每数量的肌肉纤维。如图4所示,缺血性肢与非缺血性肢体的毛细管密度较大。
为了评估附带血管密度,小鼠被直径化,并选择了相当于肢体面积20%的同等ROI进行定量。缺血性肢体的附带血管密度持续增加,因此,与治疗和控制四肢相关的数据被表示为缺血肢体中辅助血管密度增加的百分比,相对而言是非缺血性肢体(图5)).
用CD31阳性细胞的定量RT-PCR对ECs的亲血管基因表达进行了分析。Vegfr2、Vegfr1、Fgf2、Angpt2、Pdgfc、Tgfb2、Hgf2和Met的脚本显示缺血性四肢和非缺血性肢体之间的表达有明显差异,仅限于暴露于亲血管性刺激的小鼠(图6)。
图 1:显示结扎部位的小鼠后肢血管解剖学的图解图。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:LDIR增加灌注恢复。在单侧HLI的手术诱导后,C57BL/6小鼠的后肢在连续几天内被假辐照或照射,每天分4部分0.3Gy,允许恢复。(A) 具有代表性的激光多普勒流图像在HLI前,并在第0(d0)和15(d15)后HLI感应。(B) 以ISC与NISC肢体之比表示的血流定量评估显示,辐照小鼠的肢体灌注在HLI后第15天(d15)和第45天(d45)时,与假辐照小鼠的肢体血液灌注显著增强。组间变化通过双向重复测量ANOVA进行评估,然后进行Bonferroni的专时测试(n = 每组12个小鼠)。显示均值 = SEM。 P < 0.001;ns,不重要。HLI,后肢缺血;ISC,缺血;NISC,非缺血;前HLI,后肢缺血之前。改编自11。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3: 脐带等位干细胞 (UCX)增加灌注恢复。UCX或其车辆(作为对照)在HLI诱导后5小时在缺血性胃内肌中施用。(A) 具有代表性的激光多普勒流图像之前(PRE-HLI),紧接(d0 POST-HLI)和HLI感应后7、14和21天(d7 POST-HLI,d14 POST-HLI,d21 POST-HLI)。(B) 以ISC与NISC肢体之比表示的血流定量评估显示,在HLI后7天、14天和21天,脐带等血干细胞治疗的小鼠的肢体血液灌注显著增强。(n=16 每个实验组;D7: t (22.69) = 4.26;P - 0.001;效果尺寸为 1.51,功率为 0.98;D14: t (30) = 4.7;P - 0.001;效果尺寸为 1.66,功率为 0.99;D21: t (30) = 7.22;P - 0.001;效果大小为 2.56 和功率 0.99)。HLI,后肢缺血;ISC,缺血;NISC,非缺血。改编自11。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:LDIR增加毛细管密度。(A) 在 HLI 后第 45 天,来自假辐照和辐照缺血性胃肠肌的代表性部分。CD31免疫组化学和血氧素分别鉴定了毛细血管和肌细胞。刻度条, 150 mm. (B) 定量分析显示,与 HLI 后第 15 天和第 45 天假辐照缺血性肌肉相比,辐照缺血性胃内肠肌肉的毛细血管密度(毛细血管/肌细胞)增加。混合方差分析,然后是Bonferroni的术后测试,采用ISC的受试者因素和天和辐照的受试者因素(每组n=6个小鼠)。显示个人数据和均值 = SEM。P<0.001;ns,不重要。ISC,缺血;NISC,非缺血。改编自11。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5:LDIR 增加抵押品密度。(A) 为假辐照和辐照小鼠选择的ROI的插图图像。在 HLI 后第 90 天显示 ISC 和 NISC 四肢。刻度条,300 mm . (B) 数据表示为 ISC 肢体的 CVD 增加相对于 NISC 的百分比。在 HLI 后第 15 天和第 90 天,辐照小鼠的 CVD 增加率显著较高(%)与假辐照小鼠。进行双向方差分析,然后进行Bonferroni的后特制测试,在天和照射的受试者因素之间进行(每组n=6个小鼠)。 显示个人数据和均值 = SEM。*P<0.05;P<0.001;ns,不重要。HLI,后肢缺血;ISC,缺血;NISC,非缺血。改编自11。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6:LDIR在从辐照缺血性胃肠肌分离的ECs中调节血管生成基因的表达。在单侧HLI的手术诱导后,C57BL/6小鼠的后肢在连续几天内被假辐照或照射,每天分4部分0.3Gy,允许恢复。在HLI后的第45天,在ECs上用qRT-PCR对亲血管生成因子及其受体的表达进行评估。胃肠肌部分被染色为CD31。使用激光微解剖系统对单个内皮CD31+细胞进行可视化、解剖和分离。每个条表示一个动物的相对基因表达。白色和灰色条分别代表假辐照和辐照小鼠。值被归一化为 18S 以获得相对的表达式级别。结果显示,缺血和非缺血性样本之间的对数2折变化表明辐照小鼠的转录本的相对丰度;相反,在假辐照小鼠中观察到一种向下调节。改编自11。请点击此处查看此图的较大版本。
| Vegfr1+F (5'-TTGAGGCTCTCACCACAACTCC-3'); |
| Vegfr1=R (5'-TATCTGGGGGGGCGGG-3'); |
| Vegfr2+F (5'-AGGCCCATTGACACACACACACA-3'); |
| Vegfr2+R (5'-AGACCATGTGGTTCTCC-3'); |
| Pdgf-c+F (5'-AGCCAGTCACAAACCACG-3'); |
| Pdgf-c+R (5'-AAGCAGTCACTGTGGGG-3'); |
| Met_F (5'-ACGTAATGCAATGTGGGGCCC-3'); |
| Met_R (5'-TTGCGTCGCTCTTTTT-3'); |
| Fgf2+F (5'-ACTATATATATGGGCCACT-3'); |
| Fgf2+R (5'-AACAGTATGCTCTCTCTCTCTCT-3'); |
| Tgfb2+F (5'-GCTTGGGGGCCTTTTTTTTT-3'); |
| Tgfb2=R (5'-CTCCACACAAGAGGTGT-3'); |
| Ang2[F '5'-ATACACAGAGAGAGAGAGG-3'); |
| Ang2=R (5'-AACTCATGCCCACT-3'); |
| Hgf+F (5'-GCATAAGGCCAAGAGAGAGGGTT-3'); |
| Hgf_R (5'-TCATGCGGGGGGGGA-3'); |
| 18s=F (5'-GCCCTATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATTTGGG-3'); |
| 18s=R (5'-CCGGAATCGACATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAT-3')。 |
表1:用于研究的引性。
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Discussion
CLI的Murine模型主要包括股动脉的结扎,只是远至4,5,6,7,8,9的起源。 这表明,保持大部分的附属循环完好无损,恢复血液流动到肢体在7天9。 通过切除股动脉,可以去除辅助床。然而,由于大多数辅助血管来自内血管7,因此在手术后7天内,可以恢复多达三分之一的原始血流。 Lejay等人提出了在普通iliac动脉上进行第二次结扎的连续结扎,有效地减少了内部iliac动脉4提供的附带灌注。该协议中的关键步骤不仅包括识别正上方韧带上方的外部牙动脉,还包括远端外管和股骨动脉和静脉的结扎和切除,这有一个双重目的:增加缺血的严重程度,以及提高模型的技术可重复性,因为单独暴露股动脉往往导致静脉撕裂。
这种技术的一个局限性是血流到肢体的急剧中断,这与动脉粥样硬化斑块的积累相关的长期过程不同,后者导致动脉狭窄和闭塞。尽管如此,血流量的减少在2周后出现,这是慢性缺血症诊断的既定时间点。此外,仅缺血性侮辱就增加了抵押,这模仿了慢性缺血性四肢观察到的附带形成过程。
缺血性四肢的新血管化涉及生物事件的复杂相互作用,即血管生成和动脉生成。该协议包括各种检测,评估假定血管生成疗法对血管生成发芽(毛细血管密度)和辅助血管发育(动脉生成)的干扰,这是人类耐受性中最重要的机制下肢缺血同时,激光多普勒用于揭示这些新或扩大的容器的功能,并且用于首次激光微分毛细管的收集EC,揭示功能恢复的基础的分子机制。该协议产生一个可重复的动物模型,可以模仿CLI的效果测试标准,当动物治疗与可能的血管生成疗法,可以应用在临床环境在未来。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们分别感谢何塞·里诺和塔尼亚·卡瓦略,生物成像设施以及分子若昂·洛博·安图内斯研究所组织学和比较病理学实验室的负责人。我们还感谢来自新利波亚大学新医学院解剖学系的维亚切斯拉夫·苏什奇克。
供资参考:由UID/IC/0306/2016基金会资助的项目。保拉·德奥利维拉得到国家基金会(SFRH/BD/80483/2011)的研究金(SFRH/BD/80483/2011)的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution - nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution - toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution - toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
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